魚鱗膠原蛋白提取過程中的脫鈣工藝條件優(yōu)化

唐 旭，何建林，徐長安，宋曉紅，歐徽龍，張怡評(píng)，易瑞灶

(1.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門361005;2.廈門大學(xué)海洋系，福建廈門361005)

魚鱗膠原蛋白提取過程中的脫鈣工藝條件優(yōu)化

唐 旭1，何建林1，徐長安1，宋曉紅2，歐徽龍2，張怡評(píng)1，易瑞灶1

(1.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門361005;2.廈門大學(xué)海洋系，福建廈門361005)

研究了海魚魚鱗膠原蛋白提取過程中的脫鈣工藝條件優(yōu)化。采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，考察了酸濃度、溫度、時(shí)間等因素對(duì)魚鱗脫鈣工藝的影響，并使用離子色譜法考察了各種工藝條件對(duì)魚鱗膠原蛋白在脫鈣過程中溶出的影響。確定了魚鱗膠原蛋白提取過程中的脫鈣優(yōu)化工藝，即溫度18℃，酸濃度0.7mol/L，時(shí)間24h。放大實(shí)驗(yàn)至原料2kg規(guī)模，得脫鈣率為99.4%，適合規(guī)模化生產(chǎn)。

魚鱗，膠原蛋白，脫鈣工藝，優(yōu)化

膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的三螺旋纖維蛋白質(zhì)，它主要存在于動(dòng)物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌鍵、韌帶和血管中，是結(jié)締組織極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的作用。膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%～30%［1］。其提取制品已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、食品加工、化妝品等眾多領(lǐng)域［2－4］。由于近年來生態(tài)環(huán)境受到嚴(yán)重污染，陸生哺乳動(dòng)物疫病爆發(fā)，尤其是瘋牛病、口蹄疫等疾病流行，使得源自于牛、豬等動(dòng)物皮、骨中提取的膠原蛋白的安全性受到質(zhì)疑與限制，世界各國都在開發(fā)更安全的魚鱗膠原蛋白，來滿足人們對(duì)其安全、生態(tài)與健康的需求［5］。

魚鱗是魚皮真皮層的變形物，占魚體重量的1%～5%。有關(guān)研究表明，魚鱗含豐富的蛋白質(zhì)、卵鱗脂和多種礦物質(zhì)，其中有機(jī)物占 41%～55%［6］，而蛋白質(zhì)占70%，主要為膠原蛋白和角蛋白等硬蛋白。除了含有豐富的膠原蛋白，魚鱗中還含有大量的無機(jī)鈣鹽，主要以羥基磷灰石形式存在，黏附在膠原纖維的表面［7］。由于含有羥基磷灰石，使得直接提取魚鱗膠原蛋白產(chǎn)率低、生產(chǎn)周期長［8－9］。因此，魚鱗膠原蛋白的提取，一般需要先將鈣質(zhì)脫除，以便于膠原蛋白脫離羥基磷灰石的束縛而溶出，易于提取。而且，鈣含量越低，所提取的膠原蛋白質(zhì)量越好［10］。通常，選擇作為脫鈣試劑的有鹽酸［10－14］、EDTA［13－16］、檸檬酸［5，17］。本工作擬通過綜合考慮成本、操作等因素，選擇鹽酸作為魚鱗脫鈣試劑，設(shè)計(jì)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化魚鱗膠原蛋白提取過程中的脫鈣工藝條件，并進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美國紅魚魚鱗 購自福建漳州東山，經(jīng)洗滌、脫脂、干燥備用;其他化學(xué)試劑 均為分析純，汕頭西隴化工廠有限公司。

電子天平 METTLER TOLEDO AL104型;離子色譜 美國Dionex ICS－3000型離子色譜;色譜柱氨基酸分析柱 (DIONEX Am inopac PA－10 2×250mm);馬弗爐 日本Yamato，F(xiàn)M－36;DHG－9240A型烘箱、DEF－6050型真空干燥箱 上海恒一科學(xué)儀器公司;坩堝，酸式滴定管。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 離子色譜條件 流動(dòng)相:250mmol/L氫氧化鈉－1mol/L醋酸鈉－水，梯度洗脫;柱溫:30℃;流速:0.25m L/m in;進(jìn)樣量:25μL。

1.2.2 脫鈣方法 取脫脂后洗滌干燥備用的魚鱗50g置于1000m L燒杯中，按料液比1∶10加入500m L水;加入鹽酸溶液，達(dá)到實(shí)驗(yàn)濃度，在不同實(shí)驗(yàn)溫度下攪拌;反應(yīng)結(jié)束后，脫鈣液取樣待測，魚鱗用清水洗滌10次，晾干;再置于27℃下真空干燥24h，稱重待測。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 在魚鱗脫鈣工藝中，有諸多影響因素。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［10－13］以及本實(shí)驗(yàn)室初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選定溫度、酸濃度和時(shí)間為主要影響因子，通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳魚鱗脫鈣工藝條件。具體影響因子及實(shí)驗(yàn)水平見表1。魚鱗的量為50g，料液比為 1∶10。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.4 鈣滴定實(shí)驗(yàn)(高錳酸鉀法［18］)

1.2.4.1 高錳酸鉀滴定液的配制［19］稱取高錳酸鉀約3.2g，加水 1000m L，煮沸 15m in，冷卻，密封，靜置2d，G3砂芯漏斗過濾，搖勻。

1.2.4.2 標(biāo)定［19］根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2005年版 二部)方法進(jìn)行標(biāo)定。依此法測得KMnO4滴定液的濃度為0.02188mol/L。

1.2.4.3 魚鱗鈣離子滴定 稱取脫脂前與脫脂后的魚鱗，置于馬弗爐550℃灰化5h，加入1∶4鹽酸溶液5m L，水浴蒸干。再加入1∶4鹽酸溶液溶解并移入25m L容量瓶中。去離子水多次洗滌坩堝，洗滌液合并移入容量瓶，冷卻后用去離子水定容。

準(zhǔn)確吸取樣液1m L移入15m L離心管中，加入甲基紅指示劑1滴。4%草酸銨溶液2m L，1∶4醋酸溶液0.5m L，搖勻，用1∶4氨水溶液調(diào)節(jié)樣液至微藍(lán)，再用醋酸調(diào)至微紅，放置1h后離心15min，傾去上清液，傾斜離心管并用濾紙吸干管口殘留溶液，向離心管中加入2%氨水溶液10m L，離心20m in，吸去上清液。往沉淀中加入2mol/L硫酸溶液5m L，搖勻。70～80℃水浴，使沉淀完全溶解。高錳酸鉀滴定液滴至微紅，30s不褪色為終點(diǎn)。

1.2.4.4 鈣含量與脫鈣率計(jì)算 計(jì)算公式如下:

式中:c－KMnO4溶液濃度，mol/L;V－KMnO4溶液耗用體積，m L;V1－用于測定的樣液體積，m L;V2－樣液定容總體積，m L;m－樣品質(zhì)量，g;40.08－鈣的摩爾質(zhì)量，g/mol。

1.2.5 脫鈣液羥脯氨酸含量測定 為考察脫鈣條件是否會(huì)使魚鱗膠原蛋白溶出，使用離子色譜法［20］檢測脫鈣液中羥脯氨酸的含量。取離心后的魚鱗脫鈣液1m L，加入6mol/L鹽酸9m L，置于110℃烘箱中水解12h，稀釋200倍后，使用離子色譜法檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)魚鱗膠原蛋白變性溫度的測試可知，魚鱗膠原蛋白的變性溫度在28℃左右［10］。為了減少蛋白變性的可能，一般不選擇超過20℃的條件［21］。因此選取4、10、18℃三種溫度，考察不同溫度狀態(tài)對(duì)魚鱗脫鈣反應(yīng)的影響。

脫鈣工藝通常使用酸溶液進(jìn)行反應(yīng)，但如果酸過強(qiáng)，將會(huì)造成魚鱗膠原蛋白溶出以及對(duì)其造成破壞［22］，本文采用稀鹽酸溶液作為脫鈣試劑，綜合文獻(xiàn)報(bào)道［10－13］以及實(shí)驗(yàn)室前期工作，選擇 0.4、0.8、1.2mol/L三種鹽酸濃度，考察使用不同酸濃度對(duì)魚鱗脫鈣反應(yīng)的影響。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［10－13］，設(shè)計(jì)了 8、12、24h 三種脫鈣反應(yīng)時(shí)間，考察時(shí)間對(duì)脫鈣反應(yīng)的影響。

按脫鈣實(shí)驗(yàn)影響因素和水平的設(shè)計(jì)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 脫鈣正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2中的結(jié)果可以看出，極差最大的因素是酸濃度，溫度和時(shí)間因素的影響相同，這可能是因?yàn)榻?jīng)脫鈣后的魚鱗中鈣離子含量很低，在檢測方法的檢測限以下。酸濃度對(duì)魚鱗脫鈣影響最大，由于上述原因造成的誤差，使得0.8mol/L和1.2mol/L的均值一樣，說明這兩種濃度的脫鈣影響效果無差別，考慮到成本的因素，選擇0.8mol/L作為脫鈣液的酸濃度。直觀分析表明，最優(yōu)組合為 A3B2C3，即溫度18℃，酸濃度0.8mol/L，時(shí)間24h。

為了使結(jié)果更為優(yōu)化，隨后又進(jìn)行了0.5～0.8mol/L濃度更為細(xì)化的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，見表3。

表3 0.5～0.8mol/L不同濃度脫鈣率的比較實(shí)驗(yàn)

從表3中的結(jié)果可以看出，0.8mol/L濃度對(duì)應(yīng)的脫鈣率高于0.5mol/L時(shí)的脫鈣率，與表2中正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。隨著濃度從0.5mol/L增加到0.8mol/L，脫鈣率也隨之增加。0.7mol/L時(shí)的脫鈣率與0.8mol/L時(shí)的相比，相差無幾。從成本的因素考慮，最終確定脫鈣工藝條件為鹽酸濃度0.7mol/L，溫度18℃，時(shí)間24h。

2.2 離子色譜法檢測

為考察不同條件對(duì)魚鱗脫鈣過程中膠原蛋白溶出的影響，使用離子色譜法對(duì)6mol/L鹽酸水解后的脫鈣液進(jìn)行檢測，均未發(fā)現(xiàn)明顯的羥脯氨酸離子峰，說明魚鱗在表2以及表3中的實(shí)驗(yàn)條件下脫鈣，均不會(huì)造成膠原蛋白的溶出。

2.3 規(guī)模放大實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表2、表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果所確立的條件，將魚鱗脫鈣工藝規(guī)模放大至原料2kg，總體積20L，經(jīng)最終鈣含量滴定以及離子色譜檢測實(shí)驗(yàn)得知，在該優(yōu)化條件下所得的脫鈣率為99.4%，脫鈣液中未檢測到明顯的羥脯氨酸，即未造成膠原蛋白的溶出。

3 結(jié)論

魚鱗中除了含有豐富的膠原蛋白，還含有大量的無機(jī)鹽，主要以鈣鹽形式存在，為提高魚鱗膠原蛋白的提取率以及質(zhì)量，一般需要先將鈣質(zhì)脫除。經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)得出優(yōu)化的脫鈣工藝條件:溫度18℃，酸濃度0.7mol/L，脫脂時(shí)間24h。放大實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果也說明，該脫鈣條件優(yōu)良，適合規(guī)?；a(chǎn)。

［1］蔣挺大，張春平.膠原蛋白［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2001:125.

［2］劉學(xué)旭，王坤余，丁運(yùn)萍，等.膠原－葡甘聚糖－硫酸軟骨素復(fù)合膜對(duì)全層皮膚損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2005，22(5):1004－1006.

［3］唐傳核，彭志英.膠原的開發(fā)及利用［J］.肉類研究，2000(3):41－43.

［4］王學(xué)川，任龍芳，強(qiáng)濤濤，等.膠原蛋白的研究進(jìn)展及其在化妝品中的應(yīng)用［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2005，35(6):388－391.

［5］王信蘇，汪之和.草魚魚鱗膠原蛋白的提?。跩］.現(xiàn)代食品科技，2006，22(4):148－150.

［6］張俊杰，曾慶孝.魚鱗的開發(fā)利用前景［J］.中國水產(chǎn)，2004(5):74－75.

［7］Toshiyuki Ikoma，Hisstoshi Kobayashi，Junzo Tanaka，et al.Microstructure，mechanical，and biomimetic properties of fish scales from Pafrusmajor ［J］.Journal of Structural Biology，2003，142:327－333.

［8］劉小鈴，許時(shí)嬰.雞骨明膠生產(chǎn)中浸酸工藝的控制［J］.食品工業(yè)科技，2004，25(8):109－111.

［9］王彩理.魚鱗制膠及其綜合利用［J］.齊魯漁業(yè)，2002，19(3):40－41.

［10］張俊杰，曾慶孝.魚鱗鹽酸脫鈣過程中膠原蛋白含量的變化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(4):40－43.

［11］SSankar，S Sekar，R Mohan，et al.Preparation and partial characterization of collagen sheet form fish(Lates calcarifer)scales［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2008，42:6－9.

［12］劉慶慧，王彩理，劉叢力.魚鱗膠原蛋白研究［J］.海洋水產(chǎn)研究，2000，21(3):57－61.

［13］Takeshi Nagai，Masami Izumi，Masahide Ishii.Fish Scale collagen.Preparation and partial Characterization［J］.International Journal of Food Science and Technology，2004，39:239－244.

［14］張俊杰，段蕊，陳璐.鯉魚鱗酸溶性膠原蛋白提取的研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2006，25(12):640－643.

［15］王吰，劉劍虹，李可偉.胃蛋白酶法提取草魚鱗膠原蛋白的工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(4):134－136.

［16］張穎潔，曾慶孝，葉鳳鱗，等.EDTA微波快速脫鈣法在魚鱗脫鈣中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)，2007(1):42－44.

［17］鐘朝輝，李春美，梁晉鄂，等.魚鱗膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2006，27(7):162－166.

［18］大連輕工業(yè)學(xué)院，華南理工大學(xué)，鄭州輕工業(yè)學(xué)院，等.食品分析［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2006:105.

［19］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(2005年版 二部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄162.

［20］Hong Dai，Zongcai Zhang，Subo Fan，et al.Analysis of hydroxyproline in collagen of pig skin tissue by low pressure ion chromatography separation and conductivity detection［J］.Journal of the Society of Leather Technologists and Chmists，2006，15(4):55－58.

［21］張俊杰，段蕊，潘秀樓.鯉魚魚鱗酶溶性膠原蛋白提取工藝的應(yīng)用［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，15(4):55－58.

［22］潘楊，許學(xué)勤.酸堿法提取魚鱗膠的工藝研究［J］.食品科技，2008(3):183－186.

Optim ization of decalcification process during extracting collagen from scale of sea fish

TANG Xu1，HE Jian－lin1，XU Chang－an1，SONG Xiao－h(huán)ong2，OU Hui－long2，ZHANG Yi－ping1，YIRui－zao1
(1.Third Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，China;2.Department of Oceanography，Xiamen University，Xiamen 361005，China)

Optim ization of decalcification process during extracting collagen from scale of sea fish was investigated.Orthogonal experimentmethod was applied to estimate the effect of acid concentration，temperature and time on the decalcification of fish scale.Ion chrom atography was app lied to observe the effect of factors on the dissolution of collagen from scale while decalcifying.Optim ized process of collagen extraction from sea fish scale was confirmed.Tem perature was 18℃，acid concentration was 0.7mol/L and the tim e was 24h.The process was carried out at large scale，the result indicated it was perfect for plant scale w ith decalcification rate at 99.4%.

sea－fish scale;collagen;decalcification process;optim ization

TS201.1

B

1002－0306(2011)06－0326－03

2010－06－02

唐旭(1974－)，男，博士，副研究員，研究方向:海洋天然產(chǎn)物化學(xué)，有機(jī)化學(xué)。

國家海洋局第三海洋研究所科研基本業(yè)務(wù)費(fèi)［HE08102(1)］;國家科技支撐計(jì)劃［HT080601(2)］。