楊大偉,劉云國(guó) ,譚樂義,周裔斌,祝素珍,王建廣,賈俊濤,姜英輝
(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東青島266002;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),安徽合肥230000)
食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC檢測(cè)方法的建立
楊大偉1,2,劉云國(guó)1,*,譚樂義1,周裔斌2,祝素珍1,王建廣1,賈俊濤1,姜英輝1
(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東青島266002;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),安徽合肥230000)
目的:建立食品中A型肉毒梭菌的快速檢測(cè)方法。方法:應(yīng)用PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù),以A型肉毒梭菌的A型肉毒神經(jīng)毒素基因作為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物,PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)。以非A型肉毒梭菌,產(chǎn)氣莢膜梭菌等23株參考菌株做特異性實(shí)驗(yàn);A型肉毒梭菌DNA稀釋成不同梯度,做靈敏度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比,該方法具有很好的特異性,方法靈敏度較高,最低檢出限可達(dá)到為111ng/tube。結(jié)論:該方法可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)A型肉毒梭菌,是食品中致病菌快速檢測(cè)的新技術(shù)。
變性高效液相色譜,A型肉毒梭菌,PCR,檢測(cè)
肉毒梭菌屬革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌,廣泛分布于自然界中,水和土壤中的肉毒梭菌芽孢是造成其食物污染的主要來源[1]。肉毒梭菌代謝產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素能夠抑制神經(jīng)末梢乙酰膽堿的分泌,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和延腦麻痹,根據(jù)其抗原性分為A~G型7個(gè)型,其中與人類中毒有關(guān)的是A、B、E、F型,我國(guó)報(bào)告由肉毒毒素致病的大多為A型毒素[2-4]。目前實(shí)驗(yàn)室中常用的檢測(cè)肉毒神經(jīng)毒素的方法是基于抗原-抗體反應(yīng)的針對(duì)毒素蛋白的檢測(cè)、小鼠致死及中和實(shí)驗(yàn)、膠體金免疫層析法、常規(guī)的PCR檢測(cè)等,操作比較復(fù)雜,工作量大[5]。目前分子生物學(xué)方法以及其他一些新技術(shù)則快速靈敏、特異性強(qiáng),符合當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)食品安全檢測(cè)的要求。變性高效液相色譜(denaturing high—performance liquid chromatography,DHPLC)作為近幾年才發(fā)展起來的新技術(shù),在一些領(lǐng)域已建立了快速、自動(dòng)化核酸分析新方法。利用樣品分子通過離子對(duì)固定相親和力的差異,在用流動(dòng)相洗脫時(shí),不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子在固定相上移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的目的[6]。本實(shí)驗(yàn)采用PCR結(jié)合DHPLC方法,為A型肉毒梭菌檢測(cè)提供了一種新方法。
所用菌種 詳見表1;細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒、PCRmaster mix TIANGEN;乙腈 色譜純,購(gòu)自Honeywell公司。
表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株
普通PCR儀 Eppendorf AG22331,德國(guó);變性高效液相色譜儀 NAV-99.4500,Transgenomic公司,美國(guó);電泳儀 北京六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)Vilber Lourmat公司;高速離心機(jī) Centrifuge TGL-16B,Eppendorf公司,德國(guó)。
1.2.1 引物合成 以A型肉毒神經(jīng)毒素基因作為靶基因,在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行檢索,選擇適合的序列,運(yùn)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物,用于PCR-DHPLC檢測(cè)的引物序列如下:
上游引物:5′-GTTAACATCAATAGTAAGGGGAAT-3′;
下游引物:5′-CCATAACCATTTCGCGTAAG-3′。
引物序列由上海英駿生物工程有限公司合成,預(yù)期擴(kuò)增片段為222bp。
1.2.2 參考菌株模板DNA的建立 按傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分別增菌培養(yǎng)表1中除肉毒梭菌外的20株參考菌株。取菌株的細(xì)菌培養(yǎng)液1mL,采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取細(xì)菌DNA,保存于-20℃?zhèn)溆靡源龣z測(cè),用于特異性實(shí)驗(yàn)。
1.2.3 特異性實(shí)驗(yàn) 以A型肉毒梭菌DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,以1.1中參考菌的20種細(xì)菌DNA作為陰性對(duì)照,按照1.2.4 PCR擴(kuò)增條件和1.2.5 DHPLC分析條件進(jìn)行病原菌的PCR、DHPLC特異性實(shí)驗(yàn)。
1.2.4 PCR擴(kuò)增條件 PCR反應(yīng)采用20L體系,經(jīng)過優(yōu)化得到的最佳反應(yīng)體系:2×PCRMaster 10μL,引物10μmol/L 各1μL,模板DNA 2μL,加 ddH2O 補(bǔ)足20μL。
最佳反應(yīng)條件:反應(yīng)程序如下:
預(yù)變性: 94℃ 5min
變性: 94℃ 30s退火: 58℃ 60s延伸: }72℃ 60s 40個(gè)循環(huán)延長(zhǎng): 72℃ 5min保存: 4℃
1.2.5 DHPLC分析條件 色譜柱:PS.DVB&C18DNASep色譜柱(4.6min×50mm,粒度3m);柱溫:50℃;流動(dòng)相:緩沖溶液A濃度為49.9%,緩沖溶液B濃度為 50.1%;流速:0.9mL/min;上樣量:PCR產(chǎn)物5μL。
1.2.6 靈敏度實(shí)驗(yàn) 挑取在37℃培養(yǎng)24h的A型肉毒梭菌菌落,懸浮于3mL0.85%生理鹽水中,10倍梯度稀釋菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù),重復(fù)2次,取平均值確定其菌懸液濃度為7.6×106cfu/mL。采用試劑盒提取法制備模板DNA,提取得到的DNA模板10倍梯度稀釋進(jìn)行PCR-DHPLC檢測(cè),并將上述所得菌懸液10倍梯度稀釋,濃度分別為:1:1.11×108ng/tube;2:1.11×107ng/tube;3:1.11×106ng/tube;4:1.11×105ng/tube;5:1.11×104ng/tube;6:1.11×103ng/tube;7:1.11×102ng/tube;8:1.11×101ng/tube,從而確定反應(yīng)體系的靈敏度。
取1.2.2所建立的參考菌株DNA模板進(jìn)行PCR-DHPLC檢測(cè)的特異性實(shí)驗(yàn)。圖1為部分菌種的檢測(cè)結(jié)果圖譜。經(jīng)PCR-DHPLC檢測(cè),在供試的23株參考菌株中,只有A型肉毒梭菌出現(xiàn)陽(yáng)性吸收峰,其余所有菌株均呈陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本研究自主設(shè)計(jì)的A型肉毒梭菌檢測(cè)引物具有很好的檢測(cè)特異性。
圖1 A型肉毒梭菌特異性實(shí)驗(yàn)的PCR-DHPLC吸收峰圖譜
將A型肉毒梭菌001的DNA提取液做10n倍比稀釋進(jìn)行PCR-DHPLC檢測(cè),并將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行比對(duì),如圖2所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DHPLC的最低檢出濃度為111ng/tube,故本研究所建立的方法有很好的檢測(cè)靈敏度。
圖2 A型肉毒梭菌靈敏度實(shí)驗(yàn)的PCR-DHPLC吸收峰圖譜
常規(guī)的A型肉毒梭菌檢測(cè)包括增菌和生理生化鑒定,既耗時(shí)又復(fù)雜,不宜做大批量樣本的檢測(cè),隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大,需要大通量的檢測(cè)技術(shù),傳統(tǒng)的檢測(cè)方法暴露出種種弊端。而在生產(chǎn)上,由于檢測(cè)的時(shí)間長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致影響產(chǎn)量和銷量。常規(guī)PCR凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)雖然檢測(cè)成本低,但結(jié)果僅靠凝膠上的條帶大小判斷,如果產(chǎn)物條帶較弱,擴(kuò)增片段大小相差不多時(shí),很難通過肉眼得到準(zhǔn)確結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng),靈敏度高等優(yōu)勢(shì),卻存在檢測(cè)成本高、熒光探針保存時(shí)間短等不足[7-8]。
PCR結(jié)合DHPLC技術(shù)是新近發(fā)展起來的高靈敏度、高通量檢測(cè)新技術(shù),DNA樣品自動(dòng)注入,并在緩沖液的攜帶下流經(jīng)DNA分離柱。根據(jù)待檢菌的特有基因序列,設(shè)計(jì) PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)合DHPLC技術(shù)可分離核酸片段的特點(diǎn),達(dá)到快速、高通量檢測(cè)菌的目的[9-10]。本文利用DHPLC能夠吸收檢測(cè)DNA片段并具有高度敏感性的特點(diǎn),針對(duì)產(chǎn)A型肉毒神經(jīng)毒素的特異基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用非變性DHPLC技術(shù),然后利用DHPLC檢測(cè)陽(yáng)性吸收峰,一次可同時(shí)自動(dòng)化分析數(shù)百個(gè)樣本,達(dá)到快速檢測(cè)的目的,具有廣泛的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
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Denaturing high performance liquid chromatography
(DHPLC)used in the detection of Clostridium botulinum-A
YANG Da-wei1,2,LIU Yun-guo1,*,TAN Le-yi1,ZHOU Yi-bin2,ZHU Su-zhen1,WANG Jian-guang1,JIA Jun-tao1,JIANG Ying-h(huán)ui1
(1.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao 266002,China;2.Anhui Agriculture University,Hefei 230000,China)
Objective:Quick checking method of Clostridium botulinum was established by polymerase chain reaction(PCR)and denaturing high-performance liquid chromatography(DHPLC).Methods:With gene of Clostridium botulinum’type A botulinum neurotoxin as target gene,the primer was designed and PCR system was optimized.And the twenty-three test strains such as Clostridium perfringens were tested by specific detection.Then different grades of standard strain were obtained by diluting and sensitivity was detected.Results:The PCR-DHPLC methods could test Clostridium botulinum exclusively and sensitively which with the lowest amount of detecting was111ng/tube.Conclusion:The PCR-DHPLC method was rapid and accurate in detection of Clostridium botulinum in food.
DHPLC;Clostridium botulinum-A;PCR;detection
TS207.3
A
1002-0306(2011)06-0398-03
2010-04-21 *通訊聯(lián)系人
楊大偉(1984-),男,碩士在讀,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。
國(guó)家質(zhì)檢總局課題(2008IK140,2009IK170)。