大鯢黏液酶解產(chǎn)物的制備及其抗疲勞作用研究

李 偉，于新瑩，佟長青，金 橋，孔 亮

(1.遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點開放實驗室，大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧大連116023;2.張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司，湖南張家界427400;3.大連海洋大學(xué)海洋環(huán)境工程學(xué)院，遼寧大連116023)

大鯢黏液酶解產(chǎn)物的制備及其抗疲勞作用研究

李 偉1，2，于新瑩1，佟長青1，金 橋1，孔 亮3

(1.遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點開放實驗室，大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧大連116023;2.張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司，湖南張家界427400;3.大連海洋大學(xué)海洋環(huán)境工程學(xué)院，遼寧大連116023)

以大鯢黏液為原料，采用復(fù)合蛋白酶進行酶解，研究其最佳酶解條件以及酶解產(chǎn)物抗疲勞作用。結(jié)果表明，酶解大鯢黏液的最佳工藝條件為復(fù)合酶加量為0.5%(質(zhì)量比)及底物濃度為0.1mg/mL時，酶解時間2h，pH8.0，溫度65℃。時間飛行質(zhì)譜表明酶解產(chǎn)物為分子量小于4000，苯酚硫酸法測定其為低聚糖肽。將低聚糖肽給小鼠灌胃15d后進行小鼠負重游泳實驗，結(jié)果顯示大鯢低聚糖肽組使小鼠游泳力竭時間達到103min(P＜0.01)，肝糖原的消耗量比空白對照組減少65.0%，肌肉中乳酸的量比空白對照組減少了24.4%。結(jié)果表明，大鯢低聚糖肽具有顯著抗疲勞作用。

大鯢黏液，復(fù)合蛋白酶，抗疲勞，小鼠

大鯢(Andrias davidianus)屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀特產(chǎn)，屬國家二類保護動物。主要分布于長江中上游、珠江中上游及漢水上游的溪流中。上世紀90年代以來，湖南、湖北、陜西及廣西都建立了大量的大鯢馴養(yǎng)繁殖企業(yè)。僅湖南省就有大鯢馴養(yǎng)繁殖企業(yè)35家左右，年繁殖能力已達 4～5 萬尾［1－2］。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的發(fā)展，大鯢資源的精深加工利用成為一個關(guān)系大鯢產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的緊迫課題。目前，對大鯢的深加工均是宰殺后提取皮、肉、骨來利用，這樣的利用方法對大鯢資源的保護與繁殖非常不利。另一方面，大鯢體表無鱗，多皮膚腺，在生長過程中不斷分泌黏液。如果能夠?qū)Υ篥F體表黏液進行利用，就可以做到既利用大鯢資源，又不危害大鯢的生長繁殖，實現(xiàn)大鯢資源可持續(xù)利用的最理想狀態(tài)。本文以大鯢黏液為原料，采用復(fù)合酶進行酶解，制備出分子量小于4000的大鯢低聚糖肽。利用小鼠進行抗疲勞實驗，發(fā)現(xiàn)大鯢低聚糖肽具有抗疲勞作用，是保健食品潛在的原料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鯢黏液 2009年9月由張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司制備;海洋堿性蛋白酶 由俄羅斯科學(xué)院遠東分院太平洋生物有機化學(xué)研究所提供;胰蛋白酶(1∶250) 購于北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司;其他化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鯢黏液酶解液的制備 取新鮮大鯢黏液，洗凈后用組織搗碎機研磨成糜，經(jīng)硫酸銨沉淀法得大鯢黏液蛋白粗提液。

將海洋堿性蛋白酶和胰蛋白酶按活力單位比為7∶3比例混合作為酶解用復(fù)合酶，改變溫度、pH、加酶量和時間等因素，測定肽含量。

1.2.2 蛋白含量和酶解液肽含量的測定 蛋白含量采用Folin－酚法測定［3］。采用三氯乙酸(TCA)沉淀大分子蛋白質(zhì)后，采用Folin－酚法測定酶解液的肽含量［4］。

1.2.3 糖含量的測定 采用三氯乙酸(TCA)沉淀大分子蛋白質(zhì)后的酶解液用苯酚－硫酸法檢測樣品中糖含量［5］。

1.2.4 酶解產(chǎn)物分子量分布的測定 凍干的酶解產(chǎn)物用5～10μL 0.15%三氟乙酸(TFA)溶解。然后離心取上清液與等體積的基質(zhì)混合點靶進行時間飛行質(zhì)譜(MALDI－TOF)測定。質(zhì)譜儀為Bruker Autoflex時間飛行質(zhì)譜(Bremen，德國)。質(zhì)譜測定條件:N2激光源，波長337nm，正離子線性方式檢測(飛行管長1.6m，加速電壓25kV)?；|(zhì):芥子酸(SA)，用0.1%TFA/50%乙腈配成飽和溶液，再將該溶液與0.1%TFA/50%乙腈以1∶1的比例混合。

1.2.5 小鼠負重游泳實驗 按謝偉斌等［6］的方法。選昆明種雄性小鼠16只，3～4周齡，體重(16±2)g，隨機分成實驗組和對照組，每組8只。每天灌胃1次，連續(xù)15d，實驗組灌胃劑量為1.6mg/kg體重，每個劑量組每天灌胃劑量0.1mL/16g體重，對照組灌服相同體積生理鹽水。在末次灌胃30min后，給小鼠尾部負重5%的鉛絲，在恒溫水槽中進行游泳，水槽深度為40cm左右，水溫在(30±2)℃。小鼠游泳力竭后取出測定生化指標，記錄從小鼠開始進入水中至頭部全部沒入水中10s不浮出水面的時間，即為游泳時間。

1.2.6 小鼠肝糖元的測定 取出小鼠肝臟，用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干后準確稱量0.1g肝臟，加入2mL TCA勻漿，將勻漿在5000r/min條件下離心20min，取1mL上清液，再加入4mL蒽酮試劑，沸水浴中煮沸10min，取出后用水冷卻，于620nm測吸光度。在葡萄糖標準曲線上查出樣品液的糖含量。以1mL蒸餾水為對照［7］。

1.2.7 小鼠肌乳酸的測定 取出小鼠后腿肌肉0.1g，用生理鹽水勻漿，將勻漿5000r/min離心 20min，取1mL上清液，加入蒸餾水至5mL，加入20%硫酸銅1mL，加入氫氧化鈣粉末約0.5g，振搖1min，靜置10min，以3000r/min 離心10min，取上清 0.5mL，加入濃硫酸3mL，充分混勻后，置于沸水浴中5min，然后放入冷水中3min。加入0.5%對羥聯(lián)苯溶液0.15mL，充分混勻后，置于沸水浴中5min，然后放入冷水中冷卻后，于510nm測定吸光度。在乳酸標準曲線上查出樣品液的乳酸含量［8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽單因素條件的影響

2.1.1 酶解溫度對復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響 復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備的低聚糖肽經(jīng)苯酚－硫酸法檢測糖含量占27.6%(質(zhì)量比)。將酶解條件設(shè)定為:pH7.5，復(fù)合酶量為0.5%(質(zhì)量比)，于 35、45、55、65、75℃ 下分別酶解 2h，底物濃度為0.1mg/mL。測定肽含量得結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當酶解溫度在35～65℃之間變化時，隨著酶解溫度繼續(xù)上升，所得到的肽量逐漸升高，但當溫度達到65℃，肽含量達最大值后，再繼續(xù)提高酶解溫度，所得到的肽含量則出現(xiàn)下降的趨勢。溫度過高，可以使酶變性甚至失活。所以，最適大鯢黏液酶解反應(yīng)的溫度為65℃。

圖1 酶解溫度對復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響

2.1.2 pH對復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響 將酶解條件設(shè)定為:復(fù)合酶量為0.5%(質(zhì)量比)，pH 分別為5、6、7、8、9，于 65℃酶解 2h，底物濃度為0.1mg/mL。測定所得肽量得結(jié)果如圖2。由圖2可知，隨著pH的逐漸升高，肽含量也隨著上升，當pH上升到8.0時肽含量最大，之后再升高pH，所得到的肽含量出現(xiàn)下降趨勢。原因是復(fù)合酶中的海洋堿性蛋白酶與胰蛋白酶本身的最適pH在8.0左右［9］，pH過高或過低時會影響海洋堿性蛋白酶與胰蛋白酶的活性。所以，最適大鯢黏液酶解反應(yīng)的pH為8.0。

圖2 pH對復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響

2.1.3 酶解時間對復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響 將酶解條件設(shè)定為:復(fù)合酶量為0.5%(質(zhì)量比)，pH為8.0，底物濃度為0.1mg/mL，于65℃酶解時間分別為1、1.5、2、2.5h，測定所得肽含量結(jié)果如圖3所示。所得肽含量隨著酶解時間的增加而增加，酶解時間2h以后所得肽量上升幅度平緩。綜合生產(chǎn)成本因素，確定酶解時間為2h為最佳。

2.1.4 復(fù)合酶加量對復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響 將酶解條件設(shè)定為:pH為8.0，底物濃度為0.1mg/mL，于65℃酶解2h，復(fù)合酶加量分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%(質(zhì)量比)，測定所得肽量結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著酶加量的增加，所得肽含量逐漸升高，復(fù)合酶加量大于0.5%時肽得率上升幅度平緩。綜合生產(chǎn)成本和所得肽含量兩方面考慮，確定復(fù)合酶加量大于0.5%(質(zhì)量比)。

圖3 酶解時間對復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響

圖4 復(fù)合酶加量對復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響

2.1.5 復(fù)合酶最佳酶解條件的確定 影響酶解反應(yīng)的幾個主要因素為復(fù)合酶加量、酶解時間、pH和溫度。根據(jù)上述單因素實驗分析，并考慮生產(chǎn)成本等因素，以所得肽含量為指標做復(fù)合酶加量為0.5%(質(zhì)量比)時，酶解時間、pH和溫度3因素3水平的正交實驗L9(33)，正交實驗的因素水平見表1，正交實驗結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

由表2可知，各因素對復(fù)合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響的大小順序為C>A>B，即pH>酶解時間>溫度，最優(yōu)水平為A3B3C2，即pH為8.0，酶解時間2h，溫度65℃。

因此，確定復(fù)合酶最佳酶解條件為復(fù)合酶加量為0.5%(質(zhì)量比)時，時間 2h，pH8.0，溫度 65℃，底物濃度為0.1mg/mL。

表2 正交實驗結(jié)果

2.2 大鯢低聚糖肽時間飛行質(zhì)譜

得的大鯢低聚糖肽的m/z在小于4000的區(qū)域。m/z主要有 1172.3、1378.4、1436.3、1551.2、1694.9、1866.3、1981.0、2081.3、2200.7、2534.2、2929.2、3133.0、3326.0、3553.5、3907.2。根據(jù)含糖量及氨基酸殘基分子量可知，獲得的糖肽含有氨基酸殘基數(shù)大約為7～24個。

圖5 大鯢低聚糖肽時間飛行質(zhì)譜

2.3 大鯢黏液酶解產(chǎn)物對小鼠游泳時間、各項生化指標的影響

灌服大鯢黏液酶解產(chǎn)物對小鼠游泳時間及肝糖元、肌乳酸的影響見表3?？梢钥闯觯喾篥F黏液酶解產(chǎn)物的小鼠游泳時間達到103min，極顯著高于對照組53.7min(P＜0.01)。小鼠游泳時間的延長，表明大鯢黏液酶解產(chǎn)物－低聚糖肽能延緩運動性疲勞出現(xiàn)的時間，具有抗運動性疲勞的作用。在小鼠負重游泳力竭后，肝糖原的消耗量比空白對照組減少65.0%，肌肉中乳酸的量比空白對照組減少了24.4%。肝糖原與肌乳酸是評價機體疲勞的重要指標。肝糖原貯存越多，抗疲勞能力越強，而乳酸堆積越多，疲勞程度越重。表3的大鯢低聚糖肽組和對照組中肝糖原與肌乳酸數(shù)值也反映了灌服大鯢黏液酶解產(chǎn)物的小鼠具有抗疲勞能力顯著提高。

表3 大鯢黏液酶解產(chǎn)物對小鼠游泳時間、各項生化指標的影響

3 結(jié)論

采用由海洋堿性蛋白酶和胰蛋白酶組成的復(fù)合酶將大鯢黏液酶解，經(jīng)檢測酶解產(chǎn)物為糖含量占27.6%(質(zhì)量比)且分子量小于4000的低聚糖肽。小鼠負重游泳實驗的結(jié)果表明，灌服大鯢黏液酶解產(chǎn)物具有顯著提高小鼠抗疲勞能力的作用。研究結(jié)果為深入開發(fā)大鯢資源提供了一定的研究基礎(chǔ)。

［1］羅慶華，劉英，張立云.張家界市大鯢資源保護、增殖現(xiàn)狀與對策［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(19):9023－9025，9052.

［2］余東勤，孫長銘.陜西省大鯢資源現(xiàn)狀及其經(jīng)營利用探討［J］.陜西水利，2009(1):29－30.

［3］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，1997.

［4］劉程惠，董秀萍，趙露露，等.胰蛋白酶酶解法制備海參肽的工藝條件［J］.大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2006，25(1):83－85.

［5］Dubois M，Gilles K A，Hamilton I K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Analyt Chem，1956，28:350－356.

［6］謝偉斌，陳錦成，林錐鏵.酶解低值蝦蛋白制取功能多肽飲料的工藝技術(shù)研究［J］.食品科技，2007(2):202－205.

［7］朱新友，吳慶.對羥聯(lián)苯法測定尿中乳酸的探討［J］.陜西醫(yī)學(xué)檢驗，1999，14(3):21－22.

［8］尹曉平，姜紅，高曉黎，等.酶解天山馬鹿血分離制備抗疲勞肽的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009(21):391－394.

［9］陳天.殼聚糖固定化胰蛋白酶的研究［J］.離子交換與吸附，2002，18(2):125－131.

Study on the enzymatic hydrolysates of skin mucous from Andrias davidianus and its anti－fatigue effect

LI Wei1，2，YU Xin－ying1，TONG Chang－qing1，JIN Qiao1，KONG Liang3
(1.Key and Open Laboratory of Aquatic Products Processing and Utilization of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China;2.Jinchi Giant Salamander Biological Technology Co.，Ltd.，Zhangjiajie(China)，Zhangjiajie 427400，China;3.College of Marine Environmental Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China)

Skin mucous of Andrias davidianus was hydrolyzed by compound protease in this article.The optimal conditions of enzymolysis of skin mucous of A.davidianus and its anti－fatigue effect were studied.The results showed that optimal conditions of enzymolysis of skin mucous of A.davidianus were 0.5%(mass ratio)of compound protease and 0.1mg/mL of substrate concentration，reaction time was 2h，pH 8.0，temperature was 65℃.The enzymatic hydrolysates were determined by MALDI－TOF to be less than 4000，which were determined by the phenol－sulfuric acid method to be oligoglycopeptides.After oral administration of mice for 15d，mice were forced swimming to death with 5%body weight loaded.The results showed that compared with control group，group fed oligoglycopeptide prolonged the swimming time significantly，it can reach 103min(P ＜ 0.01)，reduced the consumption of hepatic glycogen 65.0%，and reduced the level of lactic acid in muscle 24.4%.The oligoglycopeptides of A.davidianus can dalay fatigue.

skin mucous of Andrias davidianus;compound protease;anti－fatigue;mice

TS254.1

A

1002－0306(2011)06－0146－04

2010－06－03

李偉(1964－)，男，教授，研究方向:食品生物技術(shù)。