中國美利奴羊PRLR基因外顯子10 SSCP多態(tài)性與部分繁殖性狀的關聯(lián)分析

吳洪賓,吳荷群,王遵寶,余鵬,趙宗勝,張文祥

(1石河子大學動物科技學院,石河子832003;2新疆兵團農(nóng)六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站,五家渠831300;3石河子大學生命科學學院,石河子832003)

中國美利奴羊PRLR基因外顯子10 SSCP多態(tài)性與部分繁殖性狀的關聯(lián)分析

吳洪賓1,吳荷群2,王遵寶1,余鵬3,趙宗勝1,張文祥1

(1石河子大學動物科技學院,石河子832003;2新疆兵團農(nóng)六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站,五家渠831300;3石河子大學生命科學學院,石河子832003)

以催乳素受體基因(PRLR)作為綿羊繁殖性狀的候選基因,運用PCR-SSCP方法對PRLR外顯子10的多態(tài)性進行檢測,并對其多態(tài)性與綿羊部分繁殖性狀進行了關聯(lián)分析。結(jié)果表明:在PRLR外顯子10的2個基因片段存在PCR-SSCP多態(tài),PRLR1擴增片段存在3種基因型,PRLR2擴增片段存在4種基因型;Hardy-Weinberg平衡檢驗顯示,中國美利奴羊群體在2個位點都處于平衡狀態(tài);CE和DD基因型中國美利奴羊產(chǎn)羔數(shù)均值比CD和DE型多0.31只(P＜0.05);AA基因型中國美利奴羊初生重均值比BB型重0.66 kg(P＜0.05);DE基因型中國美利奴羊3月齡重均值比CD型重2.42 kg(P＜0.05)。

綿羊;PRLR;繁殖性狀;PCR-SSCP

生產(chǎn)實踐表明,絕大多數(shù)綿羊?qū)偌竟?jié)性發(fā)情,其生產(chǎn)周期長,繁殖力低,極大地限制了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。家畜的繁殖性狀是受多基因控制、遺傳力低的數(shù)量性狀[1],采用常規(guī)的表型選育法提高綿羊繁殖力不僅耗時長,而且很難獲得較大的進展。

催乳素(Pro-lactin,PRL)是由腺垂體催乳素細胞合成和分泌的一種肽類激素,主要作用于動物的性腺和乳腺。催乳素與其受體(pro-lactin receptor,PRLR)結(jié)合后作用于靶細胞,調(diào)節(jié)繁殖相關激素的分泌[2-3]。因此,國內(nèi)外許多遺傳學者將PRLR基因作為影響哺乳動物繁殖的候選基因,研究其對動物繁殖性能的影響。PRLR是細胞因子受體超家族的一員,其總長度約為100 kb,有10個外顯子和9個內(nèi)含子組成[4]。PRLR基因是生長與分化的一個重要調(diào)控基因,豬黃體細胞中PRLR數(shù)目在妊娠期間增加。王吉振等[5]、牟玉蓮等[6]將PRLR作為綿羊高繁殖率的候選基因,對其內(nèi)含子2多態(tài)性進行了研究,發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)有關。利用攜帶高繁殖力主效等位基因的綿羊個體進行雜交,根據(jù)分子標記進行輔助育種,就可以培育高產(chǎn)的綿羊品系,所以確定綿羊高繁殖力的主效基因至關重要[7]。

本研究根據(jù) PRLR基因外顯子10序列,采用Primer 5.0軟件設計了2對引物,探討了 PRLR基因外顯子10在中國美利奴羊群中的PCR-SSCP多態(tài)性分布,并分析了基因位點與部分繁殖性狀的關聯(lián)性,旨在尋找繁殖性狀相關的分子標記,為綿羊育種進行標記輔助選擇提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇新疆兵團農(nóng)九師165團中國美利奴羊(新疆軍墾型)135只,頸靜脈采血,用ACD抗凝,-20℃凍存。用酚氯仿抽提法提取基因組DNA,溶于超純水中,4℃保存。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP均購自北京天根公司;PUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅢ)Marker、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(bis-acrylamide)、過硫酸銨(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、瓊脂糖(Agrose)均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。冰乙酸,硝酸銀,甲醛,溴酚藍等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 PCR擴增

根據(jù) GenBank上牛的PRLR基因外顯子10序列(GenBank登錄號為NC_007318)上設計的2對引物(表1),由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR反應體系(25μL):buffer(含 5μmol/L Mg2+)2.5μL,2.5μmol/L dNTPs 2μL,10 μmol/L上、下游引物各1μL,模板DNA 50 ng,5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.6μL,補超純水至 25 μL。PCR反應條件:預變性95℃5 min,然后變性94 ℃30 s,復性30 s,延伸72 ℃20 s,35個循環(huán),最后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,UVP凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

表1 PRLR基因引物信息Tab.1 Primers of PRLR gene

1.4 SSCP分析

取5μL PCR產(chǎn)物和5μL變性劑(98%甲酰胺、0.025%溴酚藍、0.025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA(p H 8.0)、10%甘油)混勻,98 ℃變性 10 min,迅速冰浴5 min。

變性后的PCR產(chǎn)物在10%非變性聚丙烯酰胺凝膠中175 V電泳17 h,電泳結(jié)束后,銀染顯帶。將染好的凝膠置于凝膠系統(tǒng),拍照成像并保存。

1.5 克隆測序

SSCP分析后,選取不同基因型的PCR產(chǎn)物運用DNA片段快速純化回收試劑盒純化,純化后的DNA片段用 PM18-T載體連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10菌株,PCR鑒定后送樣測序。測序反應由北京華大基因科技公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

計算各位點的基因頻率和基因型頻率,并進行Hardy-Weinberg平衡卡方適合性檢驗;計算多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)和群體雜合度(He),并采用SPSS 13.0軟件的 GLM分析基因型效應與雙胎性狀、羔羊初生重、3月齡重的關聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增

PRLR基因外顯子10部分PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。

通過克隆測序證實該擴增片段就是目的片段,且特異性好,可用于SSCP分析。

圖1 2對引物的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of 2 pairs of primers

2.2 SSCP分析

中國美利奴羊PRLR1和PRLR2擴增的 PCR產(chǎn)物SSCP分析結(jié)果表明:引物 PRLR1(圖2)和PRLR2(圖 3)擴增片段存在單核苷酸多態(tài)性。PRLR1擴增片段有3種基因型,分別定義為AA、AB和BB;PRLR2擴增片段有4種基因型,分別定義為 CD、CE、DD和DE。

2.3 序列分析

取AA、AB、BB 3種基因型的PCR產(chǎn)物進行克隆和測序。與原序列相比,結(jié)果(圖4)顯示:AA型第53bp有一處A-G的突變,BB型與原序列相同,AB型第53bp有一處A-G的突變、在81 bp處發(fā)生G-A的突變,但3個突變均未引起氨基酸的改變,為沉默突變。

取CD、CE、DD和DE 4種基因型的 PCR產(chǎn)物進行克隆和測序。與原序列相比,結(jié)果(圖5、圖6)顯示:DD型與原序列相同;DE型在該片段第146處發(fā)生C-G的突變,此突變導致丙氨酸變?yōu)楦拾彼?Ala-Gly);CD型在第132 bp處發(fā)生 G-A的突變,未引起氨基酸的改變,為沉默突變,CE型還在第132 bp處發(fā)生了 G-A的突變,在第167處發(fā)生C-T的突變,導致脯氨酸變?yōu)榱涟彼?Pro-Leu)。

圖2 PRLR1擴增片段的SSCP分析Fig.2 SSCP analysis of PCR amplification using PRLR1

圖3 PRLR2擴增片段的SSCP分析Fig.3 SSCP analysis of PCR amplification using PRLR2

圖4 綿羊 PRLR1中AA、AB、BB型的DNA序列比較Fig.4 Nucleotide Sequences comparison of AA,AB and BB genotypes of PRLR1 in sheep

圖5 綿羊PRLR2中DD、DE、CD和CE型的DNA序列比較Fig.5 Nucleotide Sequences comparison of DD,DE,CD and CE genotypes of PRLR2 in sheep

圖6 綿羊 PRLR2中DD、DE、CD和CE型的氨基酸序列比較Fig.6 Amino acid sequences comparison of DD,DE,CD and CE genotypes of PRLR2 in sheep

2.4 PRLR基因在中國美利奴羊中的遺傳多態(tài)性

由表2可見,中國美利奴羊群體中在 PRLR1位點上AA基因型頻率最高,BB型最低;在PRLR2位點上DD基因型頻率最高,CE型最低?；蜃辉谌后w中的多態(tài)信息含量、群體雜合度、有效等位基因數(shù)及卡方檢驗見表3。從表3可以看出,兩位點的多態(tài)信息含量分別為0.3318和 0.3397,處于0.25和0.50之間,表明兩位點在中國美利奴羊群體中處于中度多態(tài)。χ2適合性檢驗結(jié)果(表3)表明,中國美利奴羊在 PRLR1、PRLR2位點上處于Hardy-Weinberg 平 衡狀態(tài),(χ2=0.1538,P=0.6949;χ2=4.338,P=0.227)。

表2 中國美利奴羊中PRLR基因的等位基因頻率和基因型頻率Tab.2 The genotype frequency and gene frequency of PRLR gene in China Merino

表3 基因座位在群體中的多態(tài)信息含量、雜合度、有效等位基因數(shù)及卡方檢驗Tab.3 Data of H,Ne,PIC andχ2-test

2.5 PRLR基因多態(tài)性與中國美利奴羊部分繁殖性狀之間的關聯(lián)分析

不同PRLR基因型與中國美利奴羊的產(chǎn)羔數(shù)、初生重和3月齡重的一般線性分析結(jié)果見表4。

表4 PRLR1、PRLR2基因型與繁殖性狀的相關分析Tab.4 Correlation analysis between different genotypes of PRLR

由表4可見,PRLR1位點的AA基因型中國美利奴羊初生重比BB型重0.664 kg(P＜0.05);3種基因型之間產(chǎn)羔數(shù)和3月齡重均值差異都不顯著(P＞0.05);PRLR2位點的DE基因型的3月齡重比其他3種基因型重1.7 kg左右(P＜0.05);CE基因型產(chǎn)羔數(shù)比CD基因型多0.31只(P＜0.05),比DE基因型多0.3只(P＜0.05);DD基因型產(chǎn)羔數(shù)比CD基因型多0.32只(P＜0.05),比DE基因型多0.31只(P＜0.05),即CE和DD基因型比CD和DE基因更易產(chǎn)生雙胎。

3 討論

本研究分析了PRLR基因外顯子10上2個位點的遺傳特性,對個基因型效應與中國美利奴羊部分繁殖性狀進行關聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)兩位點突變率較高,哈代溫伯格檢驗結(jié)果顯示兩位點均處于平衡狀態(tài),后經(jīng)關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)基因型在中國美利奴羊部分繁殖性狀上分部差異顯著,這表明基因型對中國美利奴羊部分繁殖性狀有較大影響。據(jù)此我們推測PRLR基因可能是影響中國美利奴羊部分繁殖性狀的基因。

國內(nèi)外對PRLR基因在動物繁殖性狀上的影響研究較多。Linville等[8]研究了 PRLR基因?qū)ωi第一胎窩產(chǎn)仔數(shù)和排卵數(shù)的影響,結(jié)果表明,在不同品系豬中PRLR基因頻率的分布不同(P＜0.05),低頻率等位基因A與較高的排卵數(shù)、較高的總產(chǎn)仔數(shù)、較高的活產(chǎn)仔數(shù)、較低的木乃伊率有關。Rothschild等[9]報道了相對保守的 PRLR基因的1個氨基酸殘基變化與豬高窩產(chǎn)仔數(shù)相關聯(lián)。Ormandy等[10]通過大鼠胚胎干細胞的基因定位得知其攜帶著PRLR的種系無效突變基因,該基因?qū)Ψ敝承誀钣泻艽蟮挠绊?。王吉振等[5]將其作為綿羊高繁殖率的候選基因,對PRLR內(nèi)含子II的多態(tài)性與小尾寒羊、陶賽特和薩?？水a(chǎn)羔數(shù)之間的關系進行了分析,發(fā)現(xiàn)在擴增片段第84和174 bp處分別存在1個T-C和 T-G的突變,純合子基因型的小尾寒羊平均產(chǎn)羔數(shù)比野生型增加0.64只。銀晶[11]對濟寧青山羊等5個品種PRLR內(nèi)含子II多態(tài)性進行了研究,分別在第35和86 bp處發(fā)生了C-A和A-G突變,突變純合子的濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)比突變雜合子型多0.66只(P＜0.01)。牟玉蓮等[6]首次對小尾寒羊、薩?？?、陶賽特羊等綿羊品種 PRLR外顯子10的多態(tài)性進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域存在多態(tài)性,但沒有報道突變的位置和類型。李廣錄等[7]在湖羊、中國美利奴和羅米麗的 PRLR外顯子10中共發(fā)現(xiàn)6個點突變,然而突變是否影響綿羊的產(chǎn)羔數(shù),文中并未報道。以上研究結(jié)果表明,PRLR可以作為綿羊產(chǎn)羔數(shù)的分子標記位點,用于高繁殖率綿羊個體的選育。

本研究采用 PCR-SSCP技術對綿羊 PRLR基因外顯子10部分核苷酸多態(tài)性及其與中國美利奴羊間的關系進行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):AA型第53 bp有一處A-G的突變,AB型第53 bp和81 bp分別有A-G和 G-A的突變,但3個突變均未引起氨基酸的改變,為沉默突變;DE型在該片段第146處發(fā)生CG的突變,此突變導致丙氨酸變?yōu)楦拾彼?Ala-Gly);CD型在第132 bp處發(fā)生 G-A的突變,未引起氨基酸的改變,為沉默突變,CE型還在第132 bp處發(fā)生了 G-A的突變,在第167處發(fā)生C-T的突變,導致脯氨酸變?yōu)榱涟彼?。?PRLR1位點,對于初生重的影響AA基因型與BB型差異顯著(P＜0.05),總體趨勢AA＞AB＞BB;3種基因型之間的產(chǎn)羔數(shù)和3月齡重均值差異都不顯著(P＞0.05)。在PRLR2位點,對于綿羊3月齡重的影響DE基因型明顯高于其他3種基因型(P＜0.05);CE和DD基因型產(chǎn)羔數(shù)沒有明顯的差異,但明顯高于CD和DE基因型(P＜0.05),即CE和DD基因型比 CD和DE基因更易產(chǎn)生雙胎。根據(jù)上述結(jié)果可初步認為PRLR基因可能是控制中國美利奴羊繁殖性能的一個主效基因或是與之存在緊密遺傳連鎖的一個標記。

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Relationship between Polymorphism of Exon 10 of Prolactin Receptor Gene and Reproduction Trait of Chinese Merion Sheep

WU Hongbin1,WU Hequn2,WANG Zunbao1,YU Peng3,ZHAO Zongsheng1,ZHANG Wenxiang1
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Animal Husbandry and Veterinary Station at Agricultural Construction Division 6 in Xinjiang,Wujiaqu 831300,China;3 College of Life Science,Shihezi Univesity,Shihezi 832003,China)

This study selected prolactin receptor(PRLR)as the candidate gene of sheep reprodution trait,detected the polymorphism of exon 10 of prolactin receptor gene and analyzed the relationship between polymorphism of exon 10 of PRLR between reproduction trait of sheep.The result showed that there were two transitions in exon 10 of sheep PRLR gene,which were three genetypes of PRLR1 and four genetypes of PRLP2;both of the two sites accorded with Hardy Weinberg equilibrium in Chinese Merino sheep.The correlation analysis showed that the Chinese Merino sheep with genotype CE and DD had 0.31(P＜0.05)lambs more than those with genotype CD or DE;the average birth weight of genetype AA was 0.66 kg heavier than genetype BB(P＜0.05);the average three-month weight of genetype DE was 2.42 kg heavier than genetype CD(P＜0.05).

sheep;PRLR;reproduction trait;PCR-SSCP

S827.2;Q959.842 < class="emphasis_bold">文獻標識碼:A

A

2010-05-12

吳洪賓(1983-),男,碩士生,專業(yè)方向為動物遺傳育種;e-mail:wuhongbin123456@stu.shzu.edu.cn。

趙宗勝(1969-),男,副教授,從事動物分子遺傳研究;e-mail:zhaozongsh@shzu.edu.cn。