改良的黃嘌呤氧化酶法測(cè)定動(dòng)植物組織中S O D比活力

徐 東，趙 建，黃漢昌，文 鏡*

(北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

改良的黃嘌呤氧化酶法測(cè)定動(dòng)植物組織中S O D比活力

徐 東，趙 建，黃漢昌，文 鏡*

(北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

針對(duì)黃嘌呤氧化酶法測(cè)定動(dòng)植物組織中SOD活力存在干擾的問(wèn)題，對(duì)方法加以改良。以使SOD變性而不影響干擾物質(zhì)的干擾值為原則，通過(guò)測(cè)定酶活力及圓二色光譜尋找制備樣品空白的最佳實(shí)驗(yàn)條件，設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)加熱的樣品空白；利用扣除法排除樣品中其他物質(zhì)對(duì)黃嘌呤氧化酶體系的干擾；通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)以及對(duì)動(dòng)植物組織的實(shí)測(cè)，對(duì)改良前后的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明：用改良的黃嘌呤氧化酶法可使動(dòng)植物組織中SOD活力的檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。

黃嘌呤氧化酶法；樣品空白；檢測(cè)超氧化物歧化酶活力

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)能夠清除超氧陰離子自由基的預(yù)防型抗氧化劑[1]，在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在，因其具有抗衰老、提高機(jī)體對(duì)多種疾病的抵抗力，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)力，減輕腫瘤患者在放療、化療過(guò)程中的毒副作用等生理功能，已作為一種抗氧化功能因子用于臨床、食品、化妝品等領(lǐng)域[2-4]。目前，動(dòng)、植物中SOD活性的測(cè)定方法有很多，主要包括鄰苯三酚法、化學(xué)發(fā)光法、NBT還原法及黃嘌呤氧化酶法等[5]。其中黃嘌呤氧化酶法是目前應(yīng)用最廣泛的測(cè)定SOD活性的方法，該方法以對(duì)反應(yīng)體系中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除率定義為酶的活力單位[6]。其檢測(cè)的基本原理是在反應(yīng)體系中先產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基作用于某種化合物最終使之產(chǎn)生顏色反應(yīng)即對(duì)一定波長(zhǎng)光的特異吸收，用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。而當(dāng)反應(yīng)體系中加入待測(cè)SOD后，由于SOD的作用使應(yīng)體系中超氧陰離子自由基數(shù)量減少，分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度減少。根據(jù)這兩個(gè)吸光度值可以計(jì)算反應(yīng)體系中加入的SOD對(duì)超氧陰離子自由基的清除率從而計(jì)算出SOD的活力和比活力[7]。最初設(shè)計(jì)者設(shè)計(jì)這種方法的目的是測(cè)定SOD樣品的活性，從實(shí)驗(yàn)原理到具體操作步驟都沒(méi)有問(wèn)題，但是近年來(lái)隨著人們對(duì)抗氧化天然產(chǎn)物及食品的研究越來(lái)越有興趣，人們開(kāi)始采用這一方法測(cè)定天然產(chǎn)物或食品中SOD的活力，也有人將天然產(chǎn)物或食品飼喂動(dòng)物后測(cè)定動(dòng)物組織中SOD的活力，甚至直接檢測(cè)人體血清中SOD的活力[8-9]。但是最初設(shè)計(jì)者所設(shè)計(jì)的方法只是針對(duì)SOD樣品的，并不適用于這些天然產(chǎn)物、食品或動(dòng)物組織的測(cè)定。在一些期刊、雜志上出現(xiàn)了用這種方法對(duì)天然產(chǎn)物、食品或動(dòng)物組織測(cè)定結(jié)果的報(bào)告。實(shí)際上當(dāng)人們將天然產(chǎn)物、食品或動(dòng)物組織的提取液加入到反應(yīng)體系中去之后。由于自由基的活潑性。反應(yīng)體系中的超氧陰離子自由基不僅與樣品中的SOD發(fā)生反應(yīng)。而且與加入的組織提取液中的其他化合物同時(shí)發(fā)生反應(yīng)。按照小鼠血清中所含比例向黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD反應(yīng)體系中分別加入總蛋白、清蛋白、甘油三酯、葡萄糖、谷胱甘肽等物質(zhì)都測(cè)到“SOD活性”[10]，證明血清中的這些物質(zhì)都會(huì)給SOD的測(cè)定帶來(lái)嚴(yán)重的干擾從而使檢測(cè)結(jié)果大大的高于真實(shí)值。為了消除黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD的干擾，有必要對(duì)該方法加以改良，使其能夠運(yùn)用于對(duì)動(dòng)植物組織的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸羥胺、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、對(duì)氨基苯磺酸、甲萘胺、VC(均為分析純) 廣東西隴化工廠；還原型谷胱甘肽 上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司；SOD標(biāo)準(zhǔn)品(6000U/mg) 北京Biodee生物技術(shù)有限公司；總蛋白校準(zhǔn)液(7.0g/dL)、白蛋白校準(zhǔn)液(4.0g/dL)、甘油三脂校準(zhǔn)液(2.26mmol/L)、葡萄糖校準(zhǔn)液(5.55mmol/L) 中生北控生物科技股份有限公司。

UV2450可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋；BP211D電子天平(精度0.01mg) 德國(guó)賽多利斯公司；Plus-Pr015XXM/PL5123超純水系統(tǒng) 美國(guó)Pall Purelab公司；微量移液器。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟

實(shí)驗(yàn)通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2·)，它氧化鹽酸羥胺形成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽再與對(duì)氨基苯磺酸及甲萘胺反應(yīng)產(chǎn)生紫紅顏色化合物。當(dāng)反應(yīng)體系中加入SOD之后，催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)而減少，進(jìn)而使形成的亞硝酸鹽減少，使最終產(chǎn)生的紫紅顏色變淺，通過(guò)分光光度計(jì)在550nm波長(zhǎng)處測(cè)定加入SOD樣品管及未加SOD對(duì)照管中吸光度的變化來(lái)計(jì)算SOD的活性。顯然，加入的SOD越多其活性越高，顏色變化越顯著[11-12]。

將動(dòng)植物組織提取液裝入截留相對(duì)分子質(zhì)量為12000的透析袋中，用去離子水4℃透析4h，以除去提取液中小分子干擾物質(zhì)[13-14]。取出透析袋中樣品，準(zhǔn)確測(cè)量體積。等量取透析后的樣品兩份，其中一份作為樣品加入到反應(yīng)體系中直接用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定其SOD活力值，另一份于80℃水浴中加熱5min后作為變性樣品空白加入到反應(yīng)體系中測(cè)其所含SOD活力值。用樣品管活力測(cè)定值減去變性樣品空白管活力測(cè)定值即可扣除樣品中大分子物質(zhì)的干擾，其結(jié)果才是該樣品所含SOD所具有的真正酶活力。具體操作見(jiàn)表1。

表1 改良的黃嘌呤氧化酶法操作步驟Table 1 Experimental procedures of improved xanthine oxidase method

1.2.2 指標(biāo)的計(jì)算

1.2.2.1 對(duì)于液體樣品

SOD樣品真實(shí)比活力值/(U/mL)= SOD樣品比活力值－SOD樣品空白比活力值

1.2.2.2 對(duì)于固體樣品

SOD樣品真實(shí)比活力值/(U/g)= SOD樣品比活力值－SOD樣品空白比活力值

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱對(duì)SOD圓二色光譜的影響

通過(guò)圓二色光譜儀檢測(cè)SOD標(biāo)準(zhǔn)品在不同溫度下的結(jié)構(gòu)變化，尋找SOD變性的最低溫度條件。根據(jù)圓二色光譜儀對(duì)樣品濃度要求，配制120μg/mL的SOD標(biāo)準(zhǔn)品溶液，對(duì)該溶液在25、70℃和80℃條件下作用5min進(jìn)行光譜檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 加熱對(duì)SOD圓二色光譜的影響Fig.1 Effect of heating on circular dichroism spectrum of SOD

從圖1可以看出，70℃與未加熱SOD曲線在210～220nm之間有變化但不顯著，說(shuō)明此時(shí)SOD已經(jīng)有部分變性但不完全，而80℃在210～220nm處明顯上移，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化(變性)。因此80℃加熱5min為SOD明顯變性的最低溫度條件。

2.2 加熱對(duì)SOD活力的影響

根據(jù)圖1 SOD 變性光譜，配制15μg/mL的SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于70、80、90℃和100℃水浴5min后各取50μL加入到黃嘌呤反應(yīng)體系中，與未加熱同濃度SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液比較活力值見(jiàn)表2。

表2 SOD加熱后在黃嘌呤反應(yīng)體系中測(cè)出的酶活力(n=5)Table 2 SOD activity measured in xanthine oxides reaction system after heating (n=5)

從表2可以看出，70℃水浴5min測(cè)得的SOD活力還比較高，說(shuō)明此時(shí)SOD尚未完全失活。從80～100℃雖然仍然能夠測(cè)出SOD活性，但其數(shù)值比70℃水浴5min明顯下降。且80、90、100℃所測(cè)出的SOD活力值并沒(méi)有顯著差異。結(jié)合圖1可知，由于此時(shí)SOD已經(jīng)變性，因此所測(cè)出的“活力值”實(shí)際上并不是酶的催化作用，而是SOD肽鏈與自由基作用的結(jié)果[15-16]。因此80℃水浴5min為SOD失活的最低溫度條件，在此條件下SOD已經(jīng)變性失活，此時(shí)采用黃嘌呤反應(yīng)體系，其產(chǎn)生的自由基與變性后的蛋白質(zhì)肽鏈仍然能夠反應(yīng)，此時(shí)所測(cè)定的“活力”并不是真正的酶活性。正因?yàn)槿绱耍梢栽O(shè)計(jì)加熱變性樣品空白，以便消除非酶干擾。2.3 80℃加熱5min對(duì)血清中SOD活性的影響

為了觀察血清中的SOD在80℃加熱5min的實(shí)驗(yàn)條件下是否也變性失活，以大鼠血清作為測(cè)試樣品，配制10、20μg/mL和30μg/mL的SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液。取血清20μL，各質(zhì)量濃度SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，混合共40μL加入到黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系中，血清與3種不同質(zhì)量濃度SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液混合物分別在常溫(25℃)與80℃保溫5min條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以判斷血清中的SOD在80℃加熱5min的實(shí)驗(yàn)條件下是否也變性失活。

表3 80℃加熱5min對(duì)血清中SOD活性的影響(n=5)Table 3 Effect of heating at 80 ℃ for 5 min on serum SOD activity(n=5)

由表3可以看出，將不同質(zhì)量濃度的SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到血清中，在25℃條件下，隨著血清中標(biāo)準(zhǔn)SOD量的增加，檢測(cè)出的比活力值基本呈線性增加。而在80℃加熱5min的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)出的比活力值并不隨血清中標(biāo)準(zhǔn)SOD量的增加而顯著增加，且“活力值”也遠(yuǎn)低于25℃實(shí)驗(yàn)條件的測(cè)定結(jié)果，說(shuō)明80℃保溫5min可以讓血清中的SOD變性失活。

2.4 加熱對(duì)血清中主要干擾物質(zhì)的影響

從2.2節(jié)可知，80℃水浴5min為SOD失活的最低溫度條件，在此條件下SOD已經(jīng)變性失活，但作為樣品空白則需要樣品中的干擾物質(zhì)在此實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)黃嘌呤反應(yīng)體系的干擾不發(fā)生變化。為此進(jìn)一步考察加熱對(duì)血清中主要干擾物質(zhì)的影響。選擇血清中含量較高且對(duì)黃嘌呤反應(yīng)體系有嚴(yán)重干擾的白蛋白、總蛋白、甘油三酯、葡萄糖和谷胱甘肽進(jìn)行加熱實(shí)驗(yàn)，觀察80℃水浴5min對(duì)這些干擾物的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃嘌呤氧化酶法測(cè)出的5種物質(zhì)SOD比活力(n=5)Table 4 Specific activities of SOD in 5 substances detected by xanthine oxidase method (n=5)

由表4可知，白蛋白、總蛋白、甘油三酯、葡萄糖和谷胱甘肽在加熱后與未加熱加入到黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系中所測(cè)定出的SOD比活性變化不大。因此證實(shí)可以將80℃水浴加熱5min作為制備樣品空白的實(shí)驗(yàn)條件。之所以尋找最低變性溫度是防止溫度過(guò)高對(duì)那些干擾物質(zhì)發(fā)生作用。而上述結(jié)果證明在80℃水浴5min的條件下血清中主要干擾物質(zhì)對(duì)SOD檢測(cè)體系的影響與不加熱沒(méi)有很大區(qū)別，因此可以作為樣品空白。

用不加熱的樣品管測(cè)定值減去加熱樣品管的測(cè)定值就能夠?qū)⒀逯兄饕蓴_物質(zhì)的影響扣除掉。而像VC這類小分子物質(zhì)則在實(shí)驗(yàn)一開(kāi)始就已經(jīng)通過(guò)透析的方法除去了。

2.5 加樣順序?qū)悠分兄饕蓴_物質(zhì)的影響

能否采用改變加樣順序的方法制備樣品空白進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：取等量白蛋白(4.0g/dL)、總蛋白(7.0g/dL)、甘油三酯(2.26mmol/L)、葡萄糖(5.55mmol/L)和谷胱甘肽(40mg/L)混合，取20μL混合液分別在黃嘌呤氧化酶法水浴前(酶作用前)和水浴后(酶作用后)加入到反應(yīng)體系中，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 改變干擾物的加樣順序測(cè)出的SOD活力值(n=5)Table 5 SOD activity detected under the changed addition order of interferences (n=5)

從表5可以看出，在恒溫水浴40min后(酶反應(yīng)后)加入干擾物所測(cè)出的SOD活力值比水浴前(酶反應(yīng)前)明顯降低。說(shuō)明干擾物質(zhì)在黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系中作用的時(shí)間與生成的顏色有關(guān)，因此不能設(shè)計(jì)采用改變加樣順序的樣品空白。

2.6 兩種方法準(zhǔn)確性比較

取白蛋白(4.0g/dL)、總蛋白(7.0g/dL)、甘油三酯(2.26mmol/L)、葡萄糖(5.55mmol/L)和谷胱甘肽(40mg/L)各200μL混合作為樣品中的干擾物質(zhì)，然后加入1mL 15μg/mL的SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液，將該混合物分為兩份，一份用改良法測(cè)定樣品所含SOD比活力值，另一份用不經(jīng)改良的原方法測(cè)定樣品SOD比活力值。同時(shí)測(cè)定未加干擾物同一濃度SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液的比活力值，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 兩種方法準(zhǔn)確性比較(n=5)Table 6 Comparison of the accuracy determined by two methods (n=5)

從表6可知，改良的方法能夠通過(guò)制備樣品空白扣除樣品中雜質(zhì)的干擾，其檢測(cè)結(jié)果比原方法準(zhǔn)確得多。

2.7 兩種方法測(cè)定大鼠血清SOD活力的比較

取大鼠血清30μL分別用改良法和不經(jīng)改良的原方法測(cè)定樣品所含SOD比活力值，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 兩種方法測(cè)定大鼠血清SOD比活力結(jié)果比較(n=5)Table 7 Comparison of serum SOD specific activities in rats determined by two methods (n=5)

從表7結(jié)果可以看出，由于原方法沒(méi)有將大鼠血清中干擾物質(zhì)扣除掉因此測(cè)定結(jié)果比改良后的方法高了38%。

2.8 兩種方法測(cè)定大鼠肝臟SOD活力的比較

取大鼠肝臟，勻漿，分別取離心后的勻漿液20μL用改良法和不經(jīng)改良的原方法測(cè)定樣品所含SOD比活力值，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 兩種方法測(cè)定大鼠肝臟SOD比活力結(jié)果比較(n=5)Table 8 Comparison of SOD specific activities in rat liver tissues determined by two methods (n=5)

從表8可以看出，由于原方法沒(méi)有將大鼠肝臟中干擾物質(zhì)扣除掉因此測(cè)定結(jié)果比改良后的方法高了45%。

2.9 兩種方法測(cè)定香蕉中SOD活力的比較

取一定量香蕉加水勻漿，分別取離心后的勻漿液用改良法和不經(jīng)改良的原方法測(cè)定樣品所含SOD比活力值，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 兩種方法測(cè)定香蕉中SOD比活力結(jié)果比較(n=5)Table 9 Comparison of SOD specific activities in banana determined by two methods (n=5)

從表9可以看出，由于原方法沒(méi)有將香蕉中干擾物質(zhì)扣除掉因此測(cè)定結(jié)果比改良后的方法高了35倍。

3 討 論

3.1 SOD經(jīng)過(guò)80℃、5min的加熱后，結(jié)構(gòu)有明顯變化。由于SOD分子較小，其結(jié)構(gòu)的改變對(duì)功能的影響很大。結(jié)合不同溫度對(duì)SOD活性影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，當(dāng)加熱溫度從80℃再向上升高，測(cè)出的SOD比活力值基本不變，因此可以認(rèn)為SOD經(jīng)過(guò)80℃、5min的加熱后基本失去催化功能。所以用80℃、5min 作為讓樣品中SOD變性失活的最低溫度條件。且80℃加熱5min能夠讓血清中的SOD變性失活。

3.2 80℃、5min的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)血清中主要物質(zhì)白蛋白、總蛋白、甘油三酯、葡萄糖和谷胱甘肽在黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中的干擾作用沒(méi)有影響，而SOD在該條件下則會(huì)變性失活。所以可以通過(guò)加熱制作一個(gè)樣品空白，用不加熱的樣品測(cè)得的SOD比活力值減去樣品空白，即可扣除樣品中雜質(zhì)的干擾，使得到的SOD活力值更接近樣品中SOD的真實(shí)活力值。

3.3 通過(guò)兩種方法準(zhǔn)確度比較實(shí)驗(yàn)可以看出，改良方法雖然可以達(dá)到去除干擾的目的，但采用這種扣除樣品空白的方法還是會(huì)有一定誤差。不過(guò)對(duì)于現(xiàn)有方法來(lái)說(shuō)，已經(jīng)能使測(cè)定的結(jié)果更接近樣品所含SOD真實(shí)活性。通過(guò)對(duì)大鼠血清、肝臟和香蕉的SOD活力測(cè)定，可以看到樣品空白測(cè)得的SOD比活力還是相當(dāng)大的，所以說(shuō)本方法對(duì)于去除干擾物質(zhì)對(duì)黃嘌呤反應(yīng)體系的影響是有效的而可行的。

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Determination of SOD Specific Activity in Animal and Plant Tissues by Improved Xanthine Oxidase Method

XU Dong，ZHAO Jian，HUANG Han-chang，WEN Jing*
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

In order to minimize the interference in xanthine oxidase method for the determination of superoxide dismutase (SOD)activity in animal and plant tissues, the xanthine oxidase method was modified. The optimal experimental conditions for preparing bank samples were explored by measuring the activity and circular dichroism spectrum of SOD. A heated sample was designed as the experimental blank. Subtraction rule was used to eliminate the interference of other substances in xanthine oxidase system. Standard addition recovery experiments and actual determination of SOD activity in animal and plant tissues were used to compare the method with and without modification. Results indicated that the improved xanthine oxidase method could result in more accurate determination of SOD activity in animal and plant tissues.

xanthine oxidase method；sample blank；SOD activity determination

TS207.3

A

1002-6630(2011)06-0237-05

2010-04-19

北京市教委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室引導(dǎo)基金項(xiàng)目(21202543503)

徐東(1985—)，男，助理工程師，學(xué)士，主要從事保健食品功能評(píng)價(jià)研究。E-mail：xudong7879@sohu.com

*通信作者：文鏡(1952—)，男，教授，學(xué)士，主要從事保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)機(jī)理和方法學(xué)研究。E-mail：wenjing@ygi.edu.cn