環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測食品中變形桿菌的研究

張勝凱，馬曉燕，張先舟，王 羽，錢翔宇，王小麗，王潤鑫，張 偉

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測食品中變形桿菌的研究

張勝凱，馬曉燕，張先舟，王 羽，錢翔宇，王小麗，王潤鑫，張 偉*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001)

采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，快速檢測食品中的變形桿菌。以變形桿菌(CMCC49027)的atpD基因作為靶序列，設(shè)計(jì)內(nèi)、外引物，通過肉眼觀察白色沉淀，判斷檢測結(jié)果。共對11株致病菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，變形桿菌為陽性，其他10株菌為陰性。采用FTA濾膜制備模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，其方法的靈敏度為6.4×102CFU/mL。利用LAMP技術(shù)直接檢測人工污染的肉制品中的變形桿菌，其檢出限為3.6×103CFU/g。本實(shí)驗(yàn)所建立的快速檢測變形桿菌的LAMP檢測方法具有較高的特異性和敏感性，能夠滿足變形桿菌快速檢測的需要。

LAMP，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，快速檢測，變形桿菌

變形桿菌是一種食源性條件致病菌，容易污染肉類、動(dòng)物內(nèi)臟和蛋類等動(dòng)物性食品以及涼拌菜、剩飯菜和豆制品［1］，可引起急性胃腸炎或發(fā)生組胺中毒，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，進(jìn)而導(dǎo)致腦膜炎、腹膜炎、敗血癥、尿路感染、呼吸道感染、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾?。?－3］。近年來有關(guān)變形桿菌引起食物中毒的事件逐漸增多。從1996年至今，已有200多篇關(guān)于變形桿菌引起食物中毒的報(bào)道［4］。食物中變形桿菌的檢測方法，主要有基于生化特征進(jìn)行鑒定的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法［5］、尿素酶試紙法［6］、全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)檢測法［7］和基于分子生物學(xué)的PCR法 。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法是目前國內(nèi)外檢測變形桿菌屬的標(biāo)準(zhǔn)方法，但操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，分離鑒定到屬至少需要48～72h。尿素酶試紙法操作簡便、快速，能夠在幾分鐘內(nèi)鑒別變形桿菌屬，且成本低廉，但準(zhǔn)確性、可靠性較差。全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)檢測法繼承了前兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，但儀器價(jià)格昂貴、成本高，一般單位難以承受。PCR法檢測準(zhǔn)確、快速、敏感，但需要昂貴的PCR儀不利于在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。因此需要發(fā)展一種快速簡便的檢測方法來實(shí)現(xiàn)對變形桿菌進(jìn)行檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop－mediated isothermal amplification，LAMP)是 Notomi等在 2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是針對目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫65℃左右，幾十分鐘，即可實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增［8－9］。4條引物對靶序列的6個(gè)特異序列區(qū)域的識別，保證了LAMP擴(kuò)增的高度特異性。LAMP不需要模板的熱變性［10］，長時(shí)間溫度循環(huán)，在等溫條件下擴(kuò)增，不會(huì)因改變溫度而造成時(shí)間的浪費(fèi)。有無肉眼可見的焦磷酸鎂的白色沉淀［11－12］，成為判斷核酸是否擴(kuò)增的最簡單的方法。LAMP將成為可以替代PCR的核酸擴(kuò)增的新技術(shù)。

表1 引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BstDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、10×Loading buffer、DNA Marker DL100、DL2000，LAMP 引物等 購自或合成于上海生工生物工程有限公司;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等 購自北京路橋公司;肉及肉制品 購自當(dāng)?shù)爻?變形桿菌、臘樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏弧菌、小腸結(jié)腸耶爾森氏菌、大腸桿菌O157:H7、副溶血弧菌、鮑氏志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、單核增生李斯特氏菌及宋內(nèi)志賀氏菌 購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心。

電熱恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)SIGMA3K30

德國西格馬公司;PCR擴(kuò)增儀 Whatman T Gradient基因擴(kuò)增儀，德國Biometra公司;恒溫培養(yǎng)箱、凝膠成像系統(tǒng)KodakEDAS290 美國柯達(dá)公司;電泳儀DXY－33A型 北京市六一廠;微量移液器0.1～1 000L，lBIOHIT芬蘭;FTA濾膜 購自Whatman公司，使用時(shí)用Harris打孔器打成直徑2.00mm的圓片。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 純菌培養(yǎng) 變形桿菌接種于新鮮無菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h。用生理鹽水將菌懸液按照100～108倍稀釋。采用稀釋平板法，測定其純培養(yǎng)物活菌數(shù)為6.4×108CFU/mL;同時(shí)從每個(gè)稀釋度菌液中取1mL直接用FTA濾膜法提取變形桿菌基因組DNA，作為模板，進(jìn)行LAMP實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 人工污染肉及肉制品 在人工污染變形桿菌前，樣品均按國標(biāo)法檢測證實(shí)不含有變形桿菌。然后將變形桿菌人工污染到樣品中:取25g樣品加入225mL生理鹽水勻漿，然后對勻漿液人工污染不同濃度的變形桿菌，人工污染的勻漿液中變形桿菌的濃度依次為100～108CFU/mL，直接提取人工污染的肉及肉制品中變形桿菌的DNA。人工污染樣品中變形桿菌 DNA的提取:取10mL的樣品勻漿以1000r/min離心10min，然后吸取上清液加入另一個(gè)滅菌的離心管中以14000r/min離心10min。棄上清，沉淀用500μL的生理鹽水懸浮，加入0.25倍體積的乙酸乙酯，振蕩混勻2min，然后以14000r/min離心10min。棄去上清，沉淀用500μL的TE緩沖液溶解。再用FTA濾膜法提取溶液中變形桿菌基因組DNA，直接進(jìn)行LAMP檢測，確定檢出限。

1.2.3 模板DNA的制備 本研究采用FTA濾膜法［13］進(jìn)行DNA的提取:取1mL過夜培養(yǎng)的菌懸液加到離

心管中，加入直徑為2.00mm的FTA濾膜片，56℃干燥。干燥后的FTA濾膜片用FTA緩沖液洗滌兩次，再用TE緩沖液洗滌兩次，最后再將FTA濾膜置于56℃干燥，干燥后的FTA濾膜即可作為反應(yīng)的模板。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 為了檢測變形桿菌，針對變形桿菌(CMCC49027)GenBank中atpD基因，運(yùn)用引物設(shè)計(jì) 軟 件 (https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)在線進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的原則如 notomietal［8］所述。設(shè)計(jì)的4條引物是:兩條外引物(F3和B3)，兩條內(nèi)引物(FIP和 BIP)。擴(kuò)增基因組中的位置從146至337區(qū)域191bp目的基因片斷。引物的名稱和具體序列見表1。FIP由F1的一個(gè)互補(bǔ)序列和正向序列F2構(gòu)成。BIP由B1的一個(gè)互補(bǔ)序列和正向序列B2構(gòu)成。每條引物在基因組中具體的位置如圖1所示。

圖1 每條引物在基因組中的位置

1.2.5 LAMP反應(yīng) 25μL的反應(yīng)體系由內(nèi)引物(FIP和 BIP)各 1.6μm，外引物(F3 和 B3)各 0.2μm，1.4mmol/L dNTP，2mmol/L MgSO4，10 × Bst DNA 聚合酶反應(yīng)緩沖液(New England Biolabs，MA)(20mmol/L Tris － HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)2SO4，2mmol/L MgSO4，0.1%Triton X－100)，8U的Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs，Beverly，MA)，1.5μLDNA 模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP反應(yīng)過程是首先在64℃水浴鍋中反應(yīng)20min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴10min終止反應(yīng)，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀。此外，取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL與1μL的lodding buffer混合均勻，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯形條帶，以證實(shí)是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)的肉眼可視結(jié)果

反應(yīng)結(jié)果如圖2所示，A管未發(fā)生LAMP反應(yīng)，沒有產(chǎn)生白色沉淀;而B管發(fā)生了LAMP反應(yīng)，產(chǎn)生了白色沉淀。

2.2 LAMP用于純培養(yǎng)變形桿菌的檢測實(shí)驗(yàn)

2.2.1 LAMP檢測敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 過夜培養(yǎng)的變形桿菌的菌懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)可知，起始菌液的濃度為

6.4 ×1 08CFU/mL，10倍梯度稀釋菌液，進(jìn)行LAMP檢測變形桿菌的靈敏度實(shí)驗(yàn)如圖3所示。LAMP方法，在稀釋到106倍(6.4×102)時(shí)出現(xiàn)梯形條帶。而稀釋到107倍(6.4×101)時(shí)未出現(xiàn)梯形條帶。即檢測變形桿菌的靈敏度達(dá)到6.4×102CFU/mL，相應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3所示。

圖2 LAMP反應(yīng)的可視結(jié)果

圖3 LAMP檢測變形桿菌的靈敏度

2.2.2 LAMP檢測特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 利用LAMP對1株變形桿菌和11株其它致病菌進(jìn)行特異性檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，其瓊脂糖凝膠電泳圖如圖4所示。由圖4可知，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，只有變形桿菌擴(kuò)增出特異性片段，而其它10株致病菌的擴(kuò)增結(jié)果均顯示為陰性?？梢娫摲椒ň哂休^好的特異性。

圖4 LAMP反應(yīng)的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 LAMP檢測人工污染樣品檢出限的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)可知，過夜培養(yǎng)的變形桿菌的菌懸液濃度為3.6×108CFU/mL，即人工污染樣品中變形桿菌的原始濃度為3.6×108CFU/g。按1.2.2方法處理樣品提取DNA，進(jìn)行LAMP檢測人工污染樣品中的變形桿菌的檢出限實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。采用LAMP方法，在稀釋到105倍(3.6×103)時(shí)能出現(xiàn)梯形條帶;稀釋到106倍(3.6×102)時(shí)不能檢測到變形桿菌，電泳無梯形條帶，即檢測人工污染樣品中的變形桿菌的檢出限是3.6×103CFU/g，其瓊脂糖凝膠電泳圖如圖5所示。

圖5 LAMP檢測樣品中變形桿菌檢出限

3 討論

變形桿菌是引起泌尿系統(tǒng)感染的常見致病菌，是從局部或全身感染中分離的腸桿菌科常見細(xì)菌，1991年倫敦皇家醫(yī)院和最近法國醫(yī)院調(diào)查中，腸桿菌科中變形桿菌的感染率分別為15%和8.3%，成為腸桿菌科中繼大腸桿菌之后(64.4%)位居第二位的致病菌［14］。目前，我國有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中只有衛(wèi)生部發(fā)布的變形桿菌引發(fā)食物中毒診斷的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS/T9－1996變形桿菌食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》，缺少相應(yīng)的預(yù)防監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法。由于變形桿菌為條件致病菌，國家標(biāo)準(zhǔn)《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法微生物學(xué)部分》GB/T4789系列標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定該菌的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，在食品衛(wèi)生日常監(jiān)督檢測中，該菌成為盲點(diǎn)，評價(jià)也沒有依據(jù)，導(dǎo)致食物中毒事件屢屢發(fā)生。由于被變形桿菌污染的食品無任何感官上的變化，所以極易引起食物中毒，我國每年由于變形桿菌引起的食物中毒事件很多。

本研究以變形桿菌的atpD基因作為靶序列，采用LAMP方法，檢測肉及肉制品中的變形桿菌，表現(xiàn)出較高的靈敏度。本研究探索了一種更為穩(wěn)定、快捷的分子檢測樣品中變形桿菌的新技術(shù)。

LAMP方法是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。它依賴于能夠識別靶DNA上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下擴(kuò)增核酸，保證了擴(kuò)增的高特異性和高效率。另外，核酸大量生成時(shí)，從dNTPs中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)體系中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的擴(kuò)增反應(yīng)副產(chǎn)物—白色焦磷酸鎂沉淀。結(jié)果鑒定簡單，非常適用于高通量的快速檢測。

從研究結(jié)果中我們可以看到，LAMP技術(shù)能快速檢測肉及肉制品中的變形桿菌，該方法靈敏度高、特異性好、耗時(shí)短、費(fèi)用低，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法和全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)檢測法的缺陷，為食品中變形桿菌的快速檢測構(gòu)建了一個(gè)技術(shù)平臺。并且這種方法所使用的技術(shù)簡單，操作快捷，結(jié)果容易判斷，也不需要任何類似PCR的昂貴設(shè)備，因而具有極大的應(yīng)用價(jià)值，有望取代PCR而成為核酸擴(kuò)增檢測食品中病源微生物的主要手段。

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Rapid detection of Proteus.vulgaris in food samples by loop－mediated isothermal amplification

ZHANG Sheng－kai，MA Xiao－yan，ZHANG Xian－zhou，WANG Yu，
QIAN Xiang－yu，WANG Xiao－li，WANG Run－xin，ZHANG Wei*(Institute of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China)

A loop－mediated isothermal amplification(LAMP)technology rapidly detected Proteus.vulgaris in food samples.The sequences of atpD of Proteus.vulgaris(CMCC49027)was as target sequences，used to design outer primers and inner primers.The results of detection were judged through visible to the naked eye of the white precipitate.There were 11 bacterial amplified by LAMP method in order to evaluate the specificity of primers.The result of only Proteus was positive and those of other strains were negative.The sensitivities of LAMP assays using the FTA filters as templates were 6.4×102CFU/mL.The detection limits of LAMP assays obtained from artificially inoculated meet samples were 3.6×103CFU/g.The results showed that the LAMP method developed in this experiment with high specificity and sensitivity，the developed LAMP method can meet the demands of rapid and simple detection of Proteus.vulgaris.

LAMP;Loop－mediated isothermal amplification;rapid detection;Proteus.vulgaris

TS207.4

A

1002－0306(2011)06－0384－04

2011－02－22 *通訊聯(lián)系人

張勝凱(1982－)，男，在讀碩士，從事有害微生物檢測及控制的研究。

河北省自然科學(xué)基金(C2008000216)。