酵解擬黑鑫刺蟻制備抗氧化活性肽

王 婧，劉通訊

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

WANG Jing，LIU Tong－xun*

(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

酵解擬黑鑫刺蟻制備抗氧化活性肽

王 婧，劉通訊*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

分別采用Alcalase 2.4L、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰酶水解擬黑多刺蟻，利用超氧自由基、DPPH自由基、羥基自由基清除能力、還原力、鐵離子螯合能力、亞油酸自氧化抑制能力6個指標(biāo)衡量水解物的抗氧化能力，并結(jié)合水解度(DH)、蛋白質(zhì)利用率、多肽含量等理化指標(biāo)篩選最適蛋白酶。結(jié)果表明，酶解物具有良好的體外抗氧化活性，其抗氧化活性與抗氧化肽的劑量呈正相關(guān)，其中Alcalase 2.4L水解能力、酶解液抗氧化能力最強。還研究了熱處理、超聲、均質(zhì)等預(yù)處理方式對水解能力、抗氧化能力的影響，發(fā)現(xiàn)均質(zhì)對酶解產(chǎn)物的影響最大。

擬黑多刺蟻，抗氧化作用，水解度(DH)，自由基

WANG Jing，LIU Tong－xun*

(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

自Harman提出自由基理論后，人們意識到體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人的衰老和許多疾病有關(guān)［1］?；瘜W(xué)抗氧化劑毒副作用的制約使人們把目光逐步轉(zhuǎn)向從各種動植物組織中提取的天然抗氧化劑，篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為研究的新趨勢。天然抗氧化肽(主要為肌肽和谷胱甘肽)含量很低，酶法水解條件溫和、降解位點特異性和重復(fù)性高、對產(chǎn)物活性破壞小，己經(jīng)成為制備生物活性肽的主要方向。擬黑多刺蟻是研究最多、應(yīng)用最廣的藥食兩用蟻，具有免疫調(diào)節(jié)、壯陽補腎、抗炎鎮(zhèn)痛、活血化瘀、抗應(yīng)激抗腫瘤、抗疲勞抗衰老、降低膽固醇等多種藥理作用，但目前國內(nèi)外對擬黑多刺蟻水解物抗氧化作用的研究還未見報道。本研究采用酶法水解制備擬黑多刺蟻抗氧化肽，以期為擬黑多刺蟻的深度開發(fā)及抗氧化肽的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擬黑多刺蟻蟻干 產(chǎn)地云南，粉碎，過40目篩，備用;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L)、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 諾維信公司;木瓜蛋白酶 廣州裕立寶國際有限公司;胰酶 E.Merck公司;牛血清蛋白 北京華達(dá)杰瑞公司;福林酚 鼎國生物公司;其他化學(xué)試劑 均為分析純。

凱氏定氮儀 北京思貝得機(jī)電技術(shù)研究所;PHS－3C精密 pH計 上海雷磁儀器廠;SpectrumLab22PC分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;SS350多功能食物攪拌機(jī) 佛山市順德區(qū)容桂家成電器廠;水浴恒溫振蕩器 金壇市宏華儀器廠;PYX－190S－A生化培養(yǎng)箱 KELI科力儀器廠;SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;T25數(shù)顯型分散機(jī) 德國IKA;ALPHA1－4/2－4冷凍干燥機(jī) 德國Christ;JY92－II超聲波細(xì)胞粉碎儀

寧波新芝生物科技股份有限公司;金怡85－1磁力攪拌器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;CN62M/802B低速臺式離心機(jī) 北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

表1 酶解條件及酶活數(shù)據(jù)

表2 不同抗氧化肽理化性質(zhì)

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活 福林酚法GB/T 23527－2009。

1.2.2 抗氧化肽制備

1.2.2.1 酶解 稱取6g螞蟻粉配制底物濃度6%的水溶液(w/w)，升溫至酶解溫度后用 1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH，加入2%的酶(E/S)，保持pH恒定1h，酶解4h后沸水浴10min滅酶，4000r/min離心20min，抽濾，冷凍干燥。測定其理化指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)選定最適蛋白酶，并考察預(yù)處理及酶解過程中pH調(diào)節(jié)對該酶酶解效果的影響。熱處理:90℃，15min;超聲:工作頻率 20kHz，功率 400W，超聲25min，其中工作時間5s，間歇時間5s;均質(zhì):20000r/min，10min;不調(diào)pH:加酶后不調(diào)pH。

1.2.2.2 水浸提 稱取6g螞蟻粉配制底物濃度6%的水溶液(w/w)，攪拌0.5h，4000r/min離心20min，抽濾，冷凍干燥。

1.2.3 理化指標(biāo) 蛋白質(zhì):凱氏定氮法GB/T5009.5－2003;水解度［2］:甲醛法;多肽:福林酚法。

1.2.4 抗氧化指標(biāo) 將各抗氧化肽凍干粉配制成不同濃度的水溶液測定其抗氧化性。

1.2.4.1 羥自由基清除率［3］分別測定0.25、0.5、0.75、1mg/mL樣品的清除率。

1.2.4.2 DPPH·清除率［4］分別測定0.2、0.3、0.4、0.6mg/mL樣品的清除率。

1.2.4.3 還原力測定［5］分別測定 2、4、6、20mg/mL樣品的還原力。

1.2.4.4 鐵螯合能力［6］分別測定 1、2、4、8mg/mL樣品的螯合能力。

1.2.4.5 超氧自由基清除能力［7］取0.1mol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.2，含 2mmol/L EDTA)4.5mL于25℃水浴保溫20min，加入一定體積3mmol/L的鄰苯三酚(實驗前于25℃保溫)和同體積的蒸餾水，迅速搖勻，每隔30s測一次A325nm值，繪制時間與吸光度間的坐標(biāo)圖，計算自氧化速率V1，將其控制在0.050～0.065A/min范圍內(nèi)，線性時間為4.5min，以樣品代替蒸餾水測得 V2。分別測定 4、10、15、20mg/mL 樣品的清除率。

1.2.4.6 亞油酸自氧化速率抑制作用 2mL樣品中加入0.1mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液2mL、2.5%的亞油酸無水乙醇溶液2mL，同時以蒸餾水代替樣品做空白對照，混勻后60℃避光密封放置5d，樣品添加量分別為 0.016、0.08、0.4、2mg/mL。采用硫氰酸鐵法［8］測定脂質(zhì)過氧化程度。

1.2.5 統(tǒng)計分析 繪制清除率與酶解物含量的二元一次方程，計算其IC50;利用SPSS對不同濃度各酶解物的清除率進(jìn)行F檢驗，對理化指標(biāo)及IC50進(jìn)行T檢驗，對調(diào)節(jié)pH和不調(diào)節(jié)pH時酶解物的抗氧化能力進(jìn)行配對比較，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活測定

見表1。

2.2 不同抗氧化肽理化性質(zhì)

從表2可以看出，酶解提高了氨基態(tài)氮含量、多肽含量、蛋白質(zhì)中多肽所占比例及蛋白質(zhì)利用率，除蛋白質(zhì)中多肽所占比例略小外，堿性蛋白酶酶解液理化指標(biāo)最高。

2.3 不同抗氧化肽抗氧化

蛋白質(zhì)酶解過程中，可解離基團(tuán)數(shù)目增加，導(dǎo)致親水性和凈電荷數(shù)增加，分子結(jié)構(gòu)改變使原本埋藏的疏水中心暴露到溶液環(huán)境中。這種結(jié)構(gòu)改變相應(yīng)帶來功能特性和生物活性的改變，從而使肽段具備螯合金屬離子、清除自由基和促進(jìn)過氧化物分解等作用［9］。

從表3、圖1可以得出，除了亞油酸自氧化抑制作用遠(yuǎn)高于抗氧化劑外，酶解物其他各項抗氧化指標(biāo)均低于抗氧化劑;水浸提液超氧自由基清除能力最強，其次堿性蛋白酶、胰酶;水浸提液羥基自由基清除能力最高，其次胰酶、堿性蛋白酶;水浸提液DPPH自由基清除能力最強，其次木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶;浸提液還原力最強，其次風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶;堿性蛋白酶鐵螯合能力最強，其次胰酶、復(fù)合蛋白酶;堿性蛋白酶抑制亞油酸自氧化的能力最強，其次為木瓜蛋白酶、胰酶。從圖1還可以看出，VC前期抗氧化作用甚至優(yōu)于酶解物，但作用時間短暫，只能起到短時間的抗氧化作用。

表3 不同抗氧化肽抗氧化能力(以IC50表示，mg/mL)

表4 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物理化性質(zhì)的影響

表5 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物抗氧化能力的影響(以IC50表示，mg/mL)

圖1 不同抗氧化肽(0.016mg/mL)對亞油酸自氧化的抑制作用

結(jié)合抗氧化肽的理化性質(zhì)，選取堿性蛋白酶為最適蛋白酶。堿性蛋白酶對疏水性氨基酸有較強的專一性，主要形成含有疏水性氨基酸末端的肽段，多數(shù)已確定結(jié)構(gòu)的抗氧化肽N－端或C－端含有疏水性氨基酸或His－，此外，疏水性氨基酸能加強抗氧化肽與多不飽和脂肪酸的相互作用，通過與氧結(jié)合或捕捉脂質(zhì)自由基，延緩脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)［10］。也有學(xué)者認(rèn)為抗氧化肽抑制亞油酸自氧化作用的主要原因不是清除自由基，而是在油分子周圍形成界面膜，防止促脂質(zhì)氧化因子滲透油分子，從而抑制油脂氧化［11］。

2.4 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物理化性質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)變性的實質(zhì)是維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的次級鍵遭到破壞造成天然構(gòu)象解體，蛋白質(zhì)分子變?yōu)闊o秩序的肽鏈狀態(tài)，暴露出了包藏在分子內(nèi)部的活性部位，有利于酶解的進(jìn)行。熱變性的機(jī)制是在較高的溫度下，肽鏈?zhǔn)苓^分的熱振蕩而導(dǎo)致次價鍵遭到破壞，使原來的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［12］。超聲波主要通過空化作用、機(jī)械作用、熱作用，使擬黑多刺蟻干粉收縮、膨脹甚至破碎，蛋白質(zhì)變性，生物分子解聚，同時加速了有效成分的擴(kuò)散［13］。均質(zhì)處理的機(jī)制是利用高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子產(chǎn)生強剪切力、液力沖擊、渦流撕裂，使物料較快的細(xì)化，并使蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)被一定程度破壞，發(fā)生定向的再結(jié)合，形成多孔的蛋白結(jié)構(gòu)［14］。

從表4可知，三種預(yù)處理方式均增加了酶解液的氨基態(tài)氮含量和水解度;超聲和均質(zhì)增加了蛋白質(zhì)含量、多肽含量及蛋白質(zhì)中多肽所占比例，但熱處理則相反;僅均質(zhì)增加了蛋白質(zhì)利用率;隨著酶解的不斷進(jìn)行，酶解液pH不斷降低，酶解過程中不調(diào)控pH時，水解度略微增加，可能是堿性蛋白酶最適pH低于8.0，可溶性蛋白質(zhì)含量隨pH的增大而增大，故蛋白質(zhì)利用率降低。

2.5 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物抗氧化能力的影響

從表5、圖2可以看出，除超聲處理鐵螯合能力略有下降外，三種預(yù)處理方式均提高了酶解液抗氧化能力;均質(zhì)處理除DPPH自由基清除能力稍遜熱處理外，其他抗氧化指標(biāo)均高于其他處理方式，而超聲效果最差;不調(diào)pH除DPPH自由基清除能力、還原力外，其他抗氧化指標(biāo)均低于調(diào)節(jié)pH的。

2.6 酶解物含量與抗氧化性

從表6可以看出，抗氧化肽抑制亞油酸自氧化能力隨抗氧化肽含量的增大而增大，但不同濃度下各抗氧化肽抑制能力強弱順序并不相同，其他抗氧化指標(biāo)均呈現(xiàn)該現(xiàn)象。

2.7 顯著性分析

F檢驗表明酶種類、處理方式及酶解物含量對酶解物抗氧化作用具有顯著性影響。T檢驗顯示除亞油酸自氧化抑制作用外，酶解對擬黑多刺蟻理化指標(biāo)和抗氧化作用有顯著性影響;堿性蛋白酶酶解液理化指標(biāo)中僅蛋白質(zhì)利用率顯著高于其他蛋白酶酶解液外，除羥自由基外，該酶解液抗氧化性與其他酶解液有顯著性差異;除DPPH清除能力外，預(yù)處理方式對酶解液各項指標(biāo)均無顯著性影響;均質(zhì)處理除顯著性提高了亞油酸自氧化抑制作用、DPPH清除能力外，理化性質(zhì)與抗氧化性與其他預(yù)處理方式無顯著性差異;除鐵螯合能力外，調(diào)節(jié)pH的酶解液抗氧化能力顯著優(yōu)于不調(diào)pH時。

表6 不同抗氧化肽對亞油酸自氧化的抑制作用(第5d吸光度，A)

圖2 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物(0.016mg/mL)抑制亞油酸自氧化作用的影響

3 結(jié)論

3.1 擬黑多刺蟻酶解物具有良好的體外抗氧化活性，與木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰酶相比，堿性蛋白酶Alcalase 2.4L水解能力、酶解液抗氧化能力最強。

3.2 熱處理、超聲、均質(zhì)三種處理方式均顯著提高了擬黑多刺蟻水解度，除超聲處理鐵螯合能力略有下降外，三種預(yù)處理方式均提高了酶解液抗氧化能力。均質(zhì)處理除DPPH自由基清除能力稍遜熱處理外，其他抗氧化指標(biāo)均高于其他預(yù)處理方式，而超聲效果最差。

3.3 對比酶解過程中調(diào)節(jié)pH與否對酶解產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)其對水解度和抗氧化活性影響較小，而且不調(diào)節(jié)pH會降低蛋白質(zhì)利用率。

3.4 酶解物抗氧化性與劑量呈正相關(guān)，但不同濃度下各酶解物抗氧化能力強弱順序并不相同。

［1］Harman D.Aging:a theory based on free radical and radiation chemistry［J］.Journal of Gerontology，1956(11):298－300.

［2］大連輕工業(yè)學(xué)院，華南理工大學(xué)，鄭州輕工業(yè)學(xué)院，等.食品分析［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1994:234－235.

［3］de Avellar I G，Magalh?es M M，Silva A B，et al.Reevaluating the role of 1，10－ phenanthroline in oxidative reactions involving ferrous ions and DNA damage［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1675:46－53.

［4］Saiga A，Tanabe S，Nishimura T.Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment［J］.J Agric Food Chem，2003，51(12):3661－3667.

［5］Yen G C，Chen H Y.Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity［J］.J Agric Food Chem，1995，43(1):27－32.

［6］Decker E A，Welch B.Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food［J］.J Agric Food Chem，1990，38(3):674－677.

［7］Yu W L，Zhao Y P，Xue Z，et al.The antioxidant properties of lycopene concentrate extracted from tomato paste［J］.Journal of the American Oil Chemists Society，2001，78(7):697－701.

［8］Saha K，Lajisa N H，Israfa D A，et al.Evaluation of antioxidant and nitric oxide inhibitory activitiesofselected malaysian medicinal plants［J］.J Ethnopharmacol，2004，92:263－267.

［9］Park J H，Jeong H J，de Lumen B O.In vitro digestibility of the cancer－preventive soy peptides lunasin and BBI ［J］.J Agric Food Chem，2007，55(26):10703－10706.

［10］張昊，任發(fā)政.天然抗氧化肽的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2008，29(4):443－447.

［11］Hirose A，Miyashita K.Inhibitory effect of proteins and their hydolysateson the oxidation oftriacylglycerols containing docosahexaenoic acids in emulsion［J］.Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology，1999，46(12):799－805.

［12］李娟.基于球狀蛋白和葡聚糖自組裝制備具有核殼結(jié)構(gòu)的納米凝膠及其作為藥物載體的初步研究［D］.復(fù)旦大學(xué)先進(jìn)材料與技術(shù)研究院，2008.

［13］黃國平.玉米醇溶蛋白的超聲波提取、改性與釋藥性能的研究［D］.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，2004.

［14］郭維靜.玉米蛋白水解制取玉米肽的研究［D］.大連理工大學(xué)化工學(xué)院，2006.

Preparation of antioxidant peptides from Polyrhachis vicina Roger by enzymatic hydrolysis

Polyrhachis vicina Roger was hydrolyzed by Alcalase 2.4L，papain，protamex，flavourzyme and pancreatin respectively.Six indexes including the scavenging activities of superoxide radical，DPPH · and hydroxyl radical，reducing power，F(xiàn)e2+chelating ability，inhibitory ability against oxidation of linoleic acid were used to evaluate antioxidant activity of enzymatic hydrolysates.The protease was optimized by the index such as degree of hydrolysis(DH)，yield of protein and peptides content，as well as the antioxidant activity.The results showed that enzymatic hydrolysates had good in vitro antioxidative activity，which was positively correlated with the amount of peptide content.Among the enzymes，alcalase 2.4L showed highest hydrolytic and antioxidant ability.The influences of heat，ultrasonic treatment and homogenization on the hydrolytic ability and the antioxidant ability of the resultant hydrolysates were measured，and the results showed that homogenization had the greatest impact on enzymatic hydrolysates.

Polyrhachis vicina Roger;antioxidant activity;degree of hydrolysis(DH);radical

TS201.2

B

1002－0306(2011)06－0260－04

2010－06－28 *通訊聯(lián)系人

王婧(1986－)，女，在讀碩士，研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程。