發(fā)酵玉米黃漿水與廢糖蜜生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的菌種生長特性研究

李小雨，馬 鶯，王 璐

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090)

發(fā)酵玉米黃漿水與廢糖蜜生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的菌種生長特性研究

李小雨，馬 鶯，王 璐

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090)

通過對玉米提取結(jié)晶糖后的黃漿水與糖蜜中粗蛋白、非蛋白氮、總糖、還原糖、磷、水分、粗灰分、葉黃素、礦物質(zhì)元素成分的分析，選擇產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、白地霉(Geotrichum candidum)和熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)3種常見的工業(yè)酵母菌，通過對黃漿水與糖蜜混合液搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，研究三種酵母的生長特性，并篩選最佳的發(fā)酵菌種的組合。結(jié)果表明，當(dāng)白地霉與熱帶假絲酵母兩菌種等量混合發(fā)酵時，所得的單細(xì)胞蛋白干物質(zhì)重量最大為5.87g，其中蛋白含量高達(dá)1.78g/100mL。

黃漿水，糖蜜，單細(xì)胞蛋白，篩選

我國是玉米的主要生產(chǎn)國之一，全國用玉米生產(chǎn)淀粉糖的廠家有數(shù)千個，其下腳料大多未被合理利用。據(jù)調(diào)查，一個生產(chǎn)3000t淀粉糖的廠家，排放的下腳料高達(dá)1500t。在淀粉糖廠，這些廢料因缺乏適當(dāng)?shù)奶幚砗烷L期放置而發(fā)霉變臭，嚴(yán)重污染了環(huán)境并造成了國家資源的浪費。另外，有的制糖廠在生產(chǎn)淀粉糖后，下腳料直接用于飼養(yǎng)動物，其經(jīng)濟(jì)效益非常低，并且動物食用后營養(yǎng)吸收不是很好，特別是玉米中的纖維素等物質(zhì)不易消化吸收。本研究主要利用多菌種對玉米糖廠提取結(jié)晶糖后，所廢棄的黃漿水和廢糖蜜進(jìn)行發(fā)酵，將其轉(zhuǎn)化成利益巨大的單細(xì)胞蛋白飼料［1］。本文主要對黃漿水與廢糖蜜中所包含的主要成分進(jìn)行分析，明確其營養(yǎng)成分，并第一次將黃漿水與糖蜜混合液作為發(fā)酵原料;其次分別對3種工業(yè)酵母的生長特性進(jìn)行研究，并利用三種酵母以不同組合方式進(jìn)行發(fā)酵，篩選出優(yōu)良的發(fā)酵菌種進(jìn)行單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)，從而在一定程度上解決資源浪費和環(huán)境污染等問題［2］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)朊假絲酵母 (Candida utilis)、白地霉(Geotrichum candidum)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) 由黑龍江省微生物研究所提供;實驗所用黃漿水與糖蜜 取自牡丹江制糖企業(yè);麥芽汁培養(yǎng)基 10°Bx的麥芽汁;發(fā)酵培養(yǎng)基 黃漿水與糖蜜之比為1∶1的發(fā)酵液，pH自然，121℃滅菌15min［3］;尿素、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、次甲基藍(lán)、甲基紅、鉬酸銨、偏釩酸銨、磷酸二氫鉀、蒽酮、硫脲、葡萄糖、酒石酸鉀、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硝酸 均為分析純。

HYA恒溫?fù)u床，TH－CB－401超凈臺，HG303－5電熱恒溫培養(yǎng)箱，pHs－3TC精密數(shù)顯酸度計，XSP－18A光學(xué)顯微鏡，LIBROR.EB－280電子天平，YXQ－5G41280電熱手提式壓力蒸汽消毒器，血球計數(shù)板，SK－1型快速混勻器，721型分光光度計，原子吸收光譜儀，凱氏定氮儀，高溫爐，可調(diào)電熱爐，101－1－Bs電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器，星輝GL－10ML離心機。

表1 黃漿水與糖蜜的組成成分(%)

表2 黃漿水中所含的礦物質(zhì)元素組成成分(%)

1.2 測定方法

1.2.1 粗蛋白的測定 凱氏定氮法［4］。

1.2.2 真蛋白的測定 三氯乙酸沉降法、凱氏定氮法［5］。

1.2.3 總糖的測定 蒽酮硫酸法［6］。

1.2.4 還原糖的測定 直接滴定法［7］。

1.2.5 磷的測定 分光光度法［8］。

1.2.6 葉黃素的測定 分光光度法［9］。

1.2.7 粗灰分的測定 直接灼燒法［10］。

1.2.8 水分的測定 恒重蒸發(fā)法。

1.2.9 礦物質(zhì)元素的測定 原子吸收光譜［11］。

1.3 菌種的篩選

1.3.1 菌種種子液的制備

1.3.1.1 菌種活化 分別挑取保藏于冰箱中的3種斜面酵母菌種，接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基(10°Bx)中，在30℃，180r/min搖床培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)72h，傳代，備用。

1.3.1.2 種子液的制備 從麥芽汁液體培養(yǎng)基中以2%的接種量接種于裝有50mL麥芽汁培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng) 72h，備用。

1.3.1.3 菌數(shù)的測定 從培養(yǎng)72h的種子液中無菌操作取出1mL種子液，利用血球板計數(shù)法在顯微鏡下測出種子液菌數(shù)的濃度［12］。

1.3.2 生長曲線的測定 a.分別以10%的總接種量接種三種酵母濃度為 107個/mL種子液于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃，180r/min搖床培養(yǎng)。b.每隔4h取發(fā)酵液在4000r/min離心15min，烘干，測其干物質(zhì)重量;每隔8h測其粗蛋白含量。c.分別繪制三種酵母的干物質(zhì)重量變化曲線和粗蛋白含量變化曲線。

1.3.3 菌種的發(fā)酵篩選 a.分別將產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母∶白地霉(1∶1)、產(chǎn)朊假絲酵母∶熱帶假絲酵母(1∶1)、白地霉∶熱帶假絲酵母(1∶1)、產(chǎn)朊假絲酵母∶白地霉∶熱帶假絲酵母(1∶1∶1)的菌種組合以總濃度為107個/mL的接種液接種到100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180r/min搖床培養(yǎng)到其最大生長量［13］。b.發(fā)酵培養(yǎng)后取發(fā)酵液在4000r/min離心15min，烘干，測其干物質(zhì)重量。c.取適量的烘干后的單細(xì)胞蛋白飼料，利用凱氏定氮法測其粗蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料分析

通過對黃漿水和糖蜜中的粗蛋白、總糖、還原糖、水分、粗灰分、葉黃素的含量進(jìn)行測定，如表1所示。

對原料中的含磷量、非蛋白氮的含量以及礦物質(zhì)元素的含量進(jìn)行檢測，如表2所示。

實驗結(jié)果表明，原料中的碳源、氮源、礦物質(zhì)元素以及微量元素進(jìn)行檢測分析得出玉米黃漿水與糖蜜的混合液中:玉米黃漿水的水分含量高達(dá)90.55%，碳源基本上為0、葉黃素含量為0.1366%占干重，粗蛋白含量幾乎沒有，而礦物質(zhì)元素含量比較豐富，足夠酵母細(xì)胞正常生長利用;糖蜜中含有豐富的碳源，總糖含量高達(dá)49.38%，還原糖含量為16.21%，而氮源、促生長因子等含量幾乎為0。玉米黃漿水中含有豐富的礦物質(zhì)元素以及一些促生長因子，可以很好地彌補糖蜜中只有碳源而沒有其他酵母生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，固將二者混合作為單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)的發(fā)酵液。通過對酵母生長所必須的C/N可知酵母最適的C/N比為4/1，玉米黃漿水與糖蜜的混合液中添加少量氮源，其余養(yǎng)分足夠酵母正常的生長發(fā)酵［14］。

2.2 生長曲線的測定

測定酵母的生長曲線不但可以了解酵母的生長變化情況，而且還可以清楚地了解酵母的對數(shù)生長期、衰亡期以及它的一些生長特性，從而更好地生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料。另外，從酵母的生長曲線還可以得出酵母繁殖到最大量的時間，以及在隨后穩(wěn)定期的生長中酵母細(xì)胞是否會產(chǎn)生自溶影響單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)。而干物質(zhì)重量中粗蛋白的含量能更好地反映隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌體不斷增殖，發(fā)酵液的粗蛋白含量也隨之增加，為后續(xù)的研究打下好的基礎(chǔ)。2.2.1 產(chǎn)朊假絲酵母 圖1與圖2分別表示為產(chǎn)朊假絲酵母在搖瓶發(fā)酵過程中的干物質(zhì)重量變化和粗蛋白含量變化情況。從圖中我們可以得出，在10～12h時，由于產(chǎn)朊假絲酵母的生長消耗了發(fā)酵液中的糖分等營養(yǎng)物質(zhì)，因此發(fā)酵液的干物質(zhì)重量呈下降趨勢。當(dāng)發(fā)酵12～24h時，由于產(chǎn)朊假絲酵母到達(dá)了對數(shù)生長期，發(fā)酵液的干物質(zhì)重量急劇上升，之后呈穩(wěn)定趨勢。當(dāng)在第48h時，發(fā)酵液的干物質(zhì)重量達(dá)到最大為5.84g，與其對應(yīng)的粗蛋白含量也達(dá)到了最大為1.29/100mL。在隨后的繼續(xù)發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的干物質(zhì)重量和粗蛋白含量持續(xù)下降。

經(jīng)分析，由于當(dāng)酵母接種于發(fā)酵液中，酵母有一個適應(yīng)的階段，進(jìn)入了微生物的延遲期;此后隨著酵母細(xì)胞的大量增殖，發(fā)酵液中的養(yǎng)分也不斷的被分解利用，酵母生長進(jìn)入了對數(shù)生長期;隨著后續(xù)發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中營養(yǎng)成分的不斷消耗，以及發(fā)酵液環(huán)境的改變，發(fā)酵液中的環(huán)境不再適合酵母的生長，酵母細(xì)胞開始自溶，發(fā)酵液干物質(zhì)下降，粗蛋白含量也逐漸減少。

圖1 產(chǎn)朊假絲酵母的干物質(zhì)重量隨時間變化的關(guān)系

圖2 產(chǎn)朊假絲酵母的粗蛋白含量隨時間變化的關(guān)系

2.2.2 白地霉 白地霉是一種酵母屬的霉菌，水解蛋白的能力強，環(huán)境適應(yīng)能力好，非常適合發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。它對蛋白質(zhì)、多糖、油脂等生物質(zhì)具有較強分解和轉(zhuǎn)化能力。了解白地霉的生長特性，對后續(xù)的研究有著非常必要的作用。圖3與圖4分別為白地霉在搖瓶發(fā)酵過程中的干物質(zhì)重量變化與粗蛋白含量的變化情況。圖中所示，在0～12h內(nèi)，由于白地霉的生長消耗了發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分，因此發(fā)酵液的干物質(zhì)重量呈下降趨勢。當(dāng)發(fā)酵12～40h時，酵母的大量生長繁殖，發(fā)酵液的干物質(zhì)重量也逐漸增大，與之對應(yīng)的粗蛋白含量也不斷增大，到第40h，發(fā)酵液的干物質(zhì)重量達(dá)到最大為5.61g，粗蛋白含量高達(dá)1.37g/100mL。之后的發(fā)酵過程中發(fā)酵液的干物質(zhì)重量與粗蛋白含量呈下降趨勢。分析是由于發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)被白地霉所消耗利用，并且酵母細(xì)胞生長所生成的次級代謝產(chǎn)物等改變了酵母細(xì)胞的生長環(huán)境，白地霉細(xì)胞自溶，干物質(zhì)重量與粗蛋白含量下降。

圖3 白地霉的干物質(zhì)重量隨時間變化的關(guān)系

2.2.3 熱帶假絲酵母 熱帶假絲酵母是降解轉(zhuǎn)化玉米粉和烴類有機物較強的一類酵母，可利用各種糖類滿足自身生長的需要，也是世界上生產(chǎn)SCP的主要菌種之一。圖5與圖6分別是熱帶假絲酵母在搖瓶發(fā)酵過程中干物質(zhì)重量的變化與粗蛋白含量的變化情況。在0～28h發(fā)酵過程中，由于原料的大量分解、營養(yǎng)成分的消耗轉(zhuǎn)化，盡管有大量的熱帶假絲酵母生成，但仍然是分解轉(zhuǎn)化消耗的成分大于生成的成分，因此熱帶假絲酵母的干物質(zhì)重量呈下降趨勢。在隨后的28～44h內(nèi)，由于大量的酵母所需營養(yǎng)成分的存在，熱帶假絲酵母呈對數(shù)生長，在第44h，發(fā)酵液的干物質(zhì)重量達(dá)到最大為5.78g，而其粗蛋白含量在第48h達(dá)到最大為1.25g/100mL。

圖4 白地霉的粗蛋白含量隨時間變化的關(guān)系

圖5 熱帶假絲酵母的干物質(zhì)重量隨時間變化的關(guān)系

圖6 熱帶假絲酵母的粗蛋白含量隨時間變化的關(guān)系

經(jīng)分析，當(dāng)發(fā)酵到第44h，由于酵母細(xì)胞的繁殖生成量大于其消耗分解的營養(yǎng)物質(zhì)，此時發(fā)酵液的干物質(zhì)重量達(dá)到最大。隨后酵母細(xì)胞繼續(xù)增殖，逐漸消耗發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)，到達(dá)第48h，酵母細(xì)胞分解利用的營養(yǎng)物質(zhì)大于酵母細(xì)胞的生成量，發(fā)酵液的干物質(zhì)重量呈下降趨勢，而此時發(fā)酵液中的粗蛋白含量達(dá)到最大。在后續(xù)的發(fā)酵過程中，由于酵母細(xì)胞的自溶，發(fā)酵液的干物質(zhì)重量及粗蛋白含量均呈下降趨勢。

2.3 菌種的篩選

圖7和圖8分別是采用7種不同的酵母組合發(fā)酵所得到的干物質(zhì)重量和粗蛋白含量。從圖7中可以看出白地霉與熱帶假絲酵母混合發(fā)酵時所得到的干物質(zhì)重量最大為5.87g。如圖8所示，當(dāng)白地霉與熱帶假絲酵母混合發(fā)酵時，所得的干物質(zhì)中含粗蛋白最高為1.78g/100mL。

經(jīng)分析，由于白地霉與熱帶假絲酵母互利共生，其生長優(yōu)于各單菌種發(fā)酵。發(fā)酵液中的一些糖蜜等大分子物質(zhì)不能完全被熱帶假絲酵母所利用，但由于白地霉的存在，可以水解消化發(fā)酵液中的一些大分子營養(yǎng)物質(zhì)，使其更好地被自身以及熱帶假絲酵母所分解利用吸收，達(dá)到共生互利的作用，極大地促進(jìn)了單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)。因此選擇白地霉與熱帶假絲酵母作為生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白發(fā)酵的混合菌種。

圖7 菌種組合的發(fā)酵與干物質(zhì)重量之間的關(guān)系

圖8 菌種組合的發(fā)酵與粗蛋白含量之間的關(guān)系

3 結(jié)論

玉米提取結(jié)晶糖后的黃漿水與糖蜜中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，其中糖蜜中所含總糖量高達(dá)49.38%，還原糖的含量為16.21%。黃漿水中也含有充足的礦物質(zhì)元素，將其二者混合需添加少量的氮源，其余營養(yǎng)成分足夠酵母正常生長繁殖。實驗所選用的三種酵母均能夠利用黃漿水與糖蜜快速生長繁殖。其中，白地霉與熱帶假絲酵母(1∶1)在黃漿水∶糖蜜為1∶1的發(fā)酵液100mL，總接種量為10%，pH自然，30℃，180r/min混合發(fā)酵時，干物質(zhì)重量達(dá)到最大為5.87g，粗蛋白含量為1.78g/100mL，均為所選用的七種菌種組合之首。因此，白地霉 (Geotrichum candidum)和熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)為發(fā)酵黃漿水與糖蜜的最佳菌種組合。

［1］李玉，李其久，等.白地霉凈化和資源化玉米淀粉工業(yè)廢水的實驗條件研究［J］.遼寧大學(xué)學(xué)報，2008(1):81－84.

［2］Andrew D E，Leonore S C，Amold E.Greenberg Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater［M］.19thed.American Public Heath Association，1995.

［3］籍保平，等.蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的菌種篩選［J］.微生物學(xué)報，1999(12):390－393.

［4］何海燕，覃擁靈，等.利用甘蔗糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)酵母單細(xì)胞蛋白的菌種選育［J］.糧食與飼料工業(yè)，2006(12):28－41.

［5］邵秋榮，張文，等.乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定［J］.分析實驗室，2009，28(B5):240－241.

［6］張平，李建政，等.利用大豆乳清廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的酵母篩選［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008(2):102－104.

［7］張帥，梁巧榮，等.從蘋果皮中分離的酵母菌發(fā)酵性能的研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(3):91－92.

［8］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)局.GB/T 6437－2002.飼料中磷的測定［S］.北京:國家標(biāo)準(zhǔn)局，2003.

［9］陳興南.色譜分離分光光度法測定飼料中的葉黃素［J］.化學(xué)分析計量，2006，15(1):38－40.

［10］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)局.GB/T 5009.4－1985.食品中灰分的測定方法［S］.北京:國家標(biāo)準(zhǔn)局，1985.

［11］A Paraskevopoulou.Functional properties of single cell protein produced by kefirmicroflora［J］.Food Research International，2003，36:431－438.

［12］趙建國，鐘士博，等.熱帶假絲酵母固體發(fā)酵黃酒糟生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2002(2):22－24.

［13］楊希娟，孫小鳳，等.馬鈴薯渣固態(tài)發(fā)酵制作單細(xì)胞蛋白飼料的工藝研究［J］.飼料工業(yè)，2009，30(3):19－22.

［14］趙冬梅，劉凌，張京健.豆制品生產(chǎn)中高濃度廢水的檢測與分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(1):68－71.

Growth characteristics of strains for single－cell－protein produced by yellow slurry water and molasses

LI Xiao－yu，MA Ying，WANG Lu
(School of Food and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China)

The crude protein，non－protein nitrogen，total sugar，reducing sugar，phosphorus，moisture，crude ash，lutein，elemental of the Yellow Slurry Water and molasses in the trash of the corn after extracting crystal sugar were analyzed.And then，selected Candida utilis，Geotrichum candidum and Candida tropicalis，three kinds of industrial yeast，as the strains fermented the mixture of yellow slurry water and molasses for single－cell－protein by shaking flask，the growth characteristics of three types of yeast was studied.And the best strain combination for production was screened.The results showed that the dry mass of the single－cell－protein can reach 5.87g，and the protein can reach 1.78g/100mL，when it was fermented by equivalent Geotrichum candidum and Candida tropicalis.

yellow slurry water;molasses;single－cell－protein;screening

TS201.3

A

1002－0306(2011)06－0216－04

2010－05－18

李小雨(1988－)，男，碩士研究生，研究方向:生物化工。