• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用兩種電泳技術(shù)分析大麥品種的醇溶蛋白差異及親緣關(guān)系

    2011-10-14 02:54:14李守明梁維魏凌基齊軍倉(cāng)王金玲
    關(guān)鍵詞:品種鑒定大麥電泳

    李守明,梁維,魏凌基,齊軍倉(cāng),王金玲

    (1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,石河子832003;2新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,昌吉831100)

    利用兩種電泳技術(shù)分析大麥品種的醇溶蛋白差異及親緣關(guān)系

    李守明1,梁維1,魏凌基1,齊軍倉(cāng)1,王金玲2

    (1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,石河子832003;2新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,昌吉831100)

    利用大麥醇溶蛋白電泳鑒定方法了解大麥各品種間的親緣關(guān)系,采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)國(guó)內(nèi)18份大麥品種的醇溶蛋白電泳圖譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:從18個(gè)供試大麥品種中分別分離出13條和18條遷移率不同的多態(tài)性醇溶蛋白譜帶。利用各品種在遷移率Rf值不同的譜帶存在的明顯差異,可將供試18個(gè)大麥品種區(qū)分開。對(duì)醇溶蛋白電泳結(jié)果進(jìn)行聚類分析,結(jié)果顯示:18份大麥材料在遺傳距離(GD)0.49處聚為4個(gè)大類,這表明醇溶蛋白電泳技術(shù)對(duì)大麥品種鑒定和親緣關(guān)系的評(píng)價(jià)是一種有效的方法。

    大麥;醇溶蛋白;電泳

    長(zhǎng)期以來,品種真實(shí)性和純度的檢測(cè)仍以傳統(tǒng)的大田小區(qū)種植為主,通過形態(tài)學(xué)標(biāo)記(農(nóng)藝性狀)來鑒定。但此法所需周期長(zhǎng)、成本高,而且易受環(huán)境因素和檢測(cè)人員水平的影響。近年來,生物技術(shù)的發(fā)展帶來了快速的品種真實(shí)性和純度鑒定技術(shù),如蛋白質(zhì)電泳和DNA指紋等技術(shù)。由于蛋白質(zhì)電泳技術(shù)具有用種量少、鑒定時(shí)間短、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性高、技術(shù)簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于品種鑒定[1]。蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)是一種根據(jù)作物品種基因型差異進(jìn)行品種真實(shí)性和純度鑒定的快速而有效的方法。Gilliand[2]首先將蛋白質(zhì)電泳技術(shù)應(yīng)用于植物品種鑒定。30多年來,醇溶蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、酸溶蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、鹽溶蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、酯酶同工酶電泳技術(shù)等技術(shù)先后出現(xiàn),并在應(yīng)用于水稻、玉米、蔬菜、雜交油菜種子的純度鑒定試驗(yàn)中,均有成功的報(bào)道。

    大麥?zhǔn)钱?dāng)今世界最重要的糧食、飼料及食品加工作物之一。醇溶蛋白是麥類作物種子胚乳中主要的貯藏蛋白質(zhì)之一,與品種的遺傳特性密切相關(guān),其具有穩(wěn)定的遺傳性,一般不受種植環(huán)境的影響。因此,建立麥類作物種子醇溶蛋白的電泳圖譜,就成為品種鑒定及遺傳學(xué)分析的重要內(nèi)容。Cooke等[3]利用ISTA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)191個(gè)不同來源的大麥進(jìn)行鑒定并將其分為41個(gè)不同群體。Stegemann等[4]利用醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)對(duì)小麥、大麥、燕麥、黑麥等數(shù)種禾谷類植物進(jìn)行了品種鑒定分析。顏啟傳等[5]使用ISTA推薦的種子醇溶蛋白電泳方法對(duì)88個(gè)大麥不同品種進(jìn)行鑒定,認(rèn)為其圖譜差異的大小可作為品種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的一項(xiàng)預(yù)測(cè)指標(biāo)。林艷等[6]利用大麥種子醇溶蛋白十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PA GE)鑒定加拿大啤酒大麥的品種和純度。本研究采用APAGE和SDS-PAGE對(duì)國(guó)內(nèi)18份大麥品種的醇溶蛋白電泳圖譜進(jìn)行了分析,旨在說明醇溶蛋白電泳技術(shù)對(duì)大麥品種鑒定和親緣關(guān)系的評(píng)價(jià)是一種準(zhǔn)確、有效、快捷的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)材料為來自我國(guó)不同省份的18個(gè)大麥品種,由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種教研室提供。供試大麥材料的序號(hào)、名稱和原產(chǎn)地見表1。

    表1 材料的序號(hào)、名稱和原產(chǎn)地Tab.1 Name and the origin of experimental materials

    1.2 方法

    1.2.1 醇溶蛋白提取

    將單個(gè)大麥籽粒粉碎后置于1.5 mL離心管中,加入400μL提取液(稱取0.05 g甲基紫,溶入25 mL 2-氯乙醇,蒸餾水定容至100 mL),室溫下振蕩30 min,4℃提取,過夜,用前高速離心(12000 r/min)10 min,取上清液進(jìn)行電泳。

    1.2.2 醇溶蛋白A-PAGE電泳

    參照文獻(xiàn)[7]中的A-PA GE方法,采用酸性聚丙烯酰胺凝膠 ,含 8.2%Acr、0.34%Bis、0.1% 抗壞血酸、6%尿素、0.001%硫酸亞鐵、0.001%H2O2,以0.4%乙酸和0.04%甘氨酸為電極緩沖液,上樣12 L,再以0.4%乙酸和0.04%甘氨酸為電極緩沖液,上樣,500 V恒壓下掛冰盒電泳。電泳結(jié)束后,將膠小心剝出,置于染色液中染色(0.04%考馬斯亮藍(lán)、12%三氯乙酸溶液)。用10%三氯乙酸固定,過夜,考馬斯亮藍(lán)、甲醇、冰醋酸混合液染色30 min,甲醇、冰醋酸混合液脫色1 d。

    1.2.3 醇溶蛋白SDS-PAGE電泳

    采用不連續(xù)分離系統(tǒng)。堆積膠緩沖液 1.0 mol/L Tris-HCl,p H 6.8;分離膠1.0 mol/L Tris-HCl,p H 8.8;采用p H 8.3電極緩沖液。電泳結(jié)束后,將膠小心剝出并置于染色液(0.04%考馬斯亮藍(lán)、12%三氯乙酸溶液)中,染色過夜,最后用甲醇、冰醋酸混合液脫色1 d。

    1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

    參照文獻(xiàn)[8]中的方法,計(jì)算每個(gè)品種蛋白帶的Rf值,相同 Rf值位置上有蛋白帶記為1,無蛋白帶記為0。并根據(jù)譜帶顏色和帶型差異將所有條帶分為著色最深,帶型最寬的為1a帶;著色較淺,帶型中等的為1b帶;只有模糊的痕跡帶為1c帶。采用“0、1”系統(tǒng)記錄蛋白譜帶,同一 Rf值位置上有蛋白帶記為1,無蛋白帶記為0,建立醇溶蛋白譜帶數(shù)據(jù)庫(kù)。

    用DPS軟件,根據(jù)品種間的遺傳距離值[9]以不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 醇溶蛋白A-PAGE譜帶的多態(tài)性

    電泳結(jié)果(圖1a)表明,18個(gè)供試大麥品種共分離出13種相對(duì)遷移率不同的醇溶蛋白譜帶。供試大麥品種譜帶數(shù)目不同,最少的5條,最多的11條,平均每個(gè)大麥品種分離出7.2條譜帶。在13種相對(duì)遷移率不同位置上只有1條共有譜帶存在,而18個(gè)大麥品種在12個(gè)等位變異位點(diǎn)上均存在多態(tài)性。平均每個(gè)品種分離出0.66條多態(tài)性譜帶,這表明這些品種有豐富的多態(tài)性。

    2.2 醇溶蛋白SDS-PAGE譜帶的多態(tài)性

    離出18種相對(duì)遷移率不同的醇溶蛋白譜帶。供試大麥品種譜帶數(shù)目不同,最少的6條,最多的16條,平均每個(gè)大麥品種分離出13.6條譜帶。在18種相對(duì)遷移率不同位置上有2條共有譜帶存在,在16個(gè)等位變異位點(diǎn)上均存在多態(tài)性。平均每個(gè)品種分離出0.66條多態(tài)性譜帶,這表明這些品種具有豐富的多態(tài)性。

    電泳結(jié)果(圖1b)表明,18個(gè)供試大麥品種共分

    圖1 18個(gè)大麥品種的醇溶蛋白電泳圖譜Fig.1 A-PAGE SDS-PAGE electrophoresis patterns of Hordein

    2.3 醇溶蛋白A-PAGE譜帶的差異

    從表2可以看出,在A-PAGE所得的醇溶蛋白電泳圖譜中,共出現(xiàn)13條帶,其中相同條帶只有1條,即在 Rf=0.257的條帶為每個(gè)品種所共有。Rf值在0.232~0.900中的條帶在18個(gè)品種間的分布有一定差異,例如 Rf=0.232的條帶只有在 G23、哈密大麥、Ca23、紅日啤 2號(hào)、廣麥 6號(hào)、翼農(nóng) 0656中出現(xiàn),而其它品種在該位置上缺失。Rf=0.261的條帶只有廣麥2號(hào)、廣麥8號(hào)缺失,而其它品種在該位置上均有帶出現(xiàn)。Rf值在0.232~0.290的條帶較為清晰,但是品種間差異不明顯,Rf值在0.290~0.565的條帶較少且比較模糊。Rf值在0.565~0.812的條帶較多且較清晰,可以比較容易辨別條帶的差異。

    表2 大麥品種醇溶蛋白A-PAGE譜帶的 Rf值Tab.2 Rfvalue of hordein A-PAGE electrophoresis patterns of 18 barley cultivars

    2.4 醇溶蛋白SDS-PAGE譜帶的差異

    從表3可以看出,在SDS-PAGE所得的醇溶蛋白電泳圖譜中,共出現(xiàn)18條帶,其中相同條帶有2條:在 Rf=0.55的條帶和 Rf=0.89的條帶為每個(gè)品種所共有。Rf值在0.12~0.93的條帶在18個(gè)品種間的分布有一定差異。Rf=0.12的條帶只有在G23缺失,而其它品種在該位置上均無該條帶。Rf=0.16的條帶只在新啤1號(hào)、新啤2號(hào)、昭蘇6棱、甘啤3號(hào)、甘啤4號(hào)和吉啤1號(hào)中出現(xiàn),其它品種在該位置上均無該條帶。Rf=0.24的條帶在廣麥2號(hào)和廣麥6號(hào)中缺失,但在其它品種中均存在該譜帶。Rf=0.51的譜帶在吉啤2號(hào)缺失,而其它品種均有該譜帶。

    表3 大麥品種醇溶蛋白SDS-PAGE譜帶的 Rf值Tab.3 Rfvalue of hordein SDS-PAGE electrophoresis patterns of 18 barley cultivars

    2.5 SDS-PAGE和A-PAGE電泳圖譜的比較

    利用SDS-PAGE和A-PAGE對(duì)18個(gè)大麥品種進(jìn)行分析,均能較強(qiáng)地反映供試品種的醇溶蛋白多態(tài)性,分別分離出18條和13條多態(tài)性譜帶,不同品種間醇溶蛋白圖譜存在明顯差異。在本研究中采用這兩種方法無法將參試的18個(gè)大麥品種區(qū)分開(表2、表3)。由兩種方法的比較結(jié)果可以看出,SDS-PAGE蛋白電泳圖譜多態(tài)性較強(qiáng),圖譜差異性更為明顯。

    2.6 18個(gè)大麥品種醇溶蛋白的聚類

    采用聚類分析的方法對(duì)供試材料的醇溶蛋白電泳結(jié)果進(jìn)行了分析(圖2)。在閥值0.49處可將供試材料分為4個(gè)大類群,8個(gè)亞類。第I類群分為2個(gè)亞類,有新啤1號(hào)、新啤2號(hào)、塔城2棱和翼農(nóng)0656等4個(gè)品種;第II類群分為3個(gè)亞類,有昭蘇6棱、E2、甘啤 3號(hào)、甘啤4號(hào)、94啤鑒 131和吉啤 1號(hào)等6個(gè)品種。第III類群分為3個(gè)亞類,有紅日啤2號(hào)、廣麥2號(hào)、廣麥6號(hào)、吉啤2號(hào)和廣麥8號(hào)等6個(gè)品種;第IV類群分為2個(gè)亞類,有哈密大麥、G23和Ca23等3個(gè)品種。

    圖2 供試材料醇溶蛋白的遺傳距離聚類圖Fig.2 Cluster diagram of Hordein G D of provided materials

    3 討論

    目前,利用蛋白質(zhì)電泳鑒定品種的方法較多,主要分為酸性和堿性兩大體系。鹽溶蛋白 SDSPAGE以及醇溶蛋白A-PAGE因其具有豐富的多態(tài)性已被廣泛用于品種鑒定、品質(zhì)分析和種質(zhì)資源篩選[10-11]。超薄等電聚焦電泳和不連續(xù)醋酸尿素聚丙烯酰胺電泳也有一定的應(yīng)用。目前,貯藏蛋白電泳技術(shù)在不斷地改進(jìn)和完善,并廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、大麥、棉花、辣椒、向日葵、水稻等作物的品種鑒定。現(xiàn)在由于計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,可以利用軟件系統(tǒng)建立大麥品種醇溶蛋白譜帶庫(kù),為今后品種鑒定提供標(biāo)準(zhǔn)參考物。

    對(duì)醇溶蛋白帶型相同的品種,可以推測(cè)其親緣關(guān)系較近,但由于大麥籽粒醇溶蛋白含量受到環(huán)境變異和生態(tài)條件的影響[12-13],因而不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為這些品種在所有性狀上無差異或者把譜帶相同的品種混為同一品種。因此,還需借助其它蛋白質(zhì)電泳手段或分子遺傳標(biāo)記對(duì)這些品種進(jìn)一步加以區(qū)分。

    4 結(jié)論

    1)采用SDS-PAGE和A-PA GE兩種方法均可以將參試的18個(gè)大麥品種區(qū)分開,并對(duì)18個(gè)大麥品種進(jìn)行分析,均能較強(qiáng)地反映供試品種的醇溶蛋白多態(tài)性,不同品種間醇溶蛋白圖譜有明顯差異。

    2)SDS-PAGE蛋白電泳圖譜多態(tài)性較強(qiáng),圖譜差異性更為明顯。

    3)18個(gè)大麥品種可分為4個(gè)大類。將遺傳關(guān)系相近的品種聚為一類,例如新啤1號(hào)和新啤2號(hào)均由野洲2條為父本雜交選育而成。甘啤3號(hào)、甘啤4號(hào)為一個(gè)大類,其中甘啤3號(hào)是以法瓦維特為父本,而甘啤4號(hào)是以法瓦維特為母本雜交育成的,因而具有較近的親緣關(guān)系。

    [1]蘭海燕,李立會(huì).蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)在作物品種鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(8):916-920.

    [2]Gilliland T J.The use of allozymes of electrophoresis for cultivar identification and registration in the genus Lolium[D].Belfast:Queens University,1983.

    [3]Cooke R J,Morgan A G.A revised classification of barley cultivars using a standard reference electrophoresis method[J].Journal of the National Institute of Agricultural Botany,1986,17,169-178.

    [4]Stegemann H.Retrospect on 25 years of cultivar identification by protein patterns and prospects for future[M].BiochemicalTests forCultivarIdentification,1984,20-31.

    [5]顏啟傳,黃亞軍,徐嬡.試用 ISTA推薦的種子醇溶蛋白電泳方法鑒定大麥和小麥品種[J].作物學(xué)報(bào),1992,18(1):61-68.

    [6]林艷,梅承芳,董建軍,等.利用蛋白質(zhì)“指紋”技術(shù)鑒定加拿大啤酒大麥的品種和純度[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(6):97-100.

    [7]邵錦震,劉杏川.大麥醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件的探索[J].湖北師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,24(4):22-26.

    [8]劉敏軒,王赟文,韓建國(guó),等.飼用燕麥品種的種子醇溶蛋白超薄層等電聚焦電泳快速鑒定[J].種子,2006,25(9):4-8.

    [9]Nei M,Li W.Mat hematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,1979,76:5269-5273.

    [10]馬金霞,陳凌娜,曲延英,等.種子貯藏蛋白電泳技術(shù)在棉花品種鑒定中的應(yīng)用[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,27(4):23-26.

    [11]謝宗銘,孫寶啟,陳福隆.種子蛋白乳酸尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)及其對(duì)向日葵自交系和雜交種的鑒定[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),1999,21(2):30-33.

    [12]齊軍倉(cāng),王鵬,汪飛,等.大麥籽粒醇溶蛋白組份的基因型和環(huán)境變異及其與β-淀粉酶活性的關(guān)系[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,25(3):157-153.

    [13]靳正忠,齊軍倉(cāng),石國(guó)亮,等.不同生態(tài)條件對(duì)大麥籽粒蛋白質(zhì)及其組分含量的影響[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,24(5):538-542.

    Difference and Relation between Two Hordein of
    Barley Cultivars by Electrophoresis

    LI Shouming,LIANG Wei,WEI Lingji,QI Juncang,WANGJinling
    (1 College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Xinjiang Agricultural Vocational Technical College,Changji 831100,China)

    In order to investigate the difference and relation of two hordein of different barley cultivars by electrophoresis,18 barley cultivars was analyzed by acidicpoly acrylamide gel electrophoresis and sodium dodecyl sulfate-olyacrylamide gel electrophoresis.The results showed that a total 13 and 18 hordein bands with relatively different migration rates was identified in these materials.The findings suggested that the hordein patterns in different barley cultivars differed greatly.Hordein bands with differentRfvalues were so obviously different that the 18 barley cultivars could be easily distinguished.Cluster analysis showed that the 18 barley cultivars could be classified into 4 groups at the level of genetic distance 0.49.The conclusion is that hordein electrophoresis is a feasible method for barley cultivars identification and relation evaluation.

    barley;hordein;electrophoresis

    S635.1 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    A

    2009-11-16

    農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2006-G9-6)

    李守明(1977-),男,農(nóng)藝師,碩士生,專業(yè)方向?yàn)樯锛夹g(shù)在遺傳育種;e-mail:lishouming@stu.shzu.edu.cn。

    魏凌基(1955-),女,教授,從事生物技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用研究;e-mail:wlj_agr@shzu.edu.cn。

    猜你喜歡
    品種鑒定大麥電泳
    我的大麥哥哥
    大麥蟲對(duì)聚苯乙烯塑料的生物降解和礦化作用
    Global interest in Chinese baijiu
    輔助陽(yáng)極在輕微型廂式車身電泳涂裝中的應(yīng)用
    PPG第四屆電泳涂料研討會(huì)在長(zhǎng)沙成功舉辦
    上海建材(2017年4期)2017-04-06 07:32:03
    改良的Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)胸腺肽分子量
    植物DNA條形碼鑒定研究進(jìn)展
    藏藥鑒定及質(zhì)量控制研究現(xiàn)狀
    大麥若葉青汁
    NA指紋在水稻品種鑒定中的應(yīng)用與展望
    精品一区二区三区四区五区乱码| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久久精品区二区三区| 一级毛片精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| x7x7x7水蜜桃| 国产日韩欧美亚洲二区| 香蕉久久夜色| 欧美另类亚洲清纯唯美| 大片电影免费在线观看免费| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品99久久99久久久不卡| 9色porny在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 久久久久视频综合| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文欧美无线码| av超薄肉色丝袜交足视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 天天添夜夜摸| 岛国毛片在线播放| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美黑人精品巨大| 亚洲欧美色中文字幕在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久久久久国产电影| 国产高清视频在线播放一区| 动漫黄色视频在线观看| 欧美日韩精品网址| 亚洲专区字幕在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| xxx96com| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美黑人欧美精品刺激| 一进一出好大好爽视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产淫语在线视频| 国产在线观看jvid| 无遮挡黄片免费观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 好男人电影高清在线观看| 午夜视频精品福利| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产视频一区二区在线看| 亚洲专区国产一区二区| 九色亚洲精品在线播放| 欧美国产精品va在线观看不卡| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 在线国产一区二区在线| 亚洲午夜理论影院| 99久久99久久久精品蜜桃| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美精品av麻豆av| 91大片在线观看| svipshipincom国产片| 伦理电影免费视频| 欧美久久黑人一区二区| 91大片在线观看| 我的亚洲天堂| 国产99久久九九免费精品| 怎么达到女性高潮| 久久青草综合色| 亚洲av成人一区二区三| 美国免费a级毛片| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲精品粉嫩美女一区| 日韩三级视频一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲熟妇熟女久久| 美女高潮到喷水免费观看| 日韩三级视频一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频| 99re6热这里在线精品视频| 免费在线观看影片大全网站| 我的亚洲天堂| 黄色片一级片一级黄色片| 黄色视频,在线免费观看| 免费看a级黄色片| 国产亚洲精品一区二区www | 老司机亚洲免费影院| 在线播放国产精品三级| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 久久午夜亚洲精品久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 黄色 视频免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 99热国产这里只有精品6| 成年人免费黄色播放视频| 午夜视频精品福利| 在线国产一区二区在线| 成人国语在线视频| av一本久久久久| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产高清videossex| 男女高潮啪啪啪动态图| 最新美女视频免费是黄的| 精品少妇久久久久久888优播| 脱女人内裤的视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产99久久九九免费精品| 看黄色毛片网站| 9191精品国产免费久久| 午夜福利影视在线免费观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 无限看片的www在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲三区欧美一区| 美女视频免费永久观看网站| 嫩草影视91久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲片人在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 国产一区二区激情短视频| 大陆偷拍与自拍| 天堂中文最新版在线下载| 天天操日日干夜夜撸| 国产黄色免费在线视频| 国产精品成人在线| 久久香蕉激情| 操出白浆在线播放| 黄色片一级片一级黄色片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久国产一区二区| 制服人妻中文乱码| 看免费av毛片| 看片在线看免费视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美不卡视频在线免费观看 | 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 看黄色毛片网站| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品国产高清国产av | 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜精品在线福利| 人人妻人人澡人人看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲综合色网址| svipshipincom国产片| 免费观看精品视频网站| 精品国产国语对白av| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲三区欧美一区| 男人舔女人的私密视频| 欧美黑人精品巨大| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 精品福利永久在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 极品人妻少妇av视频| 正在播放国产对白刺激| 免费观看精品视频网站| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲九九香蕉| av超薄肉色丝袜交足视频| 99热国产这里只有精品6| 亚洲成国产人片在线观看| 日韩欧美在线二视频 | 在线观看免费视频网站a站| 亚洲第一青青草原| 午夜福利免费观看在线| 91av网站免费观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 99热国产这里只有精品6| 精品午夜福利视频在线观看一区| 伦理电影免费视频| 丝袜美足系列| 九色亚洲精品在线播放| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜影院日韩av| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费高清在线观看日韩| 夜夜爽天天搞| 制服诱惑二区| 精品无人区乱码1区二区| www.熟女人妻精品国产| 久久 成人 亚洲| 成年人午夜在线观看视频| 国产99白浆流出| 国产野战对白在线观看| 宅男免费午夜| 国产成人精品在线电影| 久久久久国内视频| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲成国产人片在线观看| 久久热在线av| xxxhd国产人妻xxx| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产在线一区二区三区精| 国产精品久久久人人做人人爽| 黄色视频不卡| 人成视频在线观看免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | av电影中文网址| 久久久精品区二区三区| 国产真人三级小视频在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩有码中文字幕| 国产精品欧美亚洲77777| 在线国产一区二区在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产日韩欧美亚洲二区| 人妻一区二区av| 极品教师在线免费播放| 黄片大片在线免费观看| 狂野欧美激情性xxxx| 一级片'在线观看视频| aaaaa片日本免费| 久久精品亚洲av国产电影网| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美在线一区亚洲| 男女下面插进去视频免费观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲av成人av| 另类亚洲欧美激情| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 村上凉子中文字幕在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲三区欧美一区| 又紧又爽又黄一区二区| 在线观看66精品国产| videos熟女内射| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| e午夜精品久久久久久久| 精品久久久久久久久久免费视频 | av网站在线播放免费| 在线观看免费高清a一片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久精品国产a三级三级三级| 天堂动漫精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产亚洲欧美98| 久久青草综合色| 精品国产亚洲在线| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 亚洲五月色婷婷综合| 久久狼人影院| 成人免费观看视频高清| 制服诱惑二区| 精品第一国产精品| 成年版毛片免费区| 国产成人系列免费观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美精品一区二区免费开放| www.精华液| 又黄又爽又免费观看的视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 岛国毛片在线播放| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 免费av中文字幕在线| 成年版毛片免费区| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲人成77777在线视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 夫妻午夜视频| 欧美精品亚洲一区二区| 国产日韩欧美亚洲二区| 黑丝袜美女国产一区| 午夜老司机福利片| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产主播在线观看一区二区| 免费高清在线观看日韩| 国产精品秋霞免费鲁丝片| xxx96com| 少妇 在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产99白浆流出| 欧美 日韩 精品 国产| 十八禁高潮呻吟视频| 国产又爽黄色视频| 免费少妇av软件| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产在线观看jvid| 午夜福利乱码中文字幕| 一区二区日韩欧美中文字幕| 人妻 亚洲 视频| 欧美午夜高清在线| 在线免费观看的www视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 亚洲五月婷婷丁香| 国产成人欧美| 中文亚洲av片在线观看爽 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲久久久国产精品| 国产一区二区激情短视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 丝袜人妻中文字幕| 日韩欧美在线二视频 | 亚洲九九香蕉| 免费在线观看亚洲国产| 中文字幕av电影在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 天堂√8在线中文| 久久久国产成人免费| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一级黄色大片毛片| 午夜免费观看网址| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一本大道久久a久久精品| 在线视频色国产色| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 美女 人体艺术 gogo| 91在线观看av| 久久久国产欧美日韩av| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日韩成人在线观看一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区 | 国产精品影院久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品久久久久久电影网| 亚洲中文日韩欧美视频| 日本五十路高清| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 天堂动漫精品| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 18禁观看日本| 黄色视频,在线免费观看| 成人国语在线视频| 高清欧美精品videossex| 欧美精品高潮呻吟av久久| 99国产精品一区二区蜜桃av | 村上凉子中文字幕在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲一码二码三码区别大吗| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 一区二区三区精品91| 午夜免费鲁丝| 国产高清视频在线播放一区| 久久久国产精品麻豆| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲国产精品sss在线观看 | 亚洲 国产 在线| 午夜福利在线免费观看网站| 首页视频小说图片口味搜索| 99国产精品一区二区三区| 国产成人系列免费观看| 人成视频在线观看免费观看| 在线av久久热| 国产成人av激情在线播放| 午夜91福利影院| 国产精品一区二区精品视频观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产不卡一卡二| 90打野战视频偷拍视频| 丝袜人妻中文字幕| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产精品永久免费网站| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲精品在线美女| 美女午夜性视频免费| 国产一区二区激情短视频| av网站免费在线观看视频| 麻豆国产av国片精品| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品电影一区二区三区 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲avbb在线观看| 999精品在线视频| 久久国产精品大桥未久av| 人妻久久中文字幕网| 精品国产亚洲在线| 女性生殖器流出的白浆| 大码成人一级视频| 热re99久久精品国产66热6| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产亚洲精品一区二区www | 精品欧美一区二区三区在线| 中文亚洲av片在线观看爽 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品福利永久在线观看| 日日夜夜操网爽| 搡老岳熟女国产| 欧美乱妇无乱码| 久久精品国产综合久久久| 国产又爽黄色视频| 国产av又大| 一本综合久久免费| 亚洲中文日韩欧美视频| 18禁观看日本| 免费人成视频x8x8入口观看| 看免费av毛片| 久久久国产欧美日韩av| 丝袜人妻中文字幕| 9191精品国产免费久久| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 丝袜美腿诱惑在线| 免费观看精品视频网站| 精品亚洲成国产av| 老鸭窝网址在线观看| 久久热在线av| 精品人妻1区二区| 99riav亚洲国产免费| 丝袜美足系列| 在线观看免费视频网站a站| 在线观看日韩欧美| 亚洲色图av天堂| av有码第一页| 成人18禁在线播放| av中文乱码字幕在线| 亚洲精品自拍成人| 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲欧美激情综合另类| 一级a爱视频在线免费观看| 午夜福利免费观看在线| 欧美国产精品一级二级三级| 国产深夜福利视频在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲熟女毛片儿| 久久中文字幕一级| 99热网站在线观看| 窝窝影院91人妻| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品久久久久成人av| 亚洲久久久国产精品| 国产激情久久老熟女| 嫩草影视91久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 韩国av一区二区三区四区| 欧美激情 高清一区二区三区| 女人被狂操c到高潮| 久久婷婷成人综合色麻豆| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产成人av激情在线播放| 精品一区二区三卡| 日韩有码中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品欧美亚洲77777| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久久国内视频| 99国产精品一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 国产激情久久老熟女| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美激情久久久久久爽电影 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线视频色国产色| av福利片在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 黑丝袜美女国产一区| 黄色怎么调成土黄色| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久这里只有精品19| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 51午夜福利影视在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 国产91精品成人一区二区三区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲欧美激情在线| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲午夜理论影院| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 男女下面插进去视频免费观看| 精品国产国语对白av| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美av亚洲av综合av国产av| 操出白浆在线播放| 麻豆乱淫一区二区| 久久久久精品人妻al黑| 首页视频小说图片口味搜索| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲黑人精品在线| av不卡在线播放| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精华一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 十八禁网站免费在线| 日本一区二区免费在线视频| 成人av一区二区三区在线看| 久久久久国内视频| 手机成人av网站| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲色图综合在线观看| 人妻一区二区av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 丁香欧美五月| 极品人妻少妇av视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 十八禁人妻一区二区| 亚洲专区国产一区二区| 男女之事视频高清在线观看| 热re99久久国产66热| 久久香蕉国产精品| 高清在线国产一区| 精品国产一区二区三区四区第35| 两人在一起打扑克的视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲五月婷婷丁香| 在线观看免费视频日本深夜| 久久99一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲,欧美精品.| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 在线观看一区二区三区激情| 操美女的视频在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 中文欧美无线码| 麻豆成人av在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 又黄又爽又免费观看的视频| 男女之事视频高清在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 露出奶头的视频| 脱女人内裤的视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 最近最新中文字幕大全电影3 | 一边摸一边抽搐一进一出视频| 99热国产这里只有精品6| 精品国产亚洲在线| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 黄频高清免费视频| 咕卡用的链子| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人免费无遮挡视频| 男女床上黄色一级片免费看| 精品第一国产精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产高清videossex| 丰满的人妻完整版| 黑人猛操日本美女一级片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 校园春色视频在线观看| 国产淫语在线视频| svipshipincom国产片| 国产免费av片在线观看野外av| www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产男女内射视频| 成年动漫av网址| 国产成人啪精品午夜网站| 精品人妻在线不人妻| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 午夜福利欧美成人| 高清av免费在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 午夜久久久在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲九九香蕉| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久中文字幕一级| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲七黄色美女视频| 色老头精品视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成年版毛片免费区| 1024视频免费在线观看| 欧美成人午夜精品| 18在线观看网站| 妹子高潮喷水视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美日韩亚洲高清精品| 女警被强在线播放| 国产精品影院久久| e午夜精品久久久久久久| 村上凉子中文字幕在线| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲欧美激情综合另类| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲综合色网址| 另类亚洲欧美激情| 9色porny在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看|