變性劑及表面活性劑對蛤蟆油粘度影響的研究

張 梅，趙 雨，*，李蕓彤，劉詩超，曲曉波

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長春130117;2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉133000)

變性劑及表面活性劑對蛤蟆油粘度影響的研究

張 梅1，趙 雨1，*，李蕓彤1，劉詩超2，曲曉波1

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長春130117;2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉133000)

研究了變性劑及表面活性劑對蛤蟆油粘度的影響，以蛤蟆油粘度為評價(jià)指標(biāo)，考察不同濃度的尿素、鹽酸胍、β－巰基乙醇、SDS、Triton等變性劑及表面活性劑對蛤蟆油粘度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)尿素、鹽酸胍、β－巰基乙醇、Triton、SDS濃度分別為7mol/L、0.2mol/L、3%、2g/mL及8%時(shí)，具有最低粘度，其中鹽酸胍的作用效果最佳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究其有效成分、提取分離方法及藥理活性奠定了基礎(chǔ)。

蛤蟆油，粘度，變性劑，表面活性劑

哈蟆油(Oviduetus Ranae)，系蛙科動(dòng)物中國林蛙(Rana temporaria chensinesis David)雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制干燥而得［1］，又名哈什蟆油、田雞油、蛤螞油等［2］，是我國東北特產(chǎn)的名貴中藥材，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤肺等功效［3］。蛤蟆油含有蛋白質(zhì)、固醇類物質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素與微量元素等多種化學(xué)成分，有很高的藥用、營養(yǎng)價(jià)值，在國際市場上價(jià)格昂貴，有“軟黃金”之稱。由于其含有大量的糖蛋白［4］，導(dǎo)致其遇水溶脹后呈粘稠狀，不利于有效成分的提取和鑒定，本文考察了尿素、鹽酸胍、β－巰基乙醇、SDS(十二磺基硫酸鈉)、Triton(曲拉通)等對其粘度的影響，為進(jìn)一步研究蛤蟆油的理化、性質(zhì)、分離純化有效成分及開發(fā)產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

哈蟆油 購自于吉林省白山市北亞藥業(yè)，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為中國林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的干燥輸卵管;鹽酸胍、尿素、SDS、Triton、β－巰基乙醇 均購自于Sigma公司。

DV－Ⅱ+P型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì) BROOKFIELD公司;C－MAG加熱磁力攪拌器 德國IKA集團(tuán);TE212－L電子天平 梅特勒－托利多公司;DS－1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 變性劑及表面活性劑作用于蛤蟆油 將哈蟆油原藥材剝?nèi)ソ钅ぱ艿入s物，晾干后研磨成細(xì)粉。精確稱取蛤蟆油45份，每份1.0g。按料液比1∶100加入蒸餾水，浸泡溶脹24h，勻漿3次，每次10s。分別考察尿素濃度(1、2、3、4、5、6、7、8mol/L)、鹽酸胍濃度(1、2、3、4、5、6、7、8mol/L)、β－巰基乙醇濃度(v/v)(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)、Triton濃度(v/v)(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)和

1.2.2 蛤蟆油粘度的測定 采用Brookfield DV－Ⅱ+P型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測其粘度，選用LV－61號(hào)轉(zhuǎn)子，在(25±0.1)℃室溫條件下，測定轉(zhuǎn)速為200r/min下測定，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 尿素對蛤蟆油粘度的影響

由圖1可以看出，隨著尿素濃度的增加，蛤蟆油的粘度隨之降低，當(dāng)濃度增加到2mol/L時(shí)，粘度下降趨勢明顯，由1.586Pa·s下降到0.628Pa·s。繼續(xù)增加到7mol/L時(shí)，粘度下降趨勢較為平緩，由0.628Pa·s下降到0.266Pa·s;高于7mol/L時(shí)，蛤蟆油的粘度不再降低。這是因?yàn)槟蛩刈鳛槌Ｓ玫淖冃詣?，可與極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)發(fā)生相互作用，從而降低其粘度。

圖1 不同濃度尿素對蛤蟆油粘度的影響

2.2 不同濃度鹽酸胍對蛤蟆油粘度的影響

由圖2可以看出，隨著鹽酸胍濃度的增加，蛤蟆油的粘度隨之降低，當(dāng)濃度增加到0.05mol/L時(shí)，粘度急劇下降，由1.350Pa·s下降到0.056Pa·s。繼續(xù)增加到0.2mol/L時(shí)粘度下降趨勢不明顯，由0.056Pa·s下降到0.017Pa·s。當(dāng)濃度高于0.2mol/L時(shí)，蛤蟆油的粘度不再降低。這是因?yàn)辂}酸胍作為一種強(qiáng)變性劑，主要是通過與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)鍵合，從而間接引起蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)周圍水氫鍵結(jié)構(gòu)的變化［5］，釋放水分子，改善流動(dòng)性，降低粘度。

圖2 不同濃度鹽酸胍對蛤蟆油粘度的影響

2.3 不同濃度β－巰基乙醇對蛤蟆油粘度的影響

由圖3可以看出，隨著β－巰基乙醇濃度的增加，蛤蟆油的粘度隨之降低，當(dāng)濃度增加到3%時(shí)，粘度下降趨勢明顯，由1.326Pa·s下降到0.302Pa·s;繼續(xù)增加到8%時(shí)粘度幾乎不降低。β－巰基乙醇對蛋白的變性作用主要是通過打斷其結(jié)構(gòu)中的二硫鍵，造成其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［6］，說明其中含有大量的二硫鍵。

2.4 不同濃度Triton對蛤蟆油粘度的影響

由圖4可以看出，隨著Triton濃度的增加，蛤蟆油的粘度隨之降低，當(dāng)濃度增加到1%時(shí)粘度下降趨勢明顯，由1.326Pa·s下降到0.707Pa·s。繼續(xù)增加到8%時(shí)粘度下降趨勢不明顯，由0.707Pa·s下降到0.608Pa·s。高于3%時(shí)，蛤蟆油的粘度幾乎不降低。Triton是蛋白的良好溶劑，尤其對膜蛋白具有助溶作用。在以往的實(shí)驗(yàn)中，我們經(jīng)常用這幾種試劑來溶解難溶性蛋白，尤其是包涵體蛋白，說明他們在與蛋白作用改變其空間結(jié)構(gòu)后，使其親水性增強(qiáng)，進(jìn)而溶解度增大，粘度降低。

圖3 不同濃度β－巰基乙醇對蛤蟆油粘度的影響

圖4 不同濃度Triton對蛤蟆油粘度的影響

2.5 不同濃度SDS對蛤蟆油粘度的影響

由圖5可以看出，隨著SDS濃度的增加，蛤蟆油的粘度隨之降低，當(dāng)濃度增加到10mg/mL時(shí)粘度下降趨勢明顯，由1.329Pa·s下降到0.146Pa·s。繼續(xù)增加到40mg/mL時(shí)，粘度下降趨勢不明顯，由0.146Pa·s下降到0.083Pa·s。高于20mg/mL時(shí)，蛤蟆油的粘度幾乎不降低。SDS可以使蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵斷裂，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)［7］。三種表面活性劑中SDS的作用最強(qiáng)，其中可能含有大量能與氫鍵作用的基團(tuán)，為以后的實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。

圖5 不同濃度SDS對蛤蟆油粘度的影響

3 結(jié)論

粘度作為流變學(xué)性質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，它的變化在一定程度上能反映出蛋白質(zhì)分子物理化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)的變化［8］。因此，可以通過研究蛋白質(zhì)在水溶液中折疊情況和變性機(jī)理來尋找降低粘度的方法［9］。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，蛤蟆油形成交聯(lián)的主要原因是由于其蛋白分子間存在大量的氫鍵、疏水鍵及二硫鍵，當(dāng)加入變性劑或表面活性劑后，使上述分子鍵遭到不同程度的破壞，進(jìn)而破壞其交聯(lián)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其粘度降低。因此，為進(jìn)一步研究蛤蟆油的理化、性質(zhì)、分離純化有效成分及開發(fā)產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(2005年版一部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:225.

［2］中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志(Ⅵ)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1961.

［3］胡鑫，劉成柏，陳曉平，等.林蛙油中主要營養(yǎng)保健成分含量的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(2):218－220.

［4］范玉林，崔香順，姚玉霞.哈士蟆油成分研究的進(jìn)展［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，18(3):105.

［5］Watlaufer D B，M alik S K，Stoller L，et al.Am Chem Soc［J］，1964，86:508－515.

［6］木泰華，孫艷麗，菅野，等.β－乳球蛋白加壓凝膠的生成及其物化特性研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(8):1652－1657.

［7］張為燦，戴旭慧，趙越，等.十二烷基磺酸鈉對大豆過氧化物酶活性和構(gòu)象的影響［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2008，66(6):669－674.

［8］羅永康，潘道東，沈慧星，等.蛋白質(zhì)濃度、pH、離子強(qiáng)度對鰱魚肌原纖維蛋白粘度的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(7):52－54.

［9］Chilom G，Chilom O，Telea C，et al.Rev Roumaine Chim［J］，2000，45:989－901.

Effect of denaturing agents and surfactants on viscosity of Oviduetus Ranae

ZHANG Mei1，ZHAO Yu1，*，LI Yun－tong1，LIU Shi－chao2，QU Xiao－bo1
(1.Center for New Medicine Research of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.College of Pharmacy，Yanbian University，Yanji 133000，China)

The factors of the viscosity of Oviduetus Ranae，including denaturing agents and surfactants，consisted of different concentrations of urea，guanidine hydrochloride，β－ mercaptoethanol，SDS and Triton were studied.Both denaturing agents and surfactants could reduce the viscosity，the best concentrations were 7mol/L，0.2mol/L，3%，2g/mL and 8%，respectively，in which the best was guanidine hydrochloride.The result provided a basis for further study on active ingredients，extractions and pharmacological activities of Oviduetus Ranae.

Oviduetus Ranae;viscosity;denaturing agents;surfactants

TS201.2

A

1002－0306(2011)06－0167－03

2010－05－13 *通訊聯(lián)系人

張梅(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能研究及產(chǎn)品開發(fā)。

國家“十一五”科技支撐項(xiàng)目(2007BAI38B06)。SDS 濃度(2、3、4、5、10、20、30、40mg/mL)對蛤蟆油粘度的作用。