燕麥及其制品β—葡聚糖含量測定方法比較

林偉靜，吳廣楓，王 強(qiáng)，周素梅，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100193)

燕麥及其制品β—葡聚糖含量測定方法比較

林偉靜1，2，吳廣楓2，王 強(qiáng)1，周素梅1，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100193)

為了準(zhǔn)確測定燕麥及其制品中β－葡聚糖的含量，篩選品質(zhì)更為突出的燕麥品質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，分析比較了測定β－葡聚糖的多種方法。分別用剛果紅法、酶法和熒光法測定了國內(nèi)11種燕麥的β－葡聚糖含量，并分析了3種方法之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，3種測定方法所得結(jié)果不一致，但其之間具有較好的線性關(guān)系，剛果紅法與酶法的相關(guān)系數(shù)為0.9921，剛果紅法與熒光法之間的相關(guān)系數(shù)則為0.9837，而酶法與熒光法之間的相關(guān)系數(shù)則達(dá)0.9914。

燕麥及其制品，β－葡聚糖，剛果紅法，酶法，熒光法

燕麥?zhǔn)呛坦阮愔袪I養(yǎng)價(jià)值最高的作物之一，其具有高蛋白質(zhì)含量、高油脂含量、高β－葡聚糖含量及低淀粉含量等特點(diǎn)，其中β－葡聚糖是燕麥膳食纖維的主要功能成分。近年來，燕麥β－葡聚糖因其具有調(diào)節(jié)血糖［1］、降血脂［2］、降膽固醇、提高人體免疫力［3］等功能作用而得到了廣泛的關(guān)注和研究。燕麥β－葡聚糖在籽粒中的含量一般為3%～7%［4］，目前國內(nèi)外關(guān)于燕麥β－葡聚糖含量的測定方法主要有剛果紅法［5］、酶法［6］、熒光法［7］、高效液相色譜法［8］等。剛果紅法操作簡單方便且成本低，是測定β－葡聚糖含量較常用的方法;酶法具有高度的專一性，是目前較為可靠的方法，但此法對酶制劑要求較高以致其成本較高，因此不能被廣泛應(yīng)用;熒光法具有高效、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但其與高效液相色譜法都因其所需儀器投入較高，而使它們的推廣受到一定的限制。燕麥β－葡聚糖的各種測定方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，曾有外國學(xué)者對酶法和熒光法測定燕麥β－葡聚糖的相關(guān)性進(jìn)行研究［9］，國內(nèi)關(guān)于β－葡聚糖性質(zhì)研究較多、測定方法研究較少，且尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于燕麥β－葡聚糖各種測定方法的相關(guān)性研究。本文旨在研究剛果紅法、酶法及熒光法測定燕麥中β－葡聚糖含量，嘗試通過研究上述方法，分析其中的聯(lián)系與相關(guān)性，希望能達(dá)到用快速簡單的方法，得到準(zhǔn)確可靠數(shù)據(jù)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥 市售;三羥甲基氨基甲烷、鹽酸 北京化工廠，分析純;剛果紅 北京化學(xué)試劑有限公司，指示劑;燕麥β－葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品、β－葡聚糖測定試劑盒、Calcofluor熒光增白劑 愛爾蘭Megazyme公司。

萬分之一分析天平、PB－20標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì) 德國Sartorius公司;SHA－B水浴恒溫振蕩器 金壇市榮華儀器制造有限公司;LXJ－IIB低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;WH－2微型旋渦混合儀

天津市泰斯特儀器有限公司;U－3010紫外可見分光光度計(jì)、F－2500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司。

1.2 樣品前處理

1.2.1 前處理工藝 燕麥籽?！鬯椤貌煌琾H的緩沖溶液分散→攪拌提取(→等電點(diǎn)除蛋白)→離心分離→收集上清液

1.2.2 單因素水平設(shè)置 本實(shí)驗(yàn)主要研究影響前處理提取的pH、溫度以及時(shí)間三個(gè)因素，設(shè)置水平分別為:pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0;時(shí)間 0.5、1、2、4、6h;提取溫度 20、30、40、50℃。

1.3 β－葡聚糖測定方法

1.3.1 剛果紅法［10］取標(biāo)準(zhǔn)燕麥β－葡聚糖0.1000g，溶于少量去離子水，加熱助溶并定容100mL，配成1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用前稀釋10倍。稱取0.0500g剛果紅溶于0.1mol/L pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，定容500mL。取 0.1mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于試管中，補(bǔ)充蒸餾水至2mL，加入剛果紅溶液4mL，25℃下顯色30min。于545nm下測定吸光值，以2mL蒸餾水作為空白，以吸光值為縱坐標(biāo)、燕麥β－葡聚糖含量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。將產(chǎn)品樣液稀釋一定倍數(shù)，取0.5mL樣液，以蒸餾水補(bǔ)至2.0mL，其他步驟按上述操作進(jìn)行，測定吸光值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出產(chǎn)品樣液的β－葡聚糖含量。

圖1 剛果紅法標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 酶法 參照AOAC995.16進(jìn)行檢測。

1.3.2.1 固體樣品 取一定量樣品于25mL具塞試管中，用0.2mL 50%酒精潤濕后加入4.0mL磷酸鹽緩沖液，振蕩混勻后在沸水中保溫60s，再次劇烈振蕩后將試管放在100℃水浴中保溫2min。在50℃水浴中平衡5min后加入地衣酶(50U/mL)0.2mL，并在50℃水浴中保溫1h，期間將試管每隔15min振蕩一次。接著加入乙酸鹽緩沖液5.0mL，室溫下平衡5min。3000r/min離心10min后，分別移取上清液0.1mL至3支試管中，并向其中兩試管加入β－葡萄糖苷酶(2U/mL)0.1mL(用于反應(yīng))，在第三支試管中加入乙酸鹽緩沖液0.1mL(用作反應(yīng)空白)，將所有試管在50℃水浴中保溫10min。加入氧化酶－過氧化酶(GOPOD)試劑3.0mL并在50℃水浴中保溫20min。取出試管，并在510nm下測量樣品的吸光值，所有樣品在1h內(nèi)測完。其中試劑空白包括0.2mL乙酸鹽緩沖液和3.0mL GOPOD試劑，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品包括0.1mL乙酸鹽緩沖液、0.1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和3.0mL GOPOD試劑。

1.3.2.2 液體樣品 取上清液調(diào)節(jié)其pH至6.5，取2.0mL并加入4.0mL磷酸鹽緩沖液，混勻后在沸水中保溫2min，再次劇烈振蕩后將試管放在100℃水浴中保溫4min。先后加入地衣酶、β－葡萄糖苷酶和GOPOD，并測定樣品吸光值(具體操作同固體樣品)。其中試劑空白包括0.2mL乙酸鹽緩沖液、0.1mL蒸餾水和3.0mL GOPOD試劑，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品包括0.2mL乙酸鹽緩沖液、0.1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和3.0mL GOPOD試劑。

1.3.3 熒光法［11］定量取β－葡聚糖溶液于10mL具塞試管中(用錫箔紙包好置于黑盒中)，依次加入35μg/mL Calcofluor溶液2mL，以不加 β－葡聚糖的Calcofluor溶液為空白，用pH9.0的Tris－HCl緩沖溶液定容至10mL。使用熒光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，熒光激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為435nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。取一定量β－葡聚糖提取液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，在相同條件下顯色并測定熒光強(qiáng)度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中β－葡聚糖的含量。

圖2 熒光法標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 計(jì)算公式

β－葡聚糖含量按測定方法所需公式計(jì)算，剛果紅法和熒光法按式(1)計(jì)算，酶法按式(2)和式(3)計(jì)算。

其中:C，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的產(chǎn)品β－葡聚糖含量，g;N，稀釋倍數(shù);V1，提取所得總樣液體積，mL;V2，反應(yīng)時(shí)所取樣液體積，mL;W，原料重量，g。

β－葡聚糖含量(%)=ΔA×F×94

其中:ΔA，樣品吸光值與反應(yīng)空白吸光值的差值;F，F(xiàn)=100(μg葡萄糖)/100μg葡萄糖的吸光值，吸光值轉(zhuǎn)化為μg葡萄糖的轉(zhuǎn)換因子;94(56)，體積校正因子(從9.4mL取0.1mL或從11.2mL取0.2mL用于分析);1/1000，從μg轉(zhuǎn)換成 mg;100/W，表示β－葡聚糖占原料的百分率;W，樣品重量(mg);162/180，游離葡萄糖轉(zhuǎn)化為β－葡聚糖中脫水葡萄糖的轉(zhuǎn)換因子。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的確定

為準(zhǔn)確測定燕麥中β－葡聚糖含量，需先將燕麥中β－葡聚糖充分提取出來。燕麥粉碎后，加水振蕩提取β－葡聚糖，實(shí)驗(yàn)選定pH、時(shí)間和溫度3個(gè)影響因素對β－葡聚糖含量的影響，以確定提取β－葡聚糖的較佳條件，其中β－葡聚糖含量用剛果紅法測定。

2.1.1 原料中蛋白對β－葡聚糖測定的影響 燕麥中蛋白含量約15%～20%，β－葡聚糖提取過程中常運(yùn)用等電點(diǎn)法對提取液脫除蛋白。在提取液脫蛋白前后分別取樣測定其中β－葡聚糖，探討蛋白對β－葡聚糖測定的影響，結(jié)果如表1所示。顯著性分析表明，脫除蛋白處理前后β－葡聚糖含量差異不顯著(p>0.05)，因此認(rèn)為蛋白質(zhì)對β－葡聚糖測定不存在影響，故前處理過程中不需脫除蛋白。2.1.2 pH對提取燕麥中β－葡聚糖的影響 取燕麥250mg，加入蒸餾水 25mL，調(diào)節(jié) pH 為 5.0、6.0、7.0、80、9.0，在30℃下攪拌提取2h。結(jié)果如圖3所示，隨著pH的上升，β－葡聚糖得率先增高后降低，在pH為6.0時(shí)達(dá)到最大值6.01%，選pH6.0為提取較適宜pH。

表1 除蛋白與未除蛋白對β－葡聚糖含量測定的影響

圖3 pH對β－葡聚糖得率的影響

2.1.3 時(shí)間對提取燕麥中β－葡聚糖的影響 取燕麥250mg，加入蒸餾水25mL，固定pH為6.0，在30℃下分別振蕩提取0.5、1、2、4、6h。由圖4 可知，隨著提取時(shí)間的增加，β－葡聚糖提取率在逐漸增加，且在2h前增加顯著，從反應(yīng)0.5h的3.81%增加至2h的6.17%，之后增加較為平緩，反應(yīng)6h僅比2h增加0.34%。可能提取時(shí)間延長，促進(jìn)多糖的溶解使β－葡聚糖得率增大，但是時(shí)間過長提取率無明顯變化，考慮到經(jīng)濟(jì)效益，提取時(shí)間選擇2h。

2.1.4 溫度對提取燕麥中β－葡聚糖的影響 取燕麥250mg，加入蒸餾水25mL，固定pH為6.0，分別在20、30、40、50℃下振蕩提取 2h。溫度對提取燕麥中β－葡聚糖的影響如圖5所示。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)溫度均較低，因考慮到本實(shí)驗(yàn)中的提取過程為燕麥β－葡聚糖和淀粉雙提取過程，過高的溫度會導(dǎo)致淀粉糊化。由圖可知，40℃為提取的較佳溫度。

圖4 時(shí)間對β－葡聚糖得率的影響

圖5 溫度對β－葡聚糖得率的影響

綜上所述，燕麥前處理的最佳工藝為:pH6.0，時(shí)間2h，溫度40℃。在此最佳條件下，β－葡聚糖得率達(dá)到6.70%。

2.2 燕麥及其制品β－葡聚糖測定方法的比較

2.2.1 測定方法的相關(guān)性 選取國內(nèi)11種燕麥，根據(jù)上述所得較佳的前處理?xiàng)l件，提取其中β－葡聚糖。所得提取液分別用剛果紅法、酶法和熒光法測定其β－葡聚糖含量(表2)，并分析其之間相關(guān)性，結(jié)果如圖6～圖8所示。由結(jié)果可知，3種方法所得結(jié)果并不一致，酶法和熒光法較接近，剛果紅法結(jié)果偏高，原因不明確，可能因?yàn)閯偣t與提取液中其他成分結(jié)合，使其吸光值增大導(dǎo)致結(jié)果偏高。另外，提取液中β－葡聚糖含量低于籽粒中β－葡聚糖含量，說明前處理過程沒有充分將β－葡聚糖提取，需進(jìn)一步優(yōu)化前處理工藝，提高β－葡聚糖的提取率。

表2 不同方法間燕麥β－葡聚糖含量測定的結(jié)果比較(%)

相關(guān)性分析結(jié)果表明，三種測定方法間具有較好的相關(guān)性，其中剛果紅法與酶法的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.9921，而剛果紅法與熒光法之間的相關(guān)系數(shù)為0.9837，酶法與熒光法之間的相關(guān)系數(shù)則達(dá)0.9914。

圖6 酶法與剛果紅法的相關(guān)性

圖7 剛果紅法與熒光法的相關(guān)性

圖8 酶法與熒光法的相關(guān)性

2.2.2 燕麥及其制品β－葡聚糖測定方法的比較

運(yùn)用酶法、剛果紅法和熒光法對燕麥及其制品(包括市售β－葡聚糖、市售燕麥米和燕麥片)β－葡聚糖含量進(jìn)行測定，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，3種方法測定市售β－葡聚糖產(chǎn)品的平均值相當(dāng)接近，而對于市售燕麥米及燕麥片，3種方法所得結(jié)果不相同，但具有一定的相關(guān)性。另外由相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)可知，三種測定方法中熒光法的RSD相對較高，酶法的RSD相對較低。

表3 燕麥及其制品中β－葡聚糖含量測定方法比較(%)

3 結(jié)論

3.1 由3種方法所得結(jié)果比較可知，其所得結(jié)果并不一致，其中剛果紅法結(jié)果最高，酶法次之，熒光法最低。酶法仍然是目前較準(zhǔn)確、可靠的方法。雖然剛果紅法測定結(jié)果偏高，但由于其操作簡單，且與酶法具有良好的相關(guān)性，剛果紅法測定結(jié)果經(jīng)修正后，具有一定參考價(jià)值。

3.2 剛果紅法、酶法和熒光法測定燕麥中β－葡聚糖具有較好的相關(guān)性，其中剛果紅法與酶法的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.9921，而剛果紅法與熒光法之間的相關(guān)系數(shù)為0.9837，酶法與熒光法之間的相關(guān)系數(shù)則達(dá)0.9914。

3.3 運(yùn)用酶法、剛果紅法和熒光法對燕麥及其制品的β－葡聚糖含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)三種方法均能較準(zhǔn)確測定市售β－葡聚糖含量，對燕麥及其制品的β－葡聚糖含量測定結(jié)果存在一定差異。

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Comparison of content determination of β－glucan from oat and its products

LIN Wei－jing1，2，WU Guang－feng2，WANG Qiang1，ZHOU Su－mei1，*
(1.Chinese Academy of Agricultural Sciences，Institute of Agro－food Science and Technology，Beijing 100083，China;2.China Agricultural University，College of Food Science ＆ Nutritional Engineering，Beijing 100193，China)

In order to determine the β－glucan in oat and its products accurately，to support some useful theoretical foundation for screening some excellent oat varieties，the determination methods of β－glucan content were considered as critical point and studied.β－glucan contents of 11 domestic oats were determined by Congo red method，enzyme determining method and fluorescence method respectively.It proved that the results of the 3 methods were different，but they were linearly dependent.The correlation coefficient between Congo red method and enzyme determining method was 0.9921，while between Congo red method and fluorescence method was 0.9837，and between enzyme determining method and fluorescence method was 0.9914.

oat and its products;β－glucan;Congo red method;enzyme determining method;fluorescence method

TS210.7

A

1002－0306(2011)06－0417－04

2010－05－06 *通訊聯(lián)系人

林偉靜(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:功能食品。

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD27B09，2006BAD01);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)。