化妝品中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法探討

陳冠武 蘇建暉 陳冬娥 林寧?kù)o

(汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515041)

化妝品中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法探討

陳冠武 蘇建暉 陳冬娥 林寧?kù)o

(汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515041)

[目的]對(duì)4種鑒定方法進(jìn)行比較分析,以找出適合于化妝品綠膿桿菌檢驗(yàn)的準(zhǔn)確快速的鑒定方法。[方法]同時(shí)采用微量生化管、API20NE試驗(yàn)條、VITEK-32和VITEK2 COMPACT微生物鑒定儀4種方法對(duì)不同類型的出口化妝品進(jìn)行銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)、鑒定。[結(jié)果]5株可疑綠膿桿菌中有1株經(jīng)手工鑒定為非綠膿桿菌,經(jīng)API20NE試驗(yàn)條鑒定得出結(jié)果是惡臭假單胞菌,而VITEK-32和VITEK2 COMPACT微生物儀器鑒定是銅綠假單胞菌;其余4株用4種方法鑒定,結(jié)果均為綠膿桿菌。[結(jié)論]在鑒定可疑綠膿桿菌時(shí),手工生化方法只能得出是或否的結(jié)論;API20NE試驗(yàn)條可得出具體的種屬名稱及鑒定分析;VITEK微生物儀器則可能出現(xiàn)誤判。

銅綠假單胞;鑒定;分析

1 前言

綠膿桿菌(P.aeruginosa)屬假單胞菌屬(Pseudomonas),常引起人體皮膚化膿感染,特別是皮膚有外傷及眼部疾病患者感染綠膿桿菌后,常使病情惡化,嚴(yán)重者可引發(fā)敗血癥。因此,1987年5月發(fā)布的國(guó)家化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T 7918.4-87《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法綠膿桿菌》[1]規(guī)定在化妝品中不得檢出綠膿桿菌。由于受當(dāng)時(shí)技術(shù)水平的限制,GB/T 7918.4-87對(duì)可疑綠膿桿菌的鑒定僅停留在應(yīng)用生化管方面,而近年來(lái),法國(guó)生物梅里埃推出API系列試驗(yàn)條、VITEK微生物鑒定儀及系列鑒定卡,已在各檢測(cè)機(jī)構(gòu)得到廣泛應(yīng)用[1]。本文對(duì)檢驗(yàn)中可疑綠膿桿菌的鑒定同時(shí)采用微量生化管、API 20NE試驗(yàn)條、VITEK-32和VITEK2 COMPACT微生物鑒定儀4種方法進(jìn)行鑒定,并對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較、分析。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)樣品

2006-2009年汕頭口岸進(jìn)出境的化妝品,共計(jì)5300批7000多份樣品。

2.1.2 主要試劑

SCDLP液體培養(yǎng)基、十六烷三甲基溴化銨、乙酰胺等培養(yǎng)基,革蘭氏染液等:購(gòu)自北京陸橋公司;綠膿桿菌微量生化鑒定管:購(gòu)自廣東環(huán)凱公司;氧化酶試劑、API 20NE試驗(yàn)條、VITEK GN/GN I測(cè)試卡:購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AS1.2031:購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心;ATCC27853,購(gòu)自美國(guó)微生物菌種保藏中心。

2.1.3 儀器

VITEK-32型、VITEK 2 COMPACT:法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

2.2 檢測(cè)方法

按GB/T 7918.4-87[2]檢驗(yàn)并予以改進(jìn)。

3 結(jié)果

3.1 檢出菌株總數(shù)

從不同類別的5份化妝品樣樣品中檢出了4株銅綠假單胞菌和1株惡臭假單胞菌,具體鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同方法對(duì)化妝品的菌株檢出情況

表1顯示,微量生化管、API 20NE試驗(yàn)條與VITEK儀器均判定01-04號(hào)菌株為銅綠假單胞菌;05號(hào)菌株的鑒定結(jié)果有差異:VITEK儀器鑒定該菌株是銅綠假單胞菌;手工鑒定是非綠膿桿菌的革蘭氏陰性桿菌;而API 20NE試驗(yàn)條,反應(yīng)數(shù)據(jù)由APWEB(V1.2.1)軟件分析得出結(jié)果是惡臭假單胞菌。

3.2 05號(hào)菌株與銅綠假單胞標(biāo)準(zhǔn)菌株的比較

05號(hào)菌株與銅綠假單胞標(biāo)準(zhǔn)菌株(06號(hào)菌株)用API20NE試驗(yàn)條和VITEK儀器的鑒定情況見(jiàn)表2。

表2 05號(hào)菌株與銅綠假單胞標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定結(jié)果比較

3.2.1 05號(hào)菌株與銅綠假單胞標(biāo)準(zhǔn)菌株的API 20NE結(jié)果比對(duì)

按API20NE操作說(shuō)明,05號(hào)菌株用API 20NE試驗(yàn)條檢驗(yàn),反應(yīng)數(shù)據(jù)由APWEB(V1.2.1)軟件分析,得出結(jié)果是99.6%惡臭假單胞菌,T值(0.96),沒(méi)有不一致試驗(yàn)。銅綠假單胞標(biāo)準(zhǔn)菌株(06號(hào)菌株)得出結(jié)果是99.6%銅綠假單胞菌。二者比對(duì),有NO3、GEL、MAN等5項(xiàng)生化項(xiàng)結(jié)果不同。

3.2.2 05號(hào)菌株與銅綠假單胞標(biāo)準(zhǔn)菌株的VITEK結(jié)果比對(duì)

使用VITEK-32型儀器鑒定,05號(hào)菌株與銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(06號(hào)菌株)僅存在甘露糖發(fā)酵(dMAN)一生化項(xiàng)結(jié)果差異。使用VITEK 2儀器鑒定,二者比對(duì),有APPA、dMAN(甘露醇)、GlyA(氨基乙酸酶)、lHISa(組氨酸同化)4項(xiàng)生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果存在差異,但結(jié)論都是銅綠假單胞菌。05號(hào)菌株在VITEK 2 COMPACT二次鑒定還出現(xiàn)一項(xiàng)生化(CMT)差別,第二次為陽(yáng)性。

4 討論

(1)檢出的4株銅綠假單胞菌分別來(lái)自不同廠家、不同類別的4份化妝品,還有報(bào)道從消毒液中檢出銅綠假單胞菌[3],說(shuō)明銅綠假單胞菌在自然界分布廣,對(duì)外環(huán)境的抵抗力和抗藥性能力都較強(qiáng),因此,在化妝品、食品中檢測(cè)銅綠假單胞菌很有必要[4]。

(2)雖然某些銅綠膿假單胞菌如標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853,它在增菌液和選擇性分離平板上會(huì)出現(xiàn)特定綠色素和芳香氣味,但是在檢驗(yàn)時(shí)是不能僅憑是否產(chǎn)生色素和氣味作出判斷。因?yàn)棰巽~綠膿假單胞菌菌型多,一些標(biāo)準(zhǔn)菌株及本文檢出陽(yáng)性菌株中的3株在增菌液和選擇性分離平板上都沒(méi)有出現(xiàn)特定的色素和氣味;②不同類型樣品也會(huì)影響增菌液的色素和氣味。所以增菌液和選擇性分離平板上的是否會(huì)出現(xiàn)的色素和氣味不能做為唯一判斷依據(jù),凡是SCDLP增菌液出現(xiàn)混濁,十六烷三甲基溴化銨平板上生長(zhǎng)淺黃或白色、扁平、表面光滑的菌落均應(yīng)列為可疑菌進(jìn)行后續(xù)鑒定。

(3)在國(guó)標(biāo)中顯示均可使用十六烷三甲基溴化銨和乙酰胺平板作為分離銅綠膿假單胞菌的培養(yǎng)基。但實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)乙酰胺培養(yǎng)基的選擇性過(guò)強(qiáng),活化好的標(biāo)準(zhǔn)菌株在乙酰胺平板上也生長(zhǎng)不好,呈現(xiàn)受抑制狀,經(jīng)48h培養(yǎng),菌落仍很小(≤0.5mm),沒(méi)有明顯特征,不易辨別[4],因此,不能單獨(dú)選用乙酰胺培養(yǎng)基來(lái)分離銅綠假胞菌。

(4)對(duì)于SCDLP增菌液經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后出現(xiàn)菌液混濁的,在劃線分離目標(biāo)菌同時(shí)吸10mL混濁的增菌液加入90mLSCDLP培養(yǎng)液,于42℃培養(yǎng)24h,即二次增菌后再劃線于十六烷三甲基溴化銨平板進(jìn)行目標(biāo)菌分離,這有利于目標(biāo)菌在平板上成為優(yōu)勢(shì)菌而提高檢出率。

(5)如果十六烷三甲基溴化銨平板上所出現(xiàn)的單個(gè)菌不多,可從二次增菌液(延長(zhǎng)培養(yǎng)至48h或42℃培養(yǎng)24h)重新挑菌液和從平板上挑粘結(jié)成片的菌苔分別劃線于十六烷三甲基溴化銨平板進(jìn)行目標(biāo)菌的單個(gè)分離。對(duì)于平板上可疑菌應(yīng)多挑單個(gè)菌落進(jìn)行分純培養(yǎng),可有效避免漏檢。除此之外,綠膿桿菌在SCDLP增菌液增殖,培養(yǎng)18h-48h其菌量穩(wěn)定維持在高水平[4],所以增菌液可延長(zhǎng)培養(yǎng)至48h。

(6)輔助鑒定可選用API 20NE試驗(yàn)條,文中多個(gè)非綠膿桿菌是經(jīng)API 20NE輔助鑒定,初步得出菌的類別。API鑒定結(jié)果經(jīng)APWEB(V1.2.1)軟件分析,除有鑒定%值外,還有T指數(shù)及不一致的試驗(yàn)作為結(jié)論的說(shuō)明,可以較全面分析鑒定情況,有效避免誤判。

(7)VITEK鑒定生化儀雖然準(zhǔn)確性與可靠性很高,已被許多國(guó)家列入檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中予以應(yīng)用,但是其鑒定結(jié)果受到多種因素的影響:如待檢菌株不純;接種濁度不合要求;接種物孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng);超出試驗(yàn)卡鑒定范圍;VITEK在掃描過(guò)程中出現(xiàn)了不正常讀數(shù)等[5-7];甚至出現(xiàn)同一可疑菌僅出現(xiàn)一項(xiàng)對(duì)被檢菌不是十分重要的生化項(xiàng)不同就得出不同結(jié)論(如表2所述的CMT)。除以上原因外,可能還有一些不能確定的因素也可導(dǎo)致其與手工生化結(jié)果不同的情況出現(xiàn),這次05號(hào)菌株的鑒定就屬于這種較難分析的異常情況。這說(shuō)明VITEK生化鑒定儀器確實(shí)存在著一定幾率的不正常鑒定情況[6],盡管這種幾率可能非常低,但在實(shí)際檢測(cè)工作中應(yīng)該引起足夠的重視:即不能過(guò)份依賴儀器鑒定細(xì)菌,對(duì)儀器鑒定報(bào)告要進(jìn)行充分科學(xué)分析,生化卡上沒(méi)有的項(xiàng)目(如MR-VP,OXI、靛基質(zhì)和綠膿色素等),只要是目標(biāo)菌規(guī)定檢驗(yàn)的生化項(xiàng)目就應(yīng)以手工生化鑒定確認(rèn);實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立切實(shí)可行的儀器鑒定與手工方法相結(jié)合的細(xì)菌鑒定工作指導(dǎo)書,不能單憑著生化鑒定儀器鑒定報(bào)告結(jié)果就作出最終判定結(jié)論。

(8)生化鑒定時(shí)要運(yùn)用陰、陽(yáng)性對(duì)照比對(duì)[8]以及手工鑒定的平行比對(duì)(如不同廠家的生化管),以獲得準(zhǔn)確的分析結(jié)果。例如氧化酶試驗(yàn),在綠膿桿菌檢驗(yàn)中較重要,氧化酶陰性菌株即可認(rèn)定非綠膿桿菌,但試劑1%二甲基對(duì)苯二胺在使用過(guò)程存在較高不穩(wěn)性[8],尤其是國(guó)內(nèi)試劑更是如此,另外操作上也存在易引起假陽(yáng)假陰的因素,因此,這樣的試驗(yàn)必須用已知氧化酶陽(yáng)性和陰性的菌株同時(shí)做驗(yàn)證與試驗(yàn)結(jié)果加以比對(duì)。

(9)做好室內(nèi)質(zhì)控工作,比如培養(yǎng)基性能驗(yàn)證。實(shí)踐中,曾出現(xiàn)一瓶開(kāi)瓶較久的十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基(在有效期內(nèi)),用活化后的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)基驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株生長(zhǎng)明顯受影響,經(jīng)48h培養(yǎng),長(zhǎng)成菌落量少、形態(tài)也較差。如果將此培養(yǎng)基應(yīng)用到樣品檢驗(yàn)上,極易導(dǎo)致漏檢,所以做好室內(nèi)質(zhì)控工作對(duì)保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性至關(guān)重要,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)性能不理想的培養(yǎng)基、試劑應(yīng)及時(shí)淘汰(盡管還在有效期內(nèi)),避免因培養(yǎng)基低性能導(dǎo)致漏檢或誤判。

[1] SN/T 2099-2008進(jìn)出口食品中綠桿菌檢測(cè)方法[S].

[2] GB/T7918.4-87化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法綠膿桿菌[S].

[3] 白梅.學(xué)校衛(wèi)生所消毒液中檢出綠膿桿菌[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,1(15):119-120.

[4] 鄭晶,馬聘.食品中綠桿菌檢測(cè)方法的研究[J].食品科學(xué),2007,28(7):419-424.

[5] 鐘步云,孔海深,徐林燕,等.鑒定儀出現(xiàn)不能鑒定細(xì)菌的處理[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2000,6(23):30-31.

[6] 黎昊雁,王瑋,等.使用VITEK檢測(cè)化妝品中的綠膿桿菌[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(1):100-101.

[7] 陳太基,封幼玲,戴建華,等.VITEK全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)的應(yīng)用與研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,1997,7(5):262-266.

[8] 韓麗.綠膿桿菌檢測(cè)的方法及注意事項(xiàng)[J].中國(guó)纖檢,2006,5:16.

Discussion of Detection and Identification of Paeudomonas Aeruginosa in Comestics

Chen Guanwu,Su Jianhui,Chen Donge,Lin Ningjing

(Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shantou,Guangdong,515041)

According to National Standard GB/T7918.4-87,we recently detected 4 Paeudomonas aeruginosa and several Pseudomonas putida in various comestics.This article compared the adoption of Cetrimide Agar,and Acetamide Agar with chemical tubes,API20NE and VITEK,analysing and discussing the results produced by different methods.

Paeudomonas Aeruginosa;Identification;Analysis

T974.1