超聲波輔助酶解法提取五味子乙素

陰冠秀，杜 冰,*，華洋林，趙小艷，楊公明

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.無限極(中國)有限公司，廣東 廣州 510665)

超聲波輔助酶解法提取五味子乙素

陰冠秀1，杜 冰1,*，華洋林2，趙小艷2，楊公明1

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.無限極(中國)有限公司，廣東 廣州 510665)

以五味子干果為原料，采用酶解法輔助超聲波技術(shù)提取其中的五味子乙素。單因素試驗結(jié)果表明，酶解溫度、酶解時間以及酶用量對乙素得率的影響較大。通過響應(yīng)面回歸分析，得到酶解輔助超聲波提取乙素的優(yōu)化工藝條件為酶解溫度52.89℃、提取時間4.04h、酶用量0.96%。在此最優(yōu)條件下，五味子乙素的得率為0.262%。

五味子乙素；酶解提?。怀暡?；響應(yīng)面試驗；高效液相色譜法

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandra chinesnsis(Turcz) Baill]的干燥成熟果實，因其產(chǎn)地的不同，又有南北五味子之分，都具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[1-2]。五味子對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等具有多種藥理作用[3]?，F(xiàn)代研究證明，五味子生物活性成分主要是木脂素類的物質(zhì)，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，還具有抗艾滋病毒、抗癌和PAF拮抗等多種活性，并且其對清除自由基也有一定的效果等[4]。五味子木脂素又包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素等[5]。而五味子乙素在木脂素中的含量較高，其具有抗氧化、清除自由基、降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、抗癌、抑菌等作用[6-10]。

五味子乙素的提取研究主要是采用溶劑提取、超聲波、微波提取和超臨界CO2提取等[11-15]。利用有機溶劑提取乙素存在能耗高、溶劑消耗大、周期長、工序多、提取率不高等問題。采用微波機超聲波提取乙素，具有時間短、能耗少、得率較高的優(yōu)點，但難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。超臨界CO2萃取，設(shè)備較復(fù)雜、投資成本高，操作較復(fù)雜，且儀器運行成本較高。因此，開發(fā)高效率、無污染的提取五味子乙素的方法已成為研究的重點。有研究成果表明，將酶法與超聲、微波等現(xiàn)代提取技術(shù)結(jié)合用于中藥提取，可以達到節(jié)能、高效的目的[11]。故本實驗以五味子干果為樣品，研究超聲波輔助酶解法對五味子乙素提取率的影響，為酶解制備五味子乙素粗提液的工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

五味子藥材 無限極(中國)公司；五味子乙素對照品(批號110765-200407) 中國藥品生物制品鑒定所；纖維素酶(1400U/mg)、果膠酶(500U/mg) 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；甲醇(色譜純) 美國Fisher公司；自制超純水；其余試劑均為分析純。

LC-10AT型高效液相色譜儀、SPD-10Avp紫外檢測器 日本島津公司；四兩裝高速中藥粉碎機 瑞安市環(huán)球藥械廠；電子精密天平、pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；SH2-88臺式水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 反相高效液相色譜檢測條件

色譜柱：C18(250mm×4.6mm)；流動相：甲醇-水(73:27，V/V)；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm；柱溫：室溫；進樣量：2 0μL。

1.2.2 五味子乙素提取工藝流程

五味子干果→除雜→粉碎→五味子粉→加酶→加一定體積的蒸餾水→調(diào)pH值→酶解→加一定體積的無水乙醇→超聲波提取→過濾→定容→待測

1.2.3 標準曲線的繪制

精密稱取五味子乙素對照品20mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.20mg/mL的標準品儲液備用。分別精密吸取一定體積上述標準溶液，定容到10mL的容量瓶中，制備成0.01～0.14mg/mL質(zhì)量濃度梯度的溶液，分別吸取以上溶液20 μL，注入液相色譜儀中，得到掃描曲線圖[16]。如圖1所示。

圖1 五味子乙素標準品掃描圖Fig.1 HPLC chromatogram ofγ-schizandrin standard

以五味子乙素對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，檢測后得到回歸方程為：y=4×107x－17594，R2=0.9996。表明在0.01～0.14mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.4 五味子乙素得率計算

由1.2.3節(jié)中標準曲線可以得到：

1.2.5 單因素對五味子乙素得率的影響

五味子干果經(jīng)過除雜、粉碎后酶解：分別加入果膠酶、纖維素酶、復(fù)合酶(纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為1:1)進行酶解；分別調(diào)節(jié)酶解液pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0進行酶解；分別在溫度35、40、45、50、5 5、6 0℃進行酶解；在酶解時間1、2、3、4、5 h進行酶解；分別取酶用量0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%進行酶解。分別選取以上單因素進行酶解預(yù)處理試驗，酶解后加入一定量的乙醇后超聲提取30min，過濾后定容待測。

1.2.6 響應(yīng)面試驗優(yōu)化方案

采用響應(yīng)面法進行試驗數(shù)據(jù)處理，選用B o x-Behnken模型對影響酶解輔助超聲波法提取五味子中五味子乙素得率的因素進行響應(yīng)面設(shè)計，以五味子乙素的含量為響應(yīng)值進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

圖2 不同酶種類對乙素得率的影響Fig.2 Effect of enzyme type on extraction rate ofγ-schizandrin

2.1.1 最佳酶種類的確定由圖2可知，加酶組的乙素得率要高于空白對照組的。通過對加酶組的比較可以看出，采用果膠酶對其進行預(yù)處理的作用高于纖維素酶和復(fù)合酶，這是因為五味子木脂素主要存在于五味子的種子中[17]，并且常常與樹脂類的物質(zhì)共存，故使用果膠酶對乙素提取的效果較好，之后實驗均采用果膠酶進行酶解預(yù)處理。

2.1.2 酶解液pH值對五味子乙素得率的影響

圖3 酶解液pH值對乙素得率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction rate ofγ-schizandrin

由圖3所示，隨著pH值的提高乙素得率逐漸降低。所購果膠酶的pH值適用范圍是2.5～6.0，其最適pH值為3.5，當pH＞3.5時，酶活力會隨著pH值的增大而逐漸減小甚至失活，此時乙素的得率也會降低。

2.1.3 酶解溫度對五味子乙素得率的影響

圖4 酶解溫度對乙素得率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on extraction rate ofγ-schizandrin

由圖4可知，酶解溫度對乙素得率有較大影響，隨著酶解溫度的提高，乙素得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，所購果膠酶作用的溫度范圍是15～55℃，其最適為50℃。在最適溫度作用下，乙素得率達到最大。低于50℃時，酶的活性較低，使得水解度較低，從而使乙素得率也較低；當酶解溫度高于50℃時，導(dǎo)致部分果膠酶失活，乙素得率隨之降低。說明50℃是最佳的酶解溫度。

2.1.4 酶解時間對五味子乙素得率的影響

圖5 酶解時間對乙素得率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on extraction rate ofγ-schizandrin

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，乙素得率隨之提高。酶解時間在1～4h內(nèi)，乙素得率增加明顯；4h后繼續(xù)延長酶解反應(yīng)時間，乙素得率提高并不明顯，得率基本趨向穩(wěn)定。原因是隨著加熱時間延長，酶可能部分失活，酶的總活力下降，從而導(dǎo)致乙素得率降低。因此酶解反應(yīng)最佳時間為3～5h。

2.1.5 酶用量對五味子乙素得率的影響

圖6 酶用量對乙素得率的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage on extraction rate ofγ-schizandrin

由圖6可知，酶用量對乙素得率有明顯的影響。在一定范圍內(nèi)，乙素提取率隨酶用量的增加而先增加后降低。在酶用量0.9%時，乙素得率達到最高值0.197%，之后得率略有降低，故確定酶用量為0.7%～1.1%。

在傳感器網(wǎng)絡(luò)的各種應(yīng)用中，監(jiān)測到事件之后關(guān)心的一個重要問題就是該事件發(fā)生的位置[3]。如在城市交通應(yīng)用中需要知道交通堵塞信息所對應(yīng)的具體區(qū)域位置；在反恐救災(zāi)中需要知道災(zāi)害發(fā)生的現(xiàn)場位置等。在判斷結(jié)果位置前，傳感器節(jié)點必須要先精確定位自身所在的位置，然后才能為最終的結(jié)果判定提供依據(jù)。但是，在傳感器網(wǎng)絡(luò)中，傳感器節(jié)點往往是處于移動的狀態(tài)，如何在移動狀態(tài)下能夠精確定位出節(jié)點的位置信息，成為了大家關(guān)心熱點。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

綜合單因素試驗結(jié)果，故選取酶解溫度、時間、酶用量3個因素，在單因素基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗選用Box-Behnken模型，試驗因素與水平設(shè)計見表1[18]。

表1 響應(yīng)面分析因素水平Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Scheme and results of Box-Behnken design

表3 回歸方程模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

表4 回歸方程中回歸系數(shù)估計值Table 4 Regression coefficient estimates of regression equation

利用Design Expert 7.1.3軟件建立的試驗設(shè)計結(jié)果見表2。對表2中數(shù)據(jù)進行回歸分析，得

Y=0.26＋2.750×10-3A＋3.625×10-3B＋3.785×10-3C－2.750×10-3AB＋5.250×10-3AC－8.000×10-3BC－7.167×10-3A2－7.417×10-3B2－8.917×10-3C2

由表4回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知，模型的一次項B(時間)、C(酶用量)顯著，A(溫度)不顯著；二次項C2極顯著，而A2、B2顯著；交互項BC極顯著，AC顯著，AB不顯著。表明各影響因素對于乙素得率不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)面分析與最優(yōu)條件的確定

酶解輔助超聲波法提取五味子乙素的響應(yīng)面分析與優(yōu)化模型的結(jié)果見圖7。3組圖直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響。

圖7 各兩因素對乙素得率的響應(yīng)面圖和等高線Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction among hydrolysis time, enzyme dosage and hydrolysis temperature on extraction rate ofγ-schizandrin

由圖8a、8b可以看出，當酶解溫度不變時，隨著酶解時間的延長，乙素得率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢；當酶解時間不變時，隨著酶解溫度的升高，乙素得率也呈現(xiàn)出先增大后下降的趨勢。這與單因素實驗時的分析結(jié)果相同，從乙素得率的變化速度來看，酶解時間的主效應(yīng)大于酶解溫度。由圖8c可以看出，酶用量與酶解時間對乙素提取率有顯著影響，乙素得率隨酶解時間、酶用量的增加而增大。比較3組圖可知，酶用量的影響為最顯著因素，表現(xiàn)為等高線更為陡峭；時間影響次之，表現(xiàn)為等高線曲線較平滑，說明其對響應(yīng)值影響較小[19]。

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化五味子乙素的提取工藝，對方程求導(dǎo)得到最佳工藝條件為A=52.89、B=4.04、C=0.96，即溫度52.89℃、提取時間4.04h、酶用量0.96%，在此工藝條件下重復(fù)實驗3次，乙素的平均得率為0.262%，高于表2中的任一試驗組合，證明了用響應(yīng)面分析法得到的最佳工藝條件的可靠性。

3 結(jié) 論

3.1 采用試驗設(shè)計軟件Design Expert 7.1.3，通過Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計得到了酶解輔助超聲波法提取五味子乙素的得率與酶解時間、溫度及酶用量關(guān)系的回歸模型，經(jīng)驗證該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測酶解輔助超聲波法提取五味子乙素的得率。

3.2 利用模型的響應(yīng)面及等高線，對影響酶解輔助超聲波法提取五味子乙素的關(guān)鍵因素及相互作用進行探討，得到的優(yōu)化工藝參數(shù)：酶解溫度52.89℃、提取時間4.04h、酶用量0.96%；在此工藝條件下驗證實驗，乙素得率為0.262%。利用響應(yīng)面分析方法對酶解輔助超聲波法提取五味子乙素的工藝條件進行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，從而為進一步的實驗研究提供依據(jù)。

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Ultrasound-assisted Enzymatic Extraction ofγ-Schizandrin fromSchisandra chinesnsis(Turcz) Baill

YIN Guan-xiu1，DU Bing1,*，HUA Yang-lin2，ZHAO Xiao-yan2，YANG Gong-ming1
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；2. Infinitus (China) Company Ltd., Guangzhou 510665, China)

In this study,Schisandra chinesnsis(Turcz) Baill was used as the raw material to extractγ-schizandrin by ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis. Single-factor experiments indicated that extraction rate ofγ-schizandrin was greatly affected by hydrolysis temperature, hydrolysis time and enzyme dosage. The optimal extraction conditions were explored by response surface analysis to be hydrolysis temperature of 52.89 ℃, extraction time of 4.04 h, and enzyme dosage of 0.96%. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate ofγ-schizandrin was up to 0.262%.

γ-schizandrin；enzymatic hydrolysis；ultrasound；response surface analysis；high performance liquid chromatography (HPLC)

R284.2

A

1002-6630(2011)06-0115-05

2010-05-07

陰冠秀(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：yin.gx@163.com

*通信作者：杜冰(1973—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：gzdubing@163.com