α-乳蛋白提取工藝研究及副產(chǎn)物功能性質(zhì)評(píng)價(jià)

閆序東，王彩云，云戰(zhàn)友，尹睿杰

(伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司技術(shù)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010080)

α-乳蛋白提取工藝研究及副產(chǎn)物功能性質(zhì)評(píng)價(jià)

閆序東，王彩云，云戰(zhàn)友*，尹睿杰

(伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司技術(shù)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010080)

研究了熱附聚法結(jié)合凝乳酶處理從牛乳中直接提取α－乳白蛋白的工藝，得到富含α－乳白蛋白的乳清和副產(chǎn)物——附聚β－乳清蛋白的凝乳酶干酪素。富含α－乳白蛋白的乳清中α－乳白蛋白與β－乳球蛋白的濃度比達(dá)到3.03，達(dá)到了商業(yè)化產(chǎn)品的水平。副產(chǎn)物——附聚β－乳清蛋白的凝乳酶干酪素與市售凝乳酶干酪素在溶解性、持水性和乳化性方面存在的差異較小，將附聚β－乳清蛋白的凝乳酶干酪素作為原料應(yīng)用于仿真干酪中，質(zhì)構(gòu)測(cè)定結(jié)果未顯示出在質(zhì)構(gòu)方面與普通凝乳酶干酪素對(duì)照樣品存在明顯差異。

α－乳白蛋白，凝乳酶干酪素，功能性質(zhì)

α－乳白蛋白具有半乳糖轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)作用，能催化葡萄糖在乳房細(xì)胞中合成乳糖，且含有很高比例的色氨酸及半胱氨酸，色氨酸是神經(jīng)傳遞介質(zhì)5－羥色胺的前體，它代謝成為褪黑激素。兩者對(duì)胃口、情緒、痛覺、睡眠及生物鐘等神經(jīng)性反應(yīng)的調(diào)節(jié)具有重要功能。而半胱氨酸既是谷胱甘肽的組分，也是合成牛磺酸的前體［1－3］。因此，對(duì)牛奶中α－乳白蛋白的研究和對(duì)富含α－乳白蛋白的乳清和乳清粉的制備工藝的探索具有十分重大的意義。目前常見的提取α－乳白蛋白的方法有離子交換法、膜分離法、等電點(diǎn)沉淀法和熱附聚法，前3種方法都是以乳清作為原料的，熱附聚法則可以以鮮乳作為原料，因此該法更符合我國(guó)乳清資源不足的實(shí)際國(guó)情。熱附聚法提取α－乳白蛋白的原理是，α－乳白蛋白和β－乳球蛋白受熱后首先發(fā)生變性，空間結(jié)構(gòu)展開并暴露出巰基，β－乳球蛋白的巰基十分活躍，通過巰基－二硫鍵交換反應(yīng)而與α－乳白蛋白、酪蛋白發(fā)生聚合，而α－乳白蛋白以α－乳白蛋白－β－乳球蛋白復(fù)合物的形式間接與酪蛋白發(fā)生聚合，關(guān)于這兩種蛋白質(zhì)變性的動(dòng)力學(xué)規(guī)律研究有許多報(bào)道［4－6］，文獻(xiàn)普遍得出的結(jié)論:β－乳球蛋白與α－乳白蛋白在特定條件下的變性和聚合速率存在差異，β－乳球蛋白與酪蛋白的附聚速率和附聚程度均高于α－乳白蛋白。因此，采取適當(dāng)?shù)姆蛛x手段將β－乳球蛋白/酪蛋白附聚物與未附聚的α－乳白蛋白分離即可以達(dá)到富集α－乳白蛋白的目的。本研究以熱附聚法結(jié)合凝乳酶的作用實(shí)現(xiàn)了對(duì)α－乳白蛋白的分離提取，得到富含α－乳白蛋白的乳清及副產(chǎn)物——附聚乳清蛋白的凝乳酶干酪素。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

鮮牛乳 伊利集團(tuán);凝乳酶 科漢森公司;乳化鹽 Joho牌;大豆油 福臨門牌;α－乳白蛋白、β－乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、尿素、1，3－雙［三(羥甲基)甲基］丙烷、羥丙基甲基纖維素、檸檬酸、檸檬酸三鈉、福林酚試劑、ANS試劑、β－巰基乙醇 均購(gòu)自Sigma公司;鹽酸、氫氧化鈉 天津化學(xué)試劑廠。

MDQ毛細(xì)管電泳儀 配備二級(jí)管陣列檢測(cè)器，Beckman P/ACE Station工作站，未涂層熔融石英毛細(xì) 管 (45cm × 50μm i.d.，Polymicro Technologies，Phoenix，AZ，USA)，Beckman 公司;超速離心機(jī)

Sigma公司;電子天平 賽多利斯公司;乳脂分離機(jī)

青海農(nóng)牧機(jī)械廠;高速剪切均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;熒光光度計(jì) 島津;紫外－可見分光光度計(jì)

普析通用儀器公司;實(shí)驗(yàn)室常規(guī)玻璃儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 熱處理 將脫脂乳分裝于試管中，在水浴鍋中進(jìn)行熱處理，熱處理后迅速于冰水中冷卻。

1.2.2.2 酶凝 在經(jīng)過熱處理的脫脂乳中添加活力為20000U/g的凝乳酶0.01%及0.1%的氯化鈣，酶凝30min后，紗布過濾分離乳清與凝塊。

1.2.3 毛細(xì)管電泳法檢測(cè)α－乳白蛋白和β－乳球蛋白

1.2.3.1 樣品預(yù)處理 待測(cè)乳樣經(jīng)60000×g，10℃，40min離心處理以沉降變性聚集的乳清蛋白/酪蛋白復(fù)合物，取清液并以1∶4的比例與pH7.5尿素緩沖液混合，加入少量巰基乙醇后待測(cè)。

1.2.3.2 檢測(cè)條件 運(yùn)行緩沖液為pH3.0的檸檬酸緩沖液，分離電壓:25kV;柱溫:25℃;二極管陣列檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。

1.2.4 提取工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 pH 將鮮脫脂乳調(diào)節(jié)至不同的pH，在80℃下保溫15min，之后檢測(cè)α－乳白蛋白及β－乳球蛋白濃度。

1.2.4.2 熱處理溫度與時(shí)間 將鮮脫脂乳調(diào)節(jié)至一定pH，在不同的溫度下保溫不同的時(shí)間后，檢測(cè)α－乳白蛋白及β－乳球蛋白濃度。

1.2.4.3 正交實(shí)驗(yàn) 選取單因素實(shí)驗(yàn)的pH、熱處理溫度、時(shí)間的較優(yōu)水平，進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)的因素水平選取見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5 附聚β－乳清蛋白凝乳酶干酪素功能性質(zhì)的測(cè)定

1.2.5.1 溶解性 稱取一定質(zhì)量的干酪素(干酪素的蛋白質(zhì)含量以凱式定氮法測(cè)定)，以純水配制成酪蛋白溶液(保證干酪素始終處于過飽和狀態(tài))，調(diào)節(jié)至一定的 pH，磁力攪拌4h后靜置過夜，離心分離(4000×g，10min)，上清液的蛋白質(zhì)濃度以福林酚法測(cè)定［7］。

溶解度(%)=上清液蛋白含量×上清液體積×稀釋倍數(shù)/(樣品質(zhì)量×樣品粗蛋白含量)×100%1.2.5.2 乳化性 采用濁度法［8］:取300mL 0.2%蛋白溶液，加入100mL色拉油，10000r/min下攪拌2min，從底部吸取乳化液50μL稀釋于5mL 0.1%SDS中，以0.1%SDS為對(duì)照，測(cè)定500nm處吸光值(A)。

1.2.5.3 持水性 由于凝乳酶干酪素在純水中的溶解性不佳，又考慮到再制干酪是凝乳酶干酪素在食品行業(yè)中最主要的應(yīng)用領(lǐng)域，因此持水性的測(cè)定條件盡量接近再制干酪的加工條件。

稱取5g干酪素溶于25g水中，加入1%的乳化鹽，升溫至85℃，維持30min，整個(gè)過程維持快速攪拌狀態(tài)，離心(4000×g，10min)除去上清液，對(duì)沉淀物稱重。

1.2.6 附聚β－乳清蛋白凝乳酶干酪素在仿真干酪中的應(yīng)用研究 凝乳酶干酪素在食品行業(yè)最主要的應(yīng)用領(lǐng)域是作為再制干酪的原料。由于自制的凝乳酶干酪素與商品化凝乳酶干酪素相比，在酪蛋白表面附聚了乳清蛋白，將自制凝乳酶干酪素應(yīng)用于仿真干酪中以考察附聚的乳清蛋白對(duì)再制干酪的影響。

1.2.6.1 仿真干酪的配方 凝乳酶干酪素添加量為10%的配方:水50%，黃油 25%，凝乳酶干酪素10%，全脂乳粉8%，甜乳清粉4%，乳化鹽1.5%，氯化鈉0.6%，乳酸0.5%，親水膠(黃原膠∶刺槐豆膠∶瓜爾豆膠 =2∶2∶1)0.3% 。

凝乳酶干酪素添加量為7%的配方:在上述配方基礎(chǔ)上調(diào)整水為53%，凝乳酶干酪素7%，其它不變。1.2.6.2 仿真干酪的制作工藝 以總水量的80%溶解乳化鹽，之后在45℃下加入凝乳酶干酪素，同時(shí)施加低速攪拌，約30min后，酪蛋白充分水合，無顆粒質(zhì)感。加入全脂乳粉、甜乳清粉、預(yù)先溶解的親水膠、氯化鈉及黃油，升溫至95℃，在升溫過程中，黃油逐漸被乳化并包裹至酪蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)中，以1200r/min剪切2min，之后加入乳酸，攪拌均勻后，再以1200r/min剪切10min，快速冷卻，4℃儲(chǔ)藏。

1.2.6.3 仿真干酪的質(zhì)構(gòu)測(cè)定 質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定參數(shù):探頭為P/1S，測(cè)前速度1mm/s，測(cè)試速度 0.5mm/s，測(cè)后速度10mm/s，壓力100g。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱附聚工藝條件的優(yōu)化

2.1.1 pH 脫脂乳的pH對(duì)α－乳白蛋白純度及濃度的影響見圖1。

以Cα/Cβ間接代表α－乳白蛋白的純度。由圖1可知，pH對(duì)α－乳白蛋白的純度影響較大，牛乳的pH約為5.0時(shí)，Cα/Cβ達(dá)到3以上，而pH對(duì)α－乳白蛋白的濃度影響相對(duì)較小，因此，pH為5.0～5.4之間時(shí)，提取效果較好。

圖1 pH對(duì)α－乳白蛋白純度及濃度的影響

2.1.2 熱處理溫度與時(shí)間 將脫脂乳的pH固定為5.0，對(duì)脫脂乳進(jìn)行不同溫度－時(shí)間組合的熱處理。結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 加熱溫度及時(shí)間對(duì)α－乳白蛋白純度的影響

圖3 加熱溫度及時(shí)間對(duì)α－乳白蛋白濃度的影響

由圖2和圖3可知，熱處理溫度和時(shí)間對(duì)α－乳白蛋白的純度及濃度的影響具有較強(qiáng)的規(guī)律性。溫度越高，時(shí)間越長(zhǎng)，則α－乳白蛋白和β－乳球蛋白的變性速率和變性程度也越高，它們與酪蛋白的附聚程度也相應(yīng)提高。因此，圖3反映出α－乳白蛋白的濃度隨著熱處理溫度的提高以及時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降的明顯趨勢(shì)。另一方面，由于β－乳球蛋白與酪蛋白膠束的附聚速率及附聚程度高于α－乳白蛋白，所以，α－乳白蛋白與β－乳球蛋白的濃度比隨溫度升高而提高，在75～80℃達(dá)到最高，之后隨著α－乳白蛋白和β－乳球蛋白的變性和附聚速率差異的縮小，α－乳白蛋白與β－乳球蛋白的濃度比又逐漸下降。因此，優(yōu)選75～80℃，15～25min作為熱處理?xiàng)l件。

2.1.3 正交實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可以得出，對(duì)α－乳白蛋白濃度影響的主次因素依次為:時(shí)間>溫度>pH，最優(yōu)條件為 pH5.0，72℃，15min。

對(duì)α－乳白蛋白純度影響的主次因素依次為:溫度>pH>時(shí)間，最優(yōu)條件為pH5.2，80℃，20min。因此，綜合考慮純度和濃度，選擇pH5.0，80℃，15min為較優(yōu)提取工藝條件，在此條件下，α－乳白蛋白與β－乳球蛋白的濃度比達(dá)到3.03，達(dá)到了商業(yè)化產(chǎn)品的水平，α－乳白蛋白得率為43.1%。

圖4 正交條件對(duì)α－乳白蛋白濃度的影響

表2 正交條件對(duì)α－乳白蛋白濃度的影響

2.2 附聚β－乳清蛋白凝乳酶干酪素功能特性的評(píng)價(jià)

2.2.1 溶解性 根據(jù)物料守恒定律，由鮮乳和富含α－乳白蛋白的乳清中的乳清蛋白含量可以計(jì)算出自制附聚了乳清蛋白的凝乳酶干酪素表面乳清蛋白的附聚量為0.14g乳清蛋白/g酪蛋白。

市售及自制凝乳酶干酪素在不同pH水溶液中的溶解性能見圖4和圖5。

圖4 市售與自制凝乳酶干酪素的溶解度(pH2～12)

自制凝乳酶干酪素產(chǎn)品的酪蛋白表面附聚了β－乳球蛋白和少量α－乳白蛋白，這是導(dǎo)致自制干酪素與市售干酪素在溶解性方面存在差別的主要原因。由圖5、圖6可知，由于干燥設(shè)備等實(shí)驗(yàn)條件的限制，自制的凝乳酶干酪素總體溶解性差于市售凝乳酶干酪素產(chǎn)品。然而值得注意的是，在弱酸性至中性的pH范圍內(nèi)，自制凝乳酶干酪素的溶解性優(yōu)于市售產(chǎn)品，這是因?yàn)楦骄鄣娜榍宓鞍拙哂休^高的溶解度的緣故。

2.2.2 乳化性 乳化能力及乳化穩(wěn)定性見圖6。

表4 仿真干酪的質(zhì)構(gòu)結(jié)果

圖5 市售與自制凝乳酶干酪素的溶解度(pH3～8)

圖6 凝乳酶干酪素的乳化性質(zhì)

酪蛋白的乳化性能優(yōu)于乳清蛋白，而自制凝乳酶干酪素所附聚的乳清蛋白量很少，不足以對(duì)乳化性造成較大的影響，因此，自制凝乳酶干酪素與市售凝乳酶干酪素的乳化能力及乳化穩(wěn)定性接近。有可能附聚在酪蛋白膠束表面的變性乳清蛋白將疏水基團(tuán)暴露于表面，提高了乳化能力，然而乳清蛋白的吸附降低了界面粘膜的粘度，從而降低了乳化穩(wěn)定性。2.2.3 持水性 對(duì)某公司的凝乳酶干酪素、自制普通凝乳酶干酪素及自制附聚乳清蛋白的凝乳酶干酪素進(jìn)行了持水性的測(cè)定比較。結(jié)果見表3。

表3 凝乳酶干酪素持水性比較

酪蛋白的持水能力大大強(qiáng)于乳清蛋白，盡管乳清蛋白變性后持水性有所增加，但由表3可知，附聚了變性乳清蛋白的凝乳酶干酪素的持水性略低于未附聚乳清蛋白的凝乳酶干酪素。

2.2.4 仿真干酪的質(zhì)構(gòu) 對(duì)10%和7%兩個(gè)凝乳酶干酪素的添加水平做了考察，結(jié)果見表4。

由表4可知，隨著凝乳酶干酪素的添加量下降，仿真干酪的硬度也相應(yīng)下降，但在同一添加量水平下，普通凝乳酶干酪素和附聚乳清蛋白的凝乳酶干酪素的硬度差異不大。

3 結(jié)論

3.1 熱處理結(jié)合凝乳酶作用可以作為一種新型的提取α－乳白蛋白的方法，實(shí)驗(yàn)室小試條件下，α－乳白蛋白與β－乳球蛋白濃度比達(dá)到3.03，α－乳白蛋白得率為43.1%。

3.2 同時(shí)得到的副產(chǎn)物——附聚乳清蛋白的凝乳酶干酪素與市售凝乳酶干酪素在溶解性、持水性方面存在小的差異，乳化性差異很小。

3.3 將附聚乳清蛋白的凝乳酶干酪素作為原料應(yīng)用于仿真干酪中，質(zhì)構(gòu)測(cè)定結(jié)果未顯示出在質(zhì)構(gòu)方面與普通凝乳酶干酪素對(duì)照樣品存在明顯差異。

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Process for producing α－lactalbumin－enriched whey and evaluation of functional properties of rennet casein

YAN Xu－dong，WANG Cai－yun，YUN Zhan－you*，YIN Rui－jie
(Technology Center，Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.，Ltd.，Hohhot 010080，China)

A process for producing α－lactalbumin－enriched fraction from milk was investigated.The process involved heating pH － adjusted skim milk and rennet treatment.The ratio of the concentration of α － lactalbumin to β －lactoglobulin was high enough to meet the level of commercial products.In addition to α－lactalbumin－enriched whey，rennet casein complex with whey proteins was obtained.The difference of solubility，water－ holding capacity and emulsifying capacity between the casein/whey proteins aggregates and normal rennet casein were small and no obvious differences of texture of cheese analogue made of the casein/whey proteins aggregates and normal rennet casein were found.

α－lactalbumin;rennet casein;functional properties

TS201.2+1

B

1002－0306(2011)06－0253－04

2010－07－02 *通訊聯(lián)系人

閆序東(1983－)，男，研發(fā)工程師，研究方向:乳品加工技術(shù)?；痦?xiàng)目:國(guó)家十一五科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2006BAD04A06)。