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    普洱茶茶色素提取工藝條件的響應(yīng)面分析及其抗氧化性活性研究

    2011-10-13 08:06:58楊新河黃建安劉仲華
    食品科學(xué) 2011年6期
    關(guān)鍵詞:液料普洱茶色素

    楊新河,李 勤,黃建安,陸 英,沈 智,劉仲華,*

    (1.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.孝感學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 孝感432000;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

    普洱茶茶色素提取工藝條件的響應(yīng)面分析及其抗氧化性活性研究

    楊新河1,2,李 勤1,3,黃建安1,3,陸 英1,3,沈 智1,3,劉仲華1,3,*

    (1.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.孝感學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 孝感432000;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

    目的:優(yōu)化普洱茶茶色素的提取工藝及研究其抗氧化性活性。方法:以與蒸餾水的色差作為普洱茶茶色素提取的評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法,對(duì)普洱茶茶色素提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化;以清除1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH自由基)的能力評(píng)價(jià)普洱茶茶色素的抗氧化性活性。結(jié)果:普洱茶茶色素提取的最佳工藝條件為液料比45:1(mL/g)、提取溫度100℃、提取時(shí)間150min、色差52.97,高出單因素試驗(yàn)和Box-Behnken組合中的最高色差4.73%;普洱茶茶色素清除DPPH自由基的IC50值30.83μg/mL。結(jié)論:采用響應(yīng)曲面法對(duì)普洱茶茶色素提取條件進(jìn)行優(yōu)化可行;普洱茶茶色素具有良好的抗氧化作用,可作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。

    普洱茶;茶色素;提??;響應(yīng)面分析;抗氧化性活性

    普洱茶是以云南省一定區(qū)域內(nèi)的云南大葉種曬青毛茶為原料,經(jīng)過(guò)后發(fā)酵加工成的散茶和緊壓茶[1]。研究表明,普洱茶具有降血脂、降血糖、抗突變、防癌及防治心血管疾病等功能[2-13]。普洱茶藥理作用的主要成分是茶多酚、茶色素和茶多糖等[1]。普洱茶茶色素是指從普洱茶中提取的一類(lèi)水溶性酚性色素,屬于天然色素,包括茶黃素類(lèi)(TFs)、茶紅素類(lèi)(TRs)和茶褐素類(lèi)(TBs),其中茶褐素類(lèi)是其主體成分。而茶褐素類(lèi)比茶紅素類(lèi)更復(fù)雜,為高聚物,極性很大,分離純化的難度極大,根本不清楚其組成、性質(zhì)及分離制備等,急需開(kāi)展茶褐素類(lèi)的相關(guān)研究?,F(xiàn)有一些研究初步表明:普洱茶茶色素具有防癌抗癌、防紫外線(xiàn)照射、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥效,產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)可廣泛用于醫(yī)藥和食品工業(yè)[14]。但普洱茶茶色素的藥理作用機(jī)理并不清楚、新的功效有待挖掘,應(yīng)用領(lǐng)域需要拓展。因此,如何有效充分提取普洱茶茶色素是深入研究其化學(xué)成分、構(gòu)效關(guān)系及產(chǎn)生更大經(jīng)濟(jì)效益等諸多方面的前提。

    目前,茶葉中色素類(lèi)物質(zhì)TFs、TRs和TBs的含量采用系統(tǒng)分析法測(cè)定[15],但此方法不能夠?qū)嵘氐男ЧM(jìn)行快速評(píng)價(jià)。而色差E測(cè)量原理采用最廣泛使用于測(cè)量物體色調(diào)的CIEL*a*b*顏色空間(即色度空間)系統(tǒng)。所有的顏色可用L*、a*、b*三個(gè)軸的坐標(biāo)來(lái)定義。L*為垂直軸,代表明度,其值從底部0(黑)到頂部100(白)。a*代表紅綠軸上顏色的飽和度,其中-a*為綠、+a*為紅。b*代表藍(lán)黃軸上顏色的飽和度,其中-b*為藍(lán)、+b*為黃。a*、b*都是水平軸。2個(gè)顏色之間的E=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2。測(cè)定溶液與蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)液的E值,則E值的大小反映了溶液色素質(zhì)量濃度的大小,從而可以簡(jiǎn)單快速評(píng)價(jià)不同浸提條件對(duì)提取色素效果的影響。本實(shí)驗(yàn)采用E值作為普洱茶茶色素提取的評(píng)價(jià)指標(biāo),研究熱水提取茶色素過(guò)程中液料比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)茶色素提取的影響。在此基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,得出普洱茶茶色素水提法的最佳工藝條件;同時(shí)利用清除1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH自由基)法研究普洱茶茶色素的抗氧化作用,旨在為深入研究普洱茶茶色素提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    龍潤(rùn)普洱茶(2007年) 云南龍潤(rùn)茶業(yè)集團(tuán)。

    1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH自由基) 日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    精密電子天平 瑞士Startorius公司;恒溫水浴鍋北京國(guó)華醫(yī)療器械廠(chǎng);SMY-2000ST測(cè)色色差計(jì) 北京盛名揚(yáng)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司;Rotavapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士B公司;循環(huán)水式多用真空泵 河南鞏義英峪予華儀器;Modulyod-230型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)熱電公司;UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津儀器公司。

    1.3 方法

    1.3.1 普洱茶茶色素TFs、TRs和TBs的含量測(cè)定

    采用系統(tǒng)分析法[15]測(cè)定。

    1.3.2 普洱茶茶色素的E測(cè)定方法

    普洱茶經(jīng)粉碎,篩分,烘干,無(wú)水乙醚脫脂,備用。精密稱(chēng)取一定量的普洱茶脫脂樣品于150mL浸提瓶中,加入一定體積的熱水在100℃條件下浸提,每隔20min振搖10s,浸提2h,過(guò)濾,濾液濃縮,凍干,取凍干粉配制成系列梯度質(zhì)量濃度的溶液,再經(jīng)色差計(jì)測(cè)定與蒸餾水的E值,計(jì)算出與色素質(zhì)量濃度呈線(xiàn)性正相關(guān)的E值范圍。樣品浸提所得濾液定容至250mL,測(cè)定與蒸餾水的E值大小評(píng)價(jià)色素提取的高低。

    1.3.3 普洱茶茶色素的提取

    精密稱(chēng)取普洱茶脫脂樣品1.250g于150mL浸提瓶中,加入一定體積的熱水在相應(yīng)溫度下浸提,每隔2 0 min振搖1 0 s,浸提完畢后,過(guò)濾,濾液定容至250mL,再經(jīng)色差計(jì)測(cè)定與蒸餾水的E值。試驗(yàn)分別考察了溫度、液料比和提取時(shí)間對(duì)E值的影響,并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取溫度、液料比和提取時(shí)間3個(gè)因素的合適水平進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì),采用響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

    1.3.4 普洱茶茶色素清除DPPH自由基能力

    按照優(yōu)化的提取工藝浸提普洱茶茶色素,過(guò)濾,濾液旋轉(zhuǎn)真空濃縮至一定體積,冷凍干燥,取凍干粉用蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度的樣品液。參照文獻(xiàn)[16],分別取2mL樣品液于試管中,加入2mL 2×10-4mol/L DPPH自由基溶液(無(wú)水乙醇配制),混合均勻,反應(yīng)30min后在波長(zhǎng)518nm處測(cè)定其吸光度A1,以2mL水代替樣品測(cè)定吸光度為A0;以2mL樣品與2mL無(wú)水乙醇混合液為A2,以消除樣品本身的影響,以2mL水與2mL無(wú)水乙醇的混合液調(diào)零點(diǎn)。按下式計(jì)算清除率:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 普洱茶中TFs、TRs和TBs的含量

    普洱茶中茶色素TFs、TRs和TBs含量(占干物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為0.298%、2.19%、12.02%。普洱茶中茶色素以TBs含量最高,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TRs和TFs,而TFs的含量很低。TFs、TRs和TBs都是茶多酚的不同程度的氧化產(chǎn)物,三者含量的高低與普洱茶獨(dú)特的后發(fā)酵過(guò)程密切相關(guān),即在整個(gè)“后發(fā)酵”過(guò)程中多酚類(lèi)物質(zhì)經(jīng)過(guò)酶促氧化和弱非酶促氧化聚合后,先產(chǎn)生茶黃素類(lèi)、茶紅素類(lèi),再進(jìn)一步氧化聚合生成茶褐素類(lèi)物質(zhì),而茶褐素則大幅度增加,是形成普洱茶色澤的主要原因。

    2.2 普洱茶茶色素的E值與質(zhì)量濃度的關(guān)系

    配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的色素溶液,用色差計(jì)測(cè)定與蒸餾水的E值依次為21.98、36.07、50.32、67.30和82.14。以色素質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)X、以E值為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線(xiàn)性回歸,方程為Y=30.31X+6.097,相關(guān)系數(shù)R2=0.9989,色素在0.5~2.5mg/mL范圍內(nèi)與E值在21.98~82.14之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,如圖1所示。因此,用色差計(jì)測(cè)定色素溶液的E值在21.98~82.14范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)能夠正確評(píng)價(jià)色素含量的高低。

    圖1 E值與茶色素質(zhì)量濃度的相關(guān)圖Fig.1 Relationship between color differenceEvalue and Pu-erh tea pigment concentration

    2.3 單因素試驗(yàn)

    2.3.1 提取溫度對(duì)普洱茶茶色素提取E值的影響

    固定茶色素提取的液料比35:1、時(shí)間1h,以提取溫度對(duì)茶色素提取E值做單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)提取溫度60、70、80、90、10 0℃,結(jié)果見(jiàn)圖2。

    圖2 提取溫度對(duì)普洱茶茶色素提取E值的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

    由圖2可知,隨著溫度在60~100℃之間的升高,普洱茶茶色素提取E值增加顯著,其原因可能與溫度越高,茶色素?cái)U(kuò)散到溶劑中的速度越快及普洱茶中本身含有的簡(jiǎn)單多酚氧化轉(zhuǎn)化為聚合多酚形式的茶色素越多有關(guān)。從實(shí)際生產(chǎn)情況考慮,提取溫度不宜超過(guò)100℃。

    2.3.2 液料比對(duì)普洱茶茶色素提取E值的影響

    固定茶色素提取的溫度80℃、時(shí)間1h,以液料比對(duì)茶色素提取E值做單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)液料比15:1、25:1、35:1、45:1、55:1(mL/g),結(jié)果見(jiàn)圖3。

    圖3 不同液料比對(duì)普洱茶茶色素提取E值的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

    由圖3可知,液料比的增大對(duì)提高普洱茶茶色素提取E值的效果較為明顯,在15:1~45:1之間,E值呈直線(xiàn)上升趨勢(shì),而在45:1~55:1之間茶色素提取E值變化平緩且略有下降。這可能是由于普洱茶需要吸收較多水分,才能充分溶脹,有利于色素的溶出;當(dāng)液料比達(dá)到45:1時(shí),色素充分溶出,但繼續(xù)增加溶劑比例后,其他成分過(guò)多溶出反而不利于色素的提取??紤]到降低后續(xù)工序濃縮的能耗及提高效率,液料比應(yīng)控制在45:1以?xún)?nèi)。

    2.3.3 提取時(shí)間對(duì)普洱茶色素提取E值的影響

    固定茶色素提取的液料比35:1、溫度80℃,以提取時(shí)間對(duì)茶色素提取E值做單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)提取時(shí)間30、60、90、120、150min,結(jié)果見(jiàn)圖4。

    圖4 提取時(shí)間對(duì)普洱茶茶色素提取E值的影響Fig.4 Effect of extraction time on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

    由圖4可知,提取時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)提高普洱茶色素提取E值的效果有一定的影響,在30~120min之間,E值呈上升趨勢(shì),而在120~150min之間E值趨于平緩。因此,提取時(shí)間宜控制在90~150min內(nèi)。

    2.4 采用響應(yīng)面法優(yōu)化普洱茶茶色素的提取工藝

    根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取液料比、溫度、時(shí)間3個(gè)因素的合適水平,對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析,其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1、2。

    表1 普洱茶茶色素的提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels in response surface design for optimizing the extraction of Pu-erh tea pigment

    表2 普洱茶茶色素的提取響應(yīng)面分析方案及其計(jì)算分析結(jié)果Table 2 Scheme and results of response surface design for optimizing the extraction of Pu-erh tea pigment

    運(yùn)用Minitab 14數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件,使用未編碼單位對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,得到液料比、溫度、時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸模型。

    表3 回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Regression coefficients and significance test for the constructed quadratic polynomial model equation

    由表3可以看出,根據(jù)P值判斷(P<0.05時(shí)水平顯著),各因素中一次項(xiàng)X2和二次項(xiàng)X22是最為顯著的,其次是交互項(xiàng)X1X3,由此可見(jiàn),各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

    表4 回歸方程方差分析表Table 4 Analysis of variance for the regression equation

    表4回歸方程方差分析表明,方程二次項(xiàng)影響是最為顯著的,一次項(xiàng)影響也是極為顯著的,交互項(xiàng)影響相對(duì)不顯著,說(shuō)明響應(yīng)值的變化相對(duì)復(fù)雜。R2=0.9942較大,說(shuō)明二次多項(xiàng)式回歸效果比較好,失擬項(xiàng)為0.349不顯著,說(shuō)明回歸方程擬合程度良好。

    圖5 提取E值殘差分析圖Fig.5 Residual plot for color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

    對(duì)響應(yīng)數(shù)據(jù)(E值)進(jìn)行殘差分析,殘差值分析結(jié)果見(jiàn)圖5,表明模型(1)能在很大程度上解釋觀(guān)測(cè)數(shù)據(jù)(E值)中的變異。

    模型(1)的響應(yīng)曲面及其等高線(xiàn)見(jiàn)圖6,3組圖直觀(guān)地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。由圖6可以看出溫度對(duì)色素提取E值的影響最為明顯,以液料比與時(shí)間的交互作用較大,但未達(dá)到顯著水平。從圖6也可以看出,當(dāng)一個(gè)因素的水平固定為1時(shí),能夠預(yù)測(cè)另兩個(gè)因素取不同水平組合的E值大小。因此,色素提取可以依據(jù)模型(1)的響應(yīng)曲面及其等高線(xiàn)圖,在實(shí)際生產(chǎn)中從能耗、效率及經(jīng)濟(jì)效益等多方面綜合考慮來(lái)合理選擇3因素的水平組合。

    圖6 各兩因素交互作用的響應(yīng)曲面和等值線(xiàn)圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature, extraction time and liquidto-material ratio on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

    單純從色素提取的E值大小考慮,用Mintab 14軟件進(jìn)行分析,則可以求得最適的提取條件為X1=45:1、X2=100℃、X3=150min,預(yù)測(cè)色素提取的E值為52.29,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重復(fù)3次,取平均值,提取液中E值為52.97,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.37%,與預(yù)測(cè)值相差1.3%,高出單因素試驗(yàn)和Box-Behnken組合中的最高E值4.73%。因此,基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

    2.5 普洱茶茶色素清除DPPH自由基能力

    DPPH自由基在國(guó)內(nèi)外廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究與天然抗氧化劑的篩選。若受試物能將其清除,則表明受試物具有降低羥基自由基、烷基自由基或過(guò)氧化自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈的作用[17]。普洱茶茶色素對(duì)DPPH自由基的清除結(jié)果見(jiàn)圖9,可知樣品質(zhì)量濃度在10~60μg/mL范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除率呈線(xiàn)性正相關(guān),普洱茶茶色素清除DPPH自由基的IC50值為30.83μg/mL。普洱茶茶色素清除DPPH自由基的能力可能與其結(jié)構(gòu)中的一些活性酚羥基和苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)有關(guān)。

    圖7 普洱茶茶色素對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging rates of Pu-erh tea pigment at various concentrations on DPPH free radicals

    3 結(jié) 論

    3.1 以與蒸餾水的E值作為色素提取的評(píng)價(jià)指標(biāo),基于試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Minitab 14,通過(guò)二次回歸設(shè)計(jì)得到了普洱茶茶色素提取E與料液比、提取溫度、提取時(shí)間的回歸模型,利用響應(yīng)優(yōu)化器得到色素提取E值的優(yōu)化工藝參數(shù)為液料比45:1(mL/g)、提取溫度100℃、提取時(shí)間150min,色素提取E值52.97,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.37%,與預(yù)測(cè)值相差1.3%,高出單因素試驗(yàn)和Box-Behnken組合中的最高E值4.73%。因此,利用響應(yīng)面分析方法對(duì)普洱茶茶色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù),能有效減少工藝操作的盲目性,從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

    3.2 按照普洱茶茶色素提取的優(yōu)化工藝提取得到的干燥產(chǎn)品清除DPPH自由基的體外抗氧化性實(shí)驗(yàn),可知普洱茶茶色素具有良好的抗氧化作用,清除DPPH自由基的IC50為30.83μg/mL,普洱茶茶色素可以作為一種天然的抗氧化劑。

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    Optimization of Process Conditions for Pu-erh Tea Pigment Extraction by Response Surface Analysis and Its Antioxidant Activity

    YANG Xin-he1,2,LI Qin1,3,HUANG Jian-an1,3,LU Ying1,3,SHEN Zhi1,LIU Zhong-hua1,3,*
    (1. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Botanical Functional Ingedients, Changsha 410128,China;2. College of Life Science and Technology, Xiaogan University, Xiaogan 432000, China;3. Key Laboratory of Tea Science, Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

    Objective: To optimize the extraction process for Pu-erh tea pigment and explore its antioxidant activity. Methods:Following single factor investigations, optimization of process conditions for the extraction of Pu-erh tea pigment based on the color difference valueEbetween distilled water and Pu-erh tea pigment was carried out using central design composite design combined with response surface methodology (RSM). 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay was used to evaluate the antioxidant activity of the pigment. Results: The optimal extraction conditions for Pu-erh tea pigment were liquid-to-material ratio of 45:1 (mL/g), extraction temperature of 100 ℃ and extraction time of 150 min. Under the optimal extraction conditions, a color differenceEvalue of 52.97 was obtained, which revealed 4.73% increase as compared to the highest color difference in single-factor investigations and Box-Behnken composite experiments. The IC50 value for the scavenging capability of Pu-erh tea pigment on DPPH free radicals was 30.83 μg/mL. Conclusion: It is feasible to optimize the extraction of Pu-erh tea pigment by response surface methodology. The Pu-erh tea pigment with excellent antioxidant activity has the potential to be further developed and utilized as a natural antioxidant.

    Pu-erh tea;tea pigment;extraction;response surface methodology;antioxidant activity

    S571.1

    A

    1002-6630(2011)06-0001-06

    2010-04-21

    “十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2007BAD58B00-03);云南省政府茶葉專(zhuān)項(xiàng)(2007YNCXB-01-01)

    楊新河(1974—),男,講師,博士,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail:yangxinhe@163.com

    *通信作者:劉仲華(1965—),男,教授,碩士,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail:Larkin-liu@163.com

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