酒花黃酮提取工藝和含量測定

李 敏，楊建華，李 淵，胡君萍,*

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011)

酒花黃酮提取工藝和含量測定

李 敏1，楊建華2，李 淵1，胡君萍1,*

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011)

建立酒花黃酮的提取方法和含量測定方法。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法，以蘆丁為對照品，通過單因素試驗和L9(34)正交設(shè)計確定酒花黃酮的提取方法，并測定和比較酒花、酒糟和啤酒中黃酮的含量。結(jié)果表明：酒花黃酮提取方法為樣品加入50倍的甲醇，超聲提取2次，每次1h，酒花黃酮含量為69.98mg/g，酒糟和啤酒中黃酮的含量較低。對照品蘆丁在10.2～40.8μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，平均回收率99.33%，RSD=3.60%。該提取方法合理，含量測定方法簡便、快速、準確，可用于酒花黃酮提取物制備及其質(zhì)量控制。

酒花；黃酮；提取工藝；含量測定

啤酒花Humulus lupulusL.是?？?Moraceae)葎草屬(HumulusLinn.)多年生草質(zhì)蔓生藤本植物，其雌性球穗花序簡稱酒花[1]。酒花是一種使用歷史悠久的藥食同源植物，不僅用于啤酒的釀制，還具有抗菌和鎮(zhèn)靜作用，傳統(tǒng)醫(yī)學用作結(jié)核病、麻風病、神經(jīng)衰弱癥的治療[2-3]。酒花原產(chǎn)歐洲，主產(chǎn)地分布于美國、歐洲、澳大利亞、南美洲和中國，我國新疆天山、阿爾泰山的山坡林間有大量野生分布，在東北、華北有栽培[4]。酒花富含樹脂、揮發(fā)油、多酚、黃酮等多種生物活性成分，其中黃酮類成分(酒花黃酮)是代表酒花多種生物活性的一類重要物質(zhì)。酒花黃酮包括黃

酮醇糖苷和異戊二烯查爾酮兩類，前者主要包括黃芪苷、異槲皮素、蕓香苷、山柰酚苷等成分，具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等活性[5]；后者包括黃腐酚、異黃腐酚、異戊二烯基柚皮素等成分，為酒花所特有，具有預(yù)防癌癥和抑制癌細胞擴增[6-9]、抗病毒[10]、抗菌[11]、抗氧化[12]及雌激素樣作用[13]。酒花黃酮結(jié)構(gòu)類型多樣、生物活性顯著、在啤酒花中含量高、藥食用途廣泛，顯示了良好的開發(fā)利用前景。新疆是酒花的主產(chǎn)區(qū)，酒花資源豐富，但其藥用價值尚未得到有效開發(fā)。本實驗建立酒花黃酮的提取工藝和含量測定方法，比較不同酒花樣品的黃酮含量，為進一步制備酒花黃酮提取物及其功能性開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

顆粒酒花(產(chǎn)地新疆吉木薩爾縣)經(jīng)新疆醫(yī)科大學藥學院胡君萍副教授鑒定為啤酒花Humulus lupulusL.；啤酒花及酒糟樣品干燥，粉碎，過40目篩，冷藏備用。顆粒酒花、酒糟、啤酒 新疆烏蘇啤酒廠。

蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、9 5%乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮(均為分析純)。

ST-02A型多功能粉碎機 永康帥通工具有限公司；AB104-N電子天平 上海Mettler Toledo公司；SX721分光光度計 山東高密分析儀器廠；KQ300DE型數(shù)控超聲清洗機(功率300W，頻率400kHz) 昆山市超聲儀器有限公司；KD-S2.4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 酒花黃酮測定原理[14]

在黃酮類化合物溶液中加入鋁離子試劑后，黃酮類化合物中的酚羥基與鋁離子生成絡(luò)合物，控制適宜的pH值，所生成的絡(luò)合物在可見區(qū)能獲得特征吸收峰，其質(zhì)量濃度與吸光度符合比爾定律，其顏色深淺與黃酮類化合物的量成一定的比例關(guān)系，可以定量測定。

1.2.2 對照品溶液的配制

精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁對照品25.5mg，置于50mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度0.51mg/mL的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取顆粒酒花粉末1g、酒糟粉末3g，加入50倍體積的甲醇溶液，超聲提取2次，每次1h，過濾，合并濾液，濃縮，定容至50mL，搖勻，即分別制得酒花供試品溶液和酒糟供試品溶液。

啤酒臨用前超聲20min去除泡沫，即得啤酒供試品溶液(每100mL啤酒的質(zhì)量為4.1382g)。

1.2.4 測定波長的選擇

精密吸取酒花供試品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.3mL，搖勻，放置6min后加入10% Al(NO3)3溶液0.3mL，放置6min，再加入10%NaOH溶液4.0mL，搖勻，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。以溶劑代替供試品溶液同法制備空白對照，15min后掃描200～800nm波長范圍的吸光度，確定最大吸光度在510nm，因此分光光度法選擇510nm為測定波長。

1.2.5 標準曲線的制備

精密量取蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于10mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液0.3mL，搖勻，放置6min后加入10% Al(NO3)3溶液0.3mL，放置6min，再加入10% NaOH溶液4.0mL，搖勻，用溶劑稀釋至刻度，15min于波長510nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標、吸光度A為縱坐標，建立標準曲線，得回歸方程：A=0.0108C－0.023，r=0.9985，表明蘆丁在10.2～40.8μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

1.2.6 精密度實驗

精密吸取酒花供試品溶液0.3mL，按1.2.5節(jié)方法測定吸光度6次，其RSD為2.46%。

1.2.7 穩(wěn)定性實驗

精密吸取酒花供試品溶液0.3mL，按1.2.5節(jié)方法，每隔0.5h測定1次吸光度，共測5次，計算吸光度的RSD為1.33%，表明顯色液在2.5h內(nèi)較穩(wěn)定。

1.2.8 重復(fù)性實驗

精密吸取0.3mL酒花供試品溶液6份，按1.2.5節(jié)方法測定吸光度，計算結(jié)果的RSD為2.00%。

1.2.9 回收率實驗

精密吸取酒花供試品溶液9份各0.15mL，分別加入對照品溶液(0.51mg/mL)0.2、0.4、0.6mL，按1.2.5節(jié)方法測定吸光度，計算回收率和RSD。結(jié)果見表1。

表1 回收率實驗結(jié)果Table 1 Results of recovery rate experiments

1.2.10 酒花黃酮提取工藝優(yōu)化

在建立酒花黃酮含量測定方法的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗篩選了酒花黃酮的5種提取溶劑(水、乙醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯)和4種提取方法(冷浸法、回流法、索式提取法和超聲法)；并采用L9(34)正交設(shè)計，考察了溶劑體積、提取時間和提取次數(shù)對酒花黃酮含量的影響，優(yōu)化并確定了酒花黃酮的最佳提取工藝。

1.2.11 樣品中黃酮含量測定

按1.2.3節(jié)分別制備酒花、酒糟和啤酒供試品溶液各6份，精密吸取酒花供試品溶液0.3mL、酒糟供試品溶液4.0mL、啤酒供試品溶液4.0mL，按1.2.5節(jié)方法測定吸光度，代入回歸方程計算各供試品中黃酮的含量[黃酮含量/(mg/g)=CDV/m×100，其中C為樣品溶液質(zhì)量濃度/(μg/mL)，V為樣品溶液稀釋后總體積/mL，D為樣品稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量/g]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒花黃酮提取工藝的篩選

2.1.1 提取溶劑的選擇

精密稱取顆粒酒花粉末1g共10份，分別加入水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯各5 0 m L，超聲提取30min，過濾。精密吸取濾液1.0mL，按1.2.5節(jié)方法測定吸光度，另取25mL濾液濃縮干燥，計算浸膏得率[浸膏得率/%= 浸膏質(zhì)量×2/樣品質(zhì)量×100]。結(jié)果見表2。

表2 不同溶劑提取液的吸光度和提取率(n=2)Table 2 Absorbance and extraction rates of the extracts using different extraction solvents (n=2)

由表2可知，各溶劑對酒花黃酮提取率差異明顯，以甲醇溶液的吸光度和浸膏得率為高，因此選擇甲醇為酒花黃酮的提取溶劑。

2.1.2 提取方法的選擇

精密稱取顆粒酒花樣品粉末適量，加入50倍量甲醇溶液，分別采用冷浸法(室溫浸泡30min)、回流法(75℃水浴回流30min)、索式提取法(75℃水浴至提取液無色)和超聲法(超聲30min)提取，提取液冷卻至室溫，補足質(zhì)量損失，過濾。分別取濾液1.0mL，按1.2.5節(jié)方法測定吸光度，另取25mL濾液濃縮干燥，計算浸膏得率。結(jié)果見表3。

表3 不同提取方法所得提取液的吸光度和提取率(n=2)Table 3 Absorbance and extraction rates of the extracts using different extraction methods (n=2)

結(jié)果表明，上述提取溶液中以超聲法吸光度略高，而回流法浸膏得率略高，考慮到超聲法簡便易行，故采用超聲法提取酒花黃酮。

2.1.3 酒花黃酮提取工藝優(yōu)化

在以上單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9(3)4正交設(shè)計(表4)，確定酒花黃酮最佳提取工藝。精密稱取酒花樣品粉末各1g，以甲醇為提取溶劑，采用超聲提取法，優(yōu)選溶劑體積、提取時間和提取次數(shù)，提取液過濾，濾液濃縮并定容至50mL。精密吸取上述溶液0.3mL，按1.2.5節(jié)方法測定吸光度，按回歸方程計算黃酮的含量。結(jié)果見表5。

表4 酒花黃酮提取正交試驗的因素和水平Table 4 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing the extraction conditions of flavonoids

表5 酒花黃酮提取正交試驗結(jié)果(n=2)Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for optimizing the extraction conditions of flavonoids (n=2)

由表5極差分析可得，各因素對黃酮提取工藝的影響順序為B(提取時間)＞C(提取次數(shù))＞A(溶劑體積)，酒花黃酮最佳提取工藝A2B2C2，即精密稱取供試品粉末適量，加入50倍體積甲醇溶液、超聲提取2次、每次1h。

2.2 樣品中黃酮含量測定

分別制備酒花、酒糟和啤酒供試品溶液，按1.2.10節(jié)方法測定各供試品中的黃酮含量。實驗結(jié)果見表6。結(jié)果表明，上述3種樣品中，顆粒酒花黃酮含量最高，其次為商品啤酒，而酒糟中黃酮含量很低。

表6 3種供試品中的黃酮含量(n=6)Table 6 Contents of total flavonoids in three samples (n=6)

3 結(jié) 論

本研究采用單因素和正交試驗確定了酒花黃酮的提取工藝，即精密稱取供試品粉末適量，加入50倍體積甲醇溶液、超聲提取2次、每次1h。并以蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定顆粒酒花、酒糟和啤酒中黃酮的含量，方法操作簡便、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，對設(shè)備要求低，是檢測酒花黃酮的可靠方法。

啤酒釀造企業(yè)使用的酒花制品有全酒花、酒花粉、顆粒酒花、酒花浸膏、酒花油制品等[15]。本實驗的研究對象顆粒酒花是世界上使用最廣泛的酒花制品，它是將粉碎至一定規(guī)格的粉狀酒花壓制成直徑為2～8mm，長約15mm的短棒，充以惰性氣體并包裝，因此顆粒酒花能有效防止酒花中有效成分的氧化和損失。酒花黃酮是酒花多酚的重要組成部分[16]，本研究結(jié)果表明，顆粒酒花、酒糟和啤酒3種酒花樣品的黃酮含量差異很大，其中顆粒酒花黃酮含量最高，達69.98mg/g，而酒糟中黃酮含量極低，不足顆粒酒花的1%。

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Optimization of Extraction Process and Content Determination of Total Flavonoids inHumulus lupulusL.

LI Min1，YANG Jian-hua2，LI Yuan1，.H.UJun-ping1,*
(1. College of Pharmacy, Xinjiang Medical University,..830011, China；2. Affiliated Tumor Hospital, Xinjiang Medical University, 830011, China)

Ultrasonic extraction conditions for total flavonoids fromHumulus lupulusL. were optimized by single factor experiments and orthogonal design with the aim of establishing a sample preparation method for determination of the content of total flavonoids inHumulus lupulusL. by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method using rutin as the reference. The optimal extraction process parameters were material-to-liquid ratio of 1:50, extraction duration of 1 h and repeated extraction number of 2. The content of total flavonoids fromHumulus lupulusL. was 69.98 mg/g under the optimal extraction conditions, which was much higher than that of residues and beer. The linear range was between 10.2 μg/mL and 40.8 μg/mL with a correlation coefficient of 0.9985. The average recovery rate was 99.33% with a relative standard deviation of 3.60%. The extraction and determination methods were simple and feasible, which is suitable for the preparation and quality control of flavonoids extracted fromHumulus lupulusL.

Humulus lupulusL.；total flavonoids；extraction；determination

O623.54

A

1002-6630(2011)06-0016-04

2010-04-18

新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計劃重點項目(XJEDU2009I24)

李敏(1983—)，女，講師，碩士，主要從事天然藥用植物資源的開發(fā)與利用研究。E-mail：hjp-yft@163.com

*通信作者：胡君萍(1971—)，女，副教授，博士，主要從事新疆特色藥用資源的開發(fā)與利用研究。E-mail：yjh-yft@163.com