利用兩種電泳技術(shù)分析大麥品種的醇溶蛋白差異及親緣關(guān)系

李守明,梁維,魏凌基,齊軍倉(cāng),王金玲

(1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,石河子832003;2新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,昌吉831100)

利用兩種電泳技術(shù)分析大麥品種的醇溶蛋白差異及親緣關(guān)系

李守明1,梁維1,魏凌基1,齊軍倉(cāng)1,王金玲2

(1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,石河子832003;2新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,昌吉831100)

利用大麥醇溶蛋白電泳鑒定方法了解大麥各品種間的親緣關(guān)系,采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)國(guó)內(nèi)18份大麥品種的醇溶蛋白電泳圖譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:從18個(gè)供試大麥品種中分別分離出13條和18條遷移率不同的多態(tài)性醇溶蛋白譜帶。利用各品種在遷移率Rf值不同的譜帶存在的明顯差異,可將供試18個(gè)大麥品種區(qū)分開。對(duì)醇溶蛋白電泳結(jié)果進(jìn)行聚類分析,結(jié)果顯示:18份大麥材料在遺傳距離(GD)0.49處聚為4個(gè)大類,這表明醇溶蛋白電泳技術(shù)對(duì)大麥品種鑒定和親緣關(guān)系的評(píng)價(jià)是一種有效的方法。

大麥;醇溶蛋白;電泳

長(zhǎng)期以來,品種真實(shí)性和純度的檢測(cè)仍以傳統(tǒng)的大田小區(qū)種植為主,通過形態(tài)學(xué)標(biāo)記(農(nóng)藝性狀)來鑒定。但此法所需周期長(zhǎng)、成本高,而且易受環(huán)境因素和檢測(cè)人員水平的影響。近年來,生物技術(shù)的發(fā)展帶來了快速的品種真實(shí)性和純度鑒定技術(shù),如蛋白質(zhì)電泳和DNA指紋等技術(shù)。由于蛋白質(zhì)電泳技術(shù)具有用種量少、鑒定時(shí)間短、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性高、技術(shù)簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于品種鑒定[1]。蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)是一種根據(jù)作物品種基因型差異進(jìn)行品種真實(shí)性和純度鑒定的快速而有效的方法。Gilliand[2]首先將蛋白質(zhì)電泳技術(shù)應(yīng)用于植物品種鑒定。30多年來,醇溶蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、酸溶蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、鹽溶蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、酯酶同工酶電泳技術(shù)等技術(shù)先后出現(xiàn),并在應(yīng)用于水稻、玉米、蔬菜、雜交油菜種子的純度鑒定試驗(yàn)中,均有成功的報(bào)道。

大麥?zhǔn)钱?dāng)今世界最重要的糧食、飼料及食品加工作物之一。醇溶蛋白是麥類作物種子胚乳中主要的貯藏蛋白質(zhì)之一,與品種的遺傳特性密切相關(guān),其具有穩(wěn)定的遺傳性,一般不受種植環(huán)境的影響。因此,建立麥類作物種子醇溶蛋白的電泳圖譜,就成為品種鑒定及遺傳學(xué)分析的重要內(nèi)容。Cooke等[3]利用ISTA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)191個(gè)不同來源的大麥進(jìn)行鑒定并將其分為41個(gè)不同群體。Stegemann等[4]利用醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)對(duì)小麥、大麥、燕麥、黑麥等數(shù)種禾谷類植物進(jìn)行了品種鑒定分析。顏啟傳等[5]使用ISTA推薦的種子醇溶蛋白電泳方法對(duì)88個(gè)大麥不同品種進(jìn)行鑒定,認(rèn)為其圖譜差異的大小可作為品種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的一項(xiàng)預(yù)測(cè)指標(biāo)。林艷等[6]利用大麥種子醇溶蛋白十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PA GE)鑒定加拿大啤酒大麥的品種和純度。本研究采用APAGE和SDS-PAGE對(duì)國(guó)內(nèi)18份大麥品種的醇溶蛋白電泳圖譜進(jìn)行了分析,旨在說明醇溶蛋白電泳技術(shù)對(duì)大麥品種鑒定和親緣關(guān)系的評(píng)價(jià)是一種準(zhǔn)確、有效、快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為來自我國(guó)不同省份的18個(gè)大麥品種,由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種教研室提供。供試大麥材料的序號(hào)、名稱和原產(chǎn)地見表1。

表1 材料的序號(hào)、名稱和原產(chǎn)地Tab.1 Name and the origin of experimental materials

1.2 方法

1.2.1 醇溶蛋白提取

將單個(gè)大麥籽粒粉碎后置于1.5 mL離心管中,加入400μL提取液(稱取0.05 g甲基紫,溶入25 mL 2-氯乙醇,蒸餾水定容至100 mL),室溫下振蕩30 min,4℃提取,過夜,用前高速離心(12000 r/min)10 min,取上清液進(jìn)行電泳。

1.2.2 醇溶蛋白A-PAGE電泳

參照文獻(xiàn)[7]中的A-PA GE方法,采用酸性聚丙烯酰胺凝膠 ,含 8.2%Acr、0.34%Bis、0.1% 抗壞血酸、6%尿素、0.001%硫酸亞鐵、0.001%H2O2,以0.4%乙酸和0.04%甘氨酸為電極緩沖液,上樣12 L,再以0.4%乙酸和0.04%甘氨酸為電極緩沖液,上樣,500 V恒壓下掛冰盒電泳。電泳結(jié)束后,將膠小心剝出,置于染色液中染色(0.04%考馬斯亮藍(lán)、12%三氯乙酸溶液)。用10%三氯乙酸固定,過夜,考馬斯亮藍(lán)、甲醇、冰醋酸混合液染色30 min,甲醇、冰醋酸混合液脫色1 d。

1.2.3 醇溶蛋白SDS-PAGE電泳

采用不連續(xù)分離系統(tǒng)。堆積膠緩沖液 1.0 mol/L Tris-HCl,p H 6.8;分離膠1.0 mol/L Tris-HCl,p H 8.8;采用p H 8.3電極緩沖液。電泳結(jié)束后,將膠小心剝出并置于染色液(0.04%考馬斯亮藍(lán)、12%三氯乙酸溶液)中,染色過夜,最后用甲醇、冰醋酸混合液脫色1 d。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

參照文獻(xiàn)[8]中的方法,計(jì)算每個(gè)品種蛋白帶的Rf值,相同 Rf值位置上有蛋白帶記為1,無蛋白帶記為0。并根據(jù)譜帶顏色和帶型差異將所有條帶分為著色最深,帶型最寬的為1a帶;著色較淺,帶型中等的為1b帶;只有模糊的痕跡帶為1c帶。采用“0、1”系統(tǒng)記錄蛋白譜帶,同一 Rf值位置上有蛋白帶記為1,無蛋白帶記為0,建立醇溶蛋白譜帶數(shù)據(jù)庫(kù)。

用DPS軟件,根據(jù)品種間的遺傳距離值[9]以不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇溶蛋白A-PAGE譜帶的多態(tài)性

電泳結(jié)果(圖1a)表明,18個(gè)供試大麥品種共分離出13種相對(duì)遷移率不同的醇溶蛋白譜帶。供試大麥品種譜帶數(shù)目不同,最少的5條,最多的11條,平均每個(gè)大麥品種分離出7.2條譜帶。在13種相對(duì)遷移率不同位置上只有1條共有譜帶存在,而18個(gè)大麥品種在12個(gè)等位變異位點(diǎn)上均存在多態(tài)性。平均每個(gè)品種分離出0.66條多態(tài)性譜帶,這表明這些品種有豐富的多態(tài)性。

2.2 醇溶蛋白SDS-PAGE譜帶的多態(tài)性

離出18種相對(duì)遷移率不同的醇溶蛋白譜帶。供試大麥品種譜帶數(shù)目不同,最少的6條,最多的16條,平均每個(gè)大麥品種分離出13.6條譜帶。在18種相對(duì)遷移率不同位置上有2條共有譜帶存在,在16個(gè)等位變異位點(diǎn)上均存在多態(tài)性。平均每個(gè)品種分離出0.66條多態(tài)性譜帶,這表明這些品種具有豐富的多態(tài)性。

電泳結(jié)果(圖1b)表明,18個(gè)供試大麥品種共分

圖1 18個(gè)大麥品種的醇溶蛋白電泳圖譜Fig.1 A-PAGE SDS-PAGE electrophoresis patterns of Hordein

2.3 醇溶蛋白A-PAGE譜帶的差異

從表2可以看出,在A-PAGE所得的醇溶蛋白電泳圖譜中,共出現(xiàn)13條帶,其中相同條帶只有1條,即在 Rf=0.257的條帶為每個(gè)品種所共有。Rf值在0.232～0.900中的條帶在18個(gè)品種間的分布有一定差異,例如 Rf=0.232的條帶只有在 G23、哈密大麥、Ca23、紅日啤 2號(hào)、廣麥 6號(hào)、翼農(nóng) 0656中出現(xiàn),而其它品種在該位置上缺失。Rf=0.261的條帶只有廣麥2號(hào)、廣麥8號(hào)缺失,而其它品種在該位置上均有帶出現(xiàn)。Rf值在0.232～0.290的條帶較為清晰,但是品種間差異不明顯,Rf值在0.290～0.565的條帶較少且比較模糊。Rf值在0.565～0.812的條帶較多且較清晰,可以比較容易辨別條帶的差異。

表2 大麥品種醇溶蛋白A-PAGE譜帶的 Rf值Tab.2 Rfvalue of hordein A-PAGE electrophoresis patterns of 18 barley cultivars

2.4 醇溶蛋白SDS-PAGE譜帶的差異

從表3可以看出,在SDS-PAGE所得的醇溶蛋白電泳圖譜中,共出現(xiàn)18條帶,其中相同條帶有2條:在 Rf=0.55的條帶和 Rf=0.89的條帶為每個(gè)品種所共有。Rf值在0.12～0.93的條帶在18個(gè)品種間的分布有一定差異。Rf=0.12的條帶只有在G23缺失,而其它品種在該位置上均無該條帶。Rf=0.16的條帶只在新啤1號(hào)、新啤2號(hào)、昭蘇6棱、甘啤3號(hào)、甘啤4號(hào)和吉啤1號(hào)中出現(xiàn),其它品種在該位置上均無該條帶。Rf=0.24的條帶在廣麥2號(hào)和廣麥6號(hào)中缺失,但在其它品種中均存在該譜帶。Rf=0.51的譜帶在吉啤2號(hào)缺失,而其它品種均有該譜帶。

表3 大麥品種醇溶蛋白SDS-PAGE譜帶的 Rf值Tab.3 Rfvalue of hordein SDS-PAGE electrophoresis patterns of 18 barley cultivars

2.5 SDS-PAGE和A-PAGE電泳圖譜的比較

利用SDS-PAGE和A-PAGE對(duì)18個(gè)大麥品種進(jìn)行分析,均能較強(qiáng)地反映供試品種的醇溶蛋白多態(tài)性,分別分離出18條和13條多態(tài)性譜帶,不同品種間醇溶蛋白圖譜存在明顯差異。在本研究中采用這兩種方法無法將參試的18個(gè)大麥品種區(qū)分開(表2、表3)。由兩種方法的比較結(jié)果可以看出,SDS-PAGE蛋白電泳圖譜多態(tài)性較強(qiáng),圖譜差異性更為明顯。

2.6 18個(gè)大麥品種醇溶蛋白的聚類

采用聚類分析的方法對(duì)供試材料的醇溶蛋白電泳結(jié)果進(jìn)行了分析(圖2)。在閥值0.49處可將供試材料分為4個(gè)大類群,8個(gè)亞類。第I類群分為2個(gè)亞類,有新啤1號(hào)、新啤2號(hào)、塔城2棱和翼農(nóng)0656等4個(gè)品種;第II類群分為3個(gè)亞類,有昭蘇6棱、E2、甘啤 3號(hào)、甘啤4號(hào)、94啤鑒 131和吉啤 1號(hào)等6個(gè)品種。第III類群分為3個(gè)亞類,有紅日啤2號(hào)、廣麥2號(hào)、廣麥6號(hào)、吉啤2號(hào)和廣麥8號(hào)等6個(gè)品種;第IV類群分為2個(gè)亞類,有哈密大麥、G23和Ca23等3個(gè)品種。

圖2 供試材料醇溶蛋白的遺傳距離聚類圖Fig.2 Cluster diagram of Hordein G D of provided materials

3 討論

目前,利用蛋白質(zhì)電泳鑒定品種的方法較多,主要分為酸性和堿性兩大體系。鹽溶蛋白 SDSPAGE以及醇溶蛋白A-PAGE因其具有豐富的多態(tài)性已被廣泛用于品種鑒定、品質(zhì)分析和種質(zhì)資源篩選[10-11]。超薄等電聚焦電泳和不連續(xù)醋酸尿素聚丙烯酰胺電泳也有一定的應(yīng)用。目前,貯藏蛋白電泳技術(shù)在不斷地改進(jìn)和完善,并廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、大麥、棉花、辣椒、向日葵、水稻等作物的品種鑒定。現(xiàn)在由于計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,可以利用軟件系統(tǒng)建立大麥品種醇溶蛋白譜帶庫(kù),為今后品種鑒定提供標(biāo)準(zhǔn)參考物。

對(duì)醇溶蛋白帶型相同的品種,可以推測(cè)其親緣關(guān)系較近,但由于大麥籽粒醇溶蛋白含量受到環(huán)境變異和生態(tài)條件的影響[12-13],因而不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為這些品種在所有性狀上無差異或者把譜帶相同的品種混為同一品種。因此,還需借助其它蛋白質(zhì)電泳手段或分子遺傳標(biāo)記對(duì)這些品種進(jìn)一步加以區(qū)分。

4 結(jié)論

1)采用SDS-PAGE和A-PA GE兩種方法均可以將參試的18個(gè)大麥品種區(qū)分開,并對(duì)18個(gè)大麥品種進(jìn)行分析,均能較強(qiáng)地反映供試品種的醇溶蛋白多態(tài)性,不同品種間醇溶蛋白圖譜有明顯差異。

2)SDS-PAGE蛋白電泳圖譜多態(tài)性較強(qiáng),圖譜差異性更為明顯。

3)18個(gè)大麥品種可分為4個(gè)大類。將遺傳關(guān)系相近的品種聚為一類,例如新啤1號(hào)和新啤2號(hào)均由野洲2條為父本雜交選育而成。甘啤3號(hào)、甘啤4號(hào)為一個(gè)大類,其中甘啤3號(hào)是以法瓦維特為父本,而甘啤4號(hào)是以法瓦維特為母本雜交育成的,因而具有較近的親緣關(guān)系。

[1]蘭海燕,李立會(huì).蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)在作物品種鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(8):916-920.

[2]Gilliland T J.The use of allozymes of electrophoresis for cultivar identification and registration in the genus Lolium[D].Belfast:Queens University,1983.

[3]Cooke R J,Morgan A G.A revised classification of barley cultivars using a standard reference electrophoresis method[J].Journal of the National Institute of Agricultural Botany,1986,17,169-178.

[4]Stegemann H.Retrospect on 25 years of cultivar identification by protein patterns and prospects for future[M].BiochemicalTests forCultivarIdentification,1984,20-31.

[5]顏啟傳,黃亞軍,徐嬡.試用 ISTA推薦的種子醇溶蛋白電泳方法鑒定大麥和小麥品種[J].作物學(xué)報(bào),1992,18(1):61-68.

[6]林艷,梅承芳,董建軍,等.利用蛋白質(zhì)“指紋”技術(shù)鑒定加拿大啤酒大麥的品種和純度[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(6):97-100.

[7]邵錦震,劉杏川.大麥醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件的探索[J].湖北師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,24(4):22-26.

[8]劉敏軒,王赟文,韓建國(guó),等.飼用燕麥品種的種子醇溶蛋白超薄層等電聚焦電泳快速鑒定[J].種子,2006,25(9):4-8.

[9]Nei M,Li W.Mat hematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,1979,76:5269-5273.

[10]馬金霞,陳凌娜,曲延英,等.種子貯藏蛋白電泳技術(shù)在棉花品種鑒定中的應(yīng)用[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,27(4):23-26.

[11]謝宗銘,孫寶啟,陳福隆.種子蛋白乳酸尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)及其對(duì)向日葵自交系和雜交種的鑒定[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),1999,21(2):30-33.

[12]齊軍倉(cāng),王鵬,汪飛,等.大麥籽粒醇溶蛋白組份的基因型和環(huán)境變異及其與β-淀粉酶活性的關(guān)系[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,25(3):157-153.

[13]靳正忠,齊軍倉(cāng),石國(guó)亮,等.不同生態(tài)條件對(duì)大麥籽粒蛋白質(zhì)及其組分含量的影響[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,24(5):538-542.

Difference and Relation between Two Hordein of
Barley Cultivars by Electrophoresis

LI Shouming,LIANG Wei,WEI Lingji,QI Juncang,WANGJinling
(1 College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Xinjiang Agricultural Vocational Technical College,Changji 831100,China)

In order to investigate the difference and relation of two hordein of different barley cultivars by electrophoresis,18 barley cultivars was analyzed by acidicpoly acrylamide gel electrophoresis and sodium dodecyl sulfate-olyacrylamide gel electrophoresis.The results showed that a total 13 and 18 hordein bands with relatively different migration rates was identified in these materials.The findings suggested that the hordein patterns in different barley cultivars differed greatly.Hordein bands with differentRfvalues were so obviously different that the 18 barley cultivars could be easily distinguished.Cluster analysis showed that the 18 barley cultivars could be classified into 4 groups at the level of genetic distance 0.49.The conclusion is that hordein electrophoresis is a feasible method for barley cultivars identification and relation evaluation.

barley;hordein;electrophoresis

S635.1 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

A

2009-11-16

農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2006-G9-6)

李守明(1977-),男,農(nóng)藝師,碩士生,專業(yè)方向?yàn)樯锛夹g(shù)在遺傳育種;e-mail:lishouming@stu.shzu.edu.cn。

魏凌基(1955-),女,教授,從事生物技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用研究;e-mail:wlj_agr@shzu.edu.cn。