超濾法濃縮菊糖果轉移酶的初步研究

杭 華，趙 萌，周榴明，沐萬孟，繆 銘，江 波

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

超濾法濃縮菊糖果轉移酶的初步研究

杭 華，趙 萌，周榴明，沐萬孟，繆 銘，江 波*

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

超濾濃縮的菊糖果糖轉移酶粗酶根據用途可直接使用或進一步純化，采用截留分子量為10kDa的Pellicon－2盒式超濾膜包，對菊糖果糖轉移酶超濾濃縮進行了初步研究。結果表明，酶解菊糖產物為DFAIII;酶收率85%以上，膜通量減少至3.2L/m2·h;單位體積酶活(U/mL)增加8.5倍，比酶活達到6.7U/mg;再生后，膜通量可以恢復95%以上。

菊糖果糖轉移酶，超濾，濃縮

膜分離技術是一種新型高效、精密的分離技術，采用半透膜的分離方法，具有分離過程不發(fā)生相變化、高效分離、設備簡單、節(jié)能、常溫操作、無污染等優(yōu)點，可用于生物活性物質如酶的濃縮和分離［1］。利用超濾技術濃縮酶液，在低溫下操作，酶活損失少，操作簡單，易于實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產［2］。菊糖果糖轉移酶(Inulin Fructotransferase EC2.4.1.93，即Inulase)，該酶能催化菊糖轉化為2個果糖基組成的環(huán)狀二糖，即雙果糖酐III，又稱二果糖二酐［3］。雙果糖酐Ⅲ是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型天然功能性甜味劑，易溶于水，甜度是蔗糖的一半，熱值為蔗糖的一半［4］;具有促進礦物元素和黃酮類物質的吸收、增進骨骼生長、利于排尿、改善便秘、預防結腸癌及抑制蛀牙等功能，因而在食品和醫(yī)藥領域中應用潛力廣泛［5］。發(fā)酵液經板框過濾除去菌體得到粗酶液的酶活不高，若直接用無機鹽(硫酸銨)對濾液進行鹽析沉淀，不僅使無機鹽用量大幅度增加，還增加操作的復雜性和勞動量。因此，在進行無機鹽沉淀之前對粗酶液進行濃縮是非常必要的。本實驗考慮到Inulase的分子特性，采用超濾技術來提高酶的濃度，去除發(fā)酵液中的一部分小分子的雜質，同時探討超濾對酶活的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

超濾裝置 Pellicon超濾器，濾膜為Pellicon－2盒式超濾膜包，40mm×300mm尺寸，有效過濾面積0.5m2，美國密理博Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗前洗膜方法 進口液(in)=Feed;循環(huán)液口(out)=Retentate;透過液口(p)=Permeate;進口壓力=Pin;循環(huán)口壓力=Pout;透過口壓力=Pp;1Psi=0.07bar。

沖洗:打開循環(huán)液閥門，將循環(huán)液管和透過液放入廢液容器，排空系統(tǒng)中的儲存液，用少量純水沖洗進液口管頭;清洗膜面(不加壓清洗):在干凈的容器中加入至少20L純水，調節(jié)泵速至Pin=5～15Psi并穩(wěn)定，測定循環(huán)液管流出液體積不小于6L或中性;清洗膜孔(加壓清洗):提高泵速至進口壓力達到Pin=15～20Psi，調節(jié)循環(huán)閥至循環(huán)口壓力至 Pout=10Psi，穩(wěn)定后沖洗至透過液管流出液體積達到35L以上或中性為止;正常水通量測定:通過泵速和循環(huán)閥調節(jié) Pin=10Psi，Pout=5Psi，測定透過液口1min透過的水的體積。

1.2.2 超濾方法 采用本實驗室黃色節(jié)桿菌的同批發(fā)酵液，經板框離心除去菌體后，上清液利用布氏漏斗抽濾，濾液進行超濾，超濾的發(fā)酵液體積為10L，進口壓力20～25Psi，循環(huán)口壓力 5～10Psi，壓力差控制在10Psi，料液溫度在40℃以下。

1.3 測定方法

1.3.1 菊糖果糖轉移酶酶活測定方法［6］反應體系(1mL):0.5mL 10%的菊糖溶液，0.45mL 0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)，0.05mL酶液;充分混合后，60℃反應10min，100℃下滅酶活5min，10000r/min 離心10min，取上清液檢測。

HPLC 檢測條件:糖柱(Waters Sugur－PakTM 1，6.5mm×300mm);流動相:超純水;示差折光檢測器(Shodex RI101);柱溫:80℃;流速:0.4mL/min;進樣量:10μL。

酶活力單位定義:在上述檢測條件下，每分鐘生成1μmol DFAIII所需要的酶量定義為1個單位酶活(即1U)。

酶的收率:酶液濃縮一定倍數(shù)后的酶活與未濃縮酶液總酶活的比值。

1.3.2 蛋白含量測定方法 采用福林酚法(參見中華人民共和國專業(yè)標準ZBX 66030287)。

1.3.3 膜通量的測定 用量筒接濾出液，同時用秒表計時，用濾出液體積除以相應時間和膜面積表示。

2 結果與討論

2.1 菊糖果糖轉移酶酶解產物－DFAⅢ

由1.3.1的方法，菊糖在菊糖果糖轉移酶作用下，生成物主要有DFAIII和少量的低聚果糖，見圖1。結果表明，6.392min為菊糖的峰，7.197、7.643、8.372min為低聚果糖峰(分別對應蔗果四糖、蔗果三糖、蔗果二糖)，9.748min為DFAIII的峰，菊糖轉化率達到80%以上。

圖1 酶解產物的HPLC圖譜

2.2 截留分子量為10kDa的Pellicon－2盒式超濾膜包的分離效果

Inulase分子質量為30kDa以上，因此以10kDa的Pellicon－2盒式超濾膜包進行超濾的實驗，結果見表1。結果表明，Inulase透過率小于2%，大部分酶仍存在于濃縮液中;因此采用10kDa的Pellicon－2盒式超濾膜包對該酶進行超濾是可行的。

表1 超濾中Inulase透過情況

2.3 超濾時間對膜通量的影響

隨著超濾的進行，透過的液體增多，由于濃度差極化在膜表面上形成濃縮的凝膠層，使膜通量逐漸降低。因此本實驗研究了菊糖果糖轉移酶液的膜通量隨超濾時間的變化關系，結果見圖2。在超濾60min以前，膜通量下降迅速，主要因為膜表面物其他物質，阻力較小;由于大分子物質(如蛋白質)在膜表面沉淀而使阻力迅速增加，因此膜通量下降非?？?。60～90min階段，沉淀在膜表面的大分子物質逐漸加厚，膜的阻力增加，通量變化不大。90～120min階段，膜通量下降速率較快，120min后，通量趨向于穩(wěn)定，膜通量值很小，降低至3.2L/m2·h。說明膜污染較嚴重，需要進行清洗。在該濃縮條件下，濃縮倍數(shù)與時間的關系見圖3。濃縮至2～4倍，需要時間長是因為透過液的體積多(占濃縮前酶液體積75%);濃縮至6～10倍，需要時間逐漸變短，因為膜通量穩(wěn)定，透過液的體積也在逐漸變少(占濃縮前酶液體積15%)。

圖2 膜通量隨時間變化曲線

圖3 濃縮倍數(shù)隨時間變化曲線

2.4 超濾濃縮倍數(shù)對Inulase酶活的影響

采用10kDa的Pellicon－2盒式超濾膜包進行濃縮，菊糖果糖轉移酶液在超濾過程中的酶活隨濃縮倍數(shù)的變化情況如圖4所示。菊糖果糖轉移酶的酶活隨著濃縮倍數(shù)的提高而增加，濃縮10倍后，單位體積酶活提高8.5倍，由于發(fā)酵液的濃度較小，增大濃縮倍數(shù)，提高酶活單位，有利于后續(xù)的工藝生產。

圖4 超濾倍數(shù)對酶活的影響

2.5 超濾倍數(shù)對Inulase比酶活的影響

由于在超濾過程中，發(fā)酵液中的總蛋白也會隨著濃度的變化而變化，因此采用測定酶活力和總蛋白的含量，利用兩者的比值即比活力來反映超濾過程對酶活的影響。實驗結果如圖5所示，濃縮到2倍時，比酶活的變化最大，隨著濃縮倍數(shù)的增加，比酶活的變化不是很大，比酶活從4.3U/mg增加到6.7U/mg。原因是開始濃縮時，小于10kDa的小分子的蛋白透過膜包，使總蛋白的量減少;濃縮倍數(shù)再增大，對總蛋白量的影響不大。

圖5 濃縮倍數(shù)對比酶活的影響

2.5 膜包的清洗與再生

由于濃度差極化、膜的污染等原因而使膜包通量迅速下降，甚至堵塞膜孔，可以通過定期清洗恢復膜包的分離功能［7］。本實驗采取以下步驟:

清洗:a.水洗:程序和步驟同1.2.1的沖洗，可用40～45℃ 的熱水;b.堿洗:在容器中加入 40～45℃0.1mol/L NaOH 20L，開放循環(huán)液口和透過液口，啟動泵，調節(jié)泵速至Pin=20～25Psi，調節(jié)循環(huán)閥門至Pout=5Psi，當容器中NaOH剩下10L時，將循環(huán)液和透過液管一起放入容器中，全循環(huán)30min后，停泵排空系統(tǒng)中的堿液;c.水洗:程序和步驟同1.2.1的沖洗;d.水通量測定:通過泵速和循環(huán)閥調節(jié)Pin=10Psi，Pout=5Psi，測定透過液口1min透過的水的體積。

保存:將0.1mol/L NaOH打入系統(tǒng)中保存，進口壓力15Psi，循環(huán)口壓力5Psi，直到透過液口的pH為堿性，并維持1～2min，關閉所有閥門;或將膜堆從不銹鋼夾具上拆下來，用密封袋，注入相應濃度的NaOH保存液密封保存。

膜通量恢復是指超濾一次后再生膜通量與超濾前膜通量的比值。通過實驗測得膜通量與再生次數(shù)的關系見圖6，膜包再生5次，膜通量從12L/m2·h降低至10.1L/m2·h，說明清洗后膜孔中仍含有極少量的雜質;因此，超濾后要及時再生，膜通量可以恢復95%以上。

圖6 膜通量與再生次數(shù)的關系

3 結論

采用分子量10kDa的膜包進行超濾，酶活的收率能達到85%～93%，損失率為10%。通過對超濾過程中酶活力和比活力變化的分析，濃縮倍數(shù)提高到10倍，酶活力增加8.5倍，而比活力變化不是很大;因此提高濃縮倍數(shù)便于用硫酸銨沉淀粗酶，也有利于大規(guī)模的利用酶反應生產DFAIII;或進一步純化該酶，進行酶學性質研究。采用蒸餾水和0.1mol/L NaOH清洗膜包后，膜通量可以恢復95%以上。

［1］谷大建，徐巍.膜分離技術的應用及研究進展［J］.中國藥業(yè)，2008，17(6):58－59.

［2］李占生.超濾技術在酶的濃縮中的應用［J］.天津紡織工學院學報，1996，15(2):57－59.

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［6］PARK，JEONG－BOK，YONG－JIN CHOI.Purification and characterization of Inulin Fructotransferase(Depolymerizing)from Arthrobactersp.A－6［J］.JournalofMicrobiology and Biotechnology，1996，6(6):402－406.

［7］祝生杰.超濾器的膜污染控制與處理［J］.膜科學與技術，1997，17(2):1－4.

Inulin fructotransferase concentration by ultra－filtration method

HANG Hua，ZHAO Meng，ZHOU Liu－ming，MU Wan－meng，MIAO Ming，JIANG Bo*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Inulin fructotransferase concentrated through ultra－filtration could be utilized directly and further purified.Pellicon－2 ultra－filtration membrane bag with molecular weight cut off(MWCO)of 10kDa was investigated in order to concentrate inulase solutions.Results indicated that DFAIII was the enzymatic hydrolysis product.And after concentration，85%enzyme yield was obtained，while membrane flux decreased to 3.2L/m2· h.Furthermore，concentration resulted in an unit volume enzyme activity(U/mL)fold of 8.5 and increased inulase specific activity to 6.7U/mg.Through regeneration，membrane flux could be recovered to over 95%of original level.

inulin fructotransferase;ultra－filtration;concentration

TS201.2+5

A < class="emphasis_bold">文章編號:1002－0306(2011)06－0201－03

1002－0306(2011)06－0201－03

2010－06－17 *通訊聯(lián)系人

杭華(1977－)，男，在讀博士研究生，研究方向:食品生物技術。