油茶籽多糖分離純化和結(jié)構(gòu)分析

陶 俊，文 漢

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230036)

油茶籽多糖分離純化和結(jié)構(gòu)分析

陶 俊，文 漢*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230036)

以120min、50℃、1∶3的料液比提取多糖粗品，并采用Sevage法對得到的油茶籽多糖粗品進(jìn)行脫蛋白，再通過DEAE－纖維素、SephadexG－100柱層析進(jìn)一步純化，得到三種類型(CPSⅠ、CPSⅡ、CPSⅢ)的油茶籽多糖。油茶籽多糖樣品的水溶液在紫外－可見光260nm(核酸)和280nm(蛋白質(zhì))處無明顯吸收，但在190nm到210nm之間有多糖特征吸收峰。通過柱層析標(biāo)準(zhǔn)樣品分析，可以得出CPSⅠ的分子量大約為256035Da，CPSⅡ的分子量大約為10290.3Da，CPSⅢ的分子量大約為3590Da。薄層色譜分析初步推斷CPSⅠ由半乳糖和木糖組成;CPSⅡ由果糖和木糖，以及另一種不明的單糖組成;CPSⅢ由半乳糖組成。通過紅外光譜分析推測CPSI可能是含有磷酸基團(tuán)的多糖;CPSII和CPSIII都含有純的醇基團(tuán)，且CPSII中的一元醇、二元醇的含量比CPSIII高，CPSII和CPSIII都含有α糖苷鍵和β糖苷鍵。

油茶籽，多糖，分離，純化，薄層色譜，紅外光譜

油茶(Camellia oleifera Abel.)屬雙子葉植物綱山茶科，為常綠小喬木，寬生態(tài)幅物種，與棕油、橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油料植物。茶油的不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菜油、花生油和豆油，與橄欖油相比維生素E含量高一倍，并含有山茶甙等特定生理活性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值。茶籽粕中含有茶皂素、茶籽多糖、茶籽蛋白等，它們都是化工、輕工、食品、飼料工業(yè)產(chǎn)品等的原料，茶籽殼還可制成糠醛、活性炭等，茶殼還是一種良好的食用菌培養(yǎng)基。因此對油茶籽的綜合利用進(jìn)行進(jìn)一步的研究具有很大意義［1］。多糖(polysaccharides)又稱多聚糖，是自然界中含量最豐富的一種生物聚合物，幾乎存在于所有的生物中。據(jù)大量的研究報道，生物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化等生物活性［2］，并具有對身體無毒害作用等優(yōu)點。因此開發(fā)一種多糖類的藥物對填補(bǔ)無毒藥物的空缺具有很深遠(yuǎn)的意義。多糖參與細(xì)胞的各種生命活動，具有多種生物學(xué)功能，然而并不是所有的多糖都具有生物活性，多糖的活性直接或間接地受到結(jié)構(gòu)的制約［3］。因此，加強(qiáng)多糖結(jié)構(gòu)的研究和分析，對于弄清多糖與其生物活性的關(guān)系具有重要的意義。本文針對油茶籽多糖進(jìn)行了提取、分離、純化及純度鑒定，并對油茶籽多糖的理化性質(zhì)、組成及分子量大小進(jìn)行了初步分析，擬探索出一套提高油茶籽多糖純度和原材料利用率的可行方法，為綜合開發(fā)利用油茶籽粕提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶籽 收集于黃山，由安徽黃山徽山食用油業(yè)有限公司提供，室溫保存;DEAE－纖維素

Pharmacia公司產(chǎn)品;SephadexG－150 北京經(jīng)科公司;考馬斯亮蘭染液G250 北京索萊寶科技有限公司;果糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖及阿拉伯糖 上海源聚生物科技有限公司;苯胺、二苯胺、三氯乙酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、異戊醇、氯仿、乙醇、蒽酮、濃硫酸、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸等 均為國產(chǎn)分析純。

傅立葉變換紅外光譜分析儀、1660紫外分光光度計 上海瑞利分析儀器公司;HL－2S橫流泵、全自動部分收集器、TH－300梯度混合器 上海青浦滬西儀器廠;2.5cm×40cm層析柱，722S型分光光度計

上海精密科學(xué)儀器有限公司;LXJ－IIB大容量低速離心機(jī) 上海安寧科學(xué)儀器廠;KQ－400DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆侖市超聲儀器有限公司;LGT－10冷凍干燥機(jī) 北京德天后科技發(fā)展有限公司;超低溫冰箱，F(xiàn)A1104分析天平 上海精科天平;50mm×100mm G型硅膠板 安徽良臣硅源材料有限公司;0.3mm毛細(xì)管等。

1.2 實驗方法

1.2.1 油茶籽多糖粗品的提取 取100g油茶籽粉末，加入300mL蒸餾水后放入恒溫水浴鍋中，在50℃的條件下浸泡120min后，再用超聲波恒溫水浴鍋浸提30min，然后用4層紗布過濾，將過濾后的殘渣重復(fù)上述操作一次。將過濾后的液體收集，以4800r/min離心10min，留取上清液待用。將離心獲得的上清用4倍體積95%的乙醇浸泡，待出現(xiàn)沉淀后以4800r/min離心10min收集沉淀。用Sevage法除蛋白［4］得油茶籽多糖粗品。

1.2.2 油茶籽多糖的純化

1.2.2.1 DEAE－纖維素層析［5］將處理好的DEAE－纖維素裝入層析柱中，以濃度為5mmol/L、流速為1mL/min的NaCl，平衡(2倍柱體積)后開始上樣。上樣至飽和后，用500mL濃度為3mol/L的NaCl溶液與500mL無離子水進(jìn)行梯度混合，開始洗脫，洗至無糖檢出為止?？刂破淞魉贋?mL/min，收集在波峰管數(shù)的洗脫液。將洗脫液濃縮備用。利用蒽酮－濃硫酸法［6］檢測峰管中的糖含量。

1.2.2.2 SephadexG－100柱層析 溶脹后的SephadexG－100裝入2.5cm×40cm層析柱中，用去離子水平衡兩個柱體積后加入上步所得濃縮液。用流速為1.5mL/min的去離子水洗脫，并用蒽酮－濃硫酸法跟蹤檢測，直至無多糖檢出為止，根據(jù)所測得的洗脫峰，分別收集三種多糖。

1.2.3 透析 用1mmol/L EDTA溶液煮沸透析袋0.5h，然后用蒸餾水充分洗滌透析袋。洗畢，將層析得到的三種多糖液分別裝入處理好的透析袋中，用蒸餾水浸泡過夜。

1.2.4 濃縮 將透析后的油茶籽多糖收集液于50℃水浴中，蒸去部分水分進(jìn)行濃縮。

1.2.5 冷凍干燥 將濃縮后的液體收集至燒杯中，然后用冷凍干燥機(jī)凍干成干燥粉末狀后收集。收集所得即為油茶籽多糖精品。

1.3 三種多糖的紫外掃描

分別稱取三種油茶籽CPS 1mg溶于5mL蒸餾水

中，以蒸餾水為參照組進(jìn)行紫外掃描。

1.4 三種多糖的分子量測定［7］

1.4.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線法) 對于特定的測定系統(tǒng)，先以4種Dextran T2000、T500、T70、T10的標(biāo)準(zhǔn)多糖過柱，測其各自的多糖滯留時間。以多糖滯留時間作為橫坐標(biāo)，lgM作為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。可得回歸方程為 y=－0.0161x+7.5013，R2=0.9704。(式中:y:logMw，x:多糖滯留時間min)。在同一測定系統(tǒng)中測出未知物質(zhì)的多糖滯留時間便可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相對分子質(zhì)量。

1.4.2 三種糖的多糖滯留時間的測定 將茶籽多糖精品配制成溶液，濃度為1g/mL，事先保證柱子的高度和標(biāo)準(zhǔn)樣一樣，且流速也必須相同，再將糖溶液加入到SephadexG－100柱子中進(jìn)行層析，然后分別記錄三種多糖流出的時間。

1.5 薄層層析測定多糖的組成［8］

1.5.1 展開劑配制 乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2，按照比例配制1000mL。

1.5.2 顯色劑配制 取0.5g苯胺溶于50mL丙酮，然后加入0.5mL二苯胺，再加入25g三氯乙酸，溶好之后，倒入噴瓶中，閉光保存。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)糖溶液配制 取1g各種標(biāo)準(zhǔn)糖溶于水中，并分別定容到100mL。

1.5.4 油茶籽多糖的薄層層析 稱取20mg油茶籽多糖于1mol/L的硫酸中，沸水浴中水解8h，水解液用BaCO3中和至pH7.0，離心得上清即可;用規(guī)格為0.3mm的毛細(xì)管吸取各種糖溶液，在距薄層板下端1.5cm點樣，點間距0.8cm，點樣過程中可用吹風(fēng)機(jī)吹干;將點好的樣品薄層板，置于盛有展開劑的薄層層析缸中，密閉式展開，溶劑距薄層上端約1cm時取出;將展開過的薄板，在室溫下晾至展層液揮發(fā)至干;將顯色劑均勻灑在薄層板上，此板在80℃的烘箱中烘烤10min后，觀察顏色并記錄。

1.6 多糖的紅外光譜分析［9］

三種多糖樣品以傅立葉變換紅外光譜分析儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽多糖顏色反應(yīng)

油茶籽多糖與硫酸在沸水浴中加熱脫水生成羥甲基呋喃甲醛，再與蒽酮縮合成藍(lán)綠色化合物，其顯色強(qiáng)度與溶液中油茶籽多糖的濃度成正比，在620nm下比色定量。油茶籽多糖樣品及其水解液對雙縮脲試劑和茚三酮溶液均無顏色反應(yīng)，而遇蒽酮－硫酸試劑或其他糖的顯色劑都能發(fā)生相應(yīng)的特征顏色反應(yīng)。

2.2 油茶籽多糖分離純化SephadexG－100柱層析的蒽酮比色法檢測圖

從圖1中可以看到油茶籽多糖經(jīng)過 Sephadex G－100柱層析后有三個多糖峰出現(xiàn)，而且都比較明顯，所以初步將提取的油茶籽多糖根據(jù)分子量的大小分為三種不同的油茶籽多糖，分別為CPSⅠ、CPSⅡ、CPSⅢ。

圖1 油茶多糖純化SephadexG－100柱層析的蒽酮比色法檢測圖

2.3 三種油茶籽多糖紫外掃描

濃度為0.2mg/mL CPSⅠ、CPSⅡ、CPSⅢ分別經(jīng)紫外分光光度計掃描所得圖譜，表明三種油茶籽多糖樣品的水溶液在紫外－可見光260nm(核酸)和280nm(蛋白質(zhì))處無明顯吸收，CPSⅠ在192～216nm處有多糖的特征吸收峰，CPSⅡ在191～198nm處有多糖的特征吸收峰，油茶籽CPSⅢ在200nm以下處有多糖的特征吸收峰。分析結(jié)果表明該物質(zhì)是多糖，且不含蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)。

2.4 油茶籽多糖分子量大小及分析

多糖分子量的測定是研究多糖性質(zhì)的一項較為重要的工作。多糖的性質(zhì)往往與它的分子量有關(guān)。例如，多糖溶液的粘度不但隨濃度的增大面升高，而且與多糖的分子量大小有關(guān)。一般說來，分子量增大粘度升高。凝膠過濾已被廣泛用于糖胺聚糖、寡糖和糖肽的分子量測定及分散性質(zhì)分析。但該分子量測定方法受外界因素影響比較大，在層析過程中一定要保證流速和上樣量，如果上樣量過大，會導(dǎo)致該糖在柱內(nèi)滯留時間變長。

本實驗通過SephadexG－100柱層析，測得CPSⅠ在柱中的滯留時間為130min，利用漸近曲線方程計算出其分子量大小為256035Da;同理，CPSⅡ的滯留時間為216.7min，其分子量大小為10290.3Da;CPSⅢ的滯留時間為245.1min，其分子量大小為3590Da。

2.5 薄層色譜圖譜及分析

2.5.1 CPSⅠ和CPSⅡ組成分析 由圖2可推測CPSⅠ有半乳糖和木糖，CPSⅡ有果糖和木糖，還有一種糖不明。

2.5.2 CPSⅢ組成分析 由圖3可以推測，CPSIII由半乳糖組成。

本實驗所用顯色劑是苯胺－二苯胺丙酮顯色劑，其極易失效，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。我們在原有的基礎(chǔ)上，向該顯色劑中加入了三氯乙酸，此試劑與多種糖均能顯色，而且各有不同的顏色。從實驗結(jié)果可以看出，果糖顯色為棕色斑點，其他幾種糖顯藍(lán)色。因此該顯色劑具有特殊的鑒定意義。

圖2 CPSⅠ和CPSⅡ的薄層色譜

圖3 CPSIII的薄層色譜

2.6 紅外光譜圖譜及分析

2.6.1 CPSⅠ經(jīng)紅外光譜圖譜分析 見圖4和圖5。

圖4 CPSⅠ紅外光譜圖譜

圖5 磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)圖

2.6.2 CPSⅡ經(jīng)紅外光譜圖譜分析 見圖6。

圖6 CPSII紅外光譜圖譜

2.6.3 CPSⅢ經(jīng)紅外光譜圖譜分析 見圖7。

從紅外光譜圖4～圖7可以看出，三種樣品在1000～1200，1200～1400、2800～3200cm－1有多糖類吸收峰，所以可以斷定我們所得三種樣品為多糖。其中CPSⅠ的曲線與磷酸鹽的曲線匹配度很高，而在整個實驗過程中并沒有使用磷酸鹽，并且可以和蒽酮成顯色反應(yīng)，推測CPSⅠ可能是結(jié)合磷酸基團(tuán)的復(fù)合多糖，但仍需要實驗來進(jìn)一步驗證。CPSⅡ和CPSⅢ在(844±8cm)－1和(890±8)cm－1處有吸收峰，說明該種樣品中含有α糖苷鍵和 β糖苷鍵。CPSⅡ與CPSⅢ在1050～1150cm－1之間有醇基團(tuán)的特征吸收峰說明其中含有純的醇基團(tuán)，根據(jù)最高峰和最低峰之間的比值可以發(fā)現(xiàn)CPSⅡ中的一元醇和二元醇多于CPSⅢ。

圖7 CPSⅢ紅外光譜圖譜

3 結(jié)論

3.1 已有研究表明，油茶籽中主要提取的是酸性多糖且?guī)ж?fù)電荷［10］，因此實驗采用適合于各種酸性、中性多糖和粘多糖的DEAE－纖維素層析來去除多糖中的雜質(zhì)。值得注意的是，對油茶籽多糖的純化，其純度是相對，不可能像某些成分那么單一，這里的純化僅是得到相對分子量在某一范圍里較為均一的多糖。

3.2 通過紫外光譜分析發(fā)現(xiàn)三種樣品都具有糖類特征吸收峰而沒有蛋白吸收峰，可以說明所提取的油茶籽多糖不是糖結(jié)合蛋白。

3.3 通過柱層析，得出 CPSⅠ分子量大小為256035Da;CPSⅡ分子量大小為10290.3Da;CPSⅢ分子量大小為3590Da。

通過薄層色譜法，CPSI有半乳糖和木糖，CPSⅡ有果糖和木糖，還有一種糖不明，CPSⅢ由半乳糖組成。因為目前還沒找到與CPSⅡ中第一個斑點所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)糖，故還要進(jìn)一步的研究。

3.4 通過紅外光譜分析進(jìn)一步驗證三種樣品都具有糖類特征吸收峰，CPSⅠ的紅外光譜分析圖和磷酸鹽的紅外光譜分析圖具有很高的相似性，所以推測其可能是一種磷酸鹽多糖。CPSⅡ和CPSIII都含有α糖苷鍵和β糖苷鍵;CPSⅡ和CPSⅢ中含有純的醇基團(tuán)，且CPSⅡ中的一元醇和二元醇多于CPSⅢ，造成這種差別的原因可能是:CPSⅡ的分子量比CPSⅢ大，所以含有的醇基團(tuán)多一些;組成兩種多糖的單糖中的醇基團(tuán)有差別。多糖是極其復(fù)雜的復(fù)合物，需要通過紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振方法的檢測，方可弄清其精確的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。

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Study on the purification and construction of polysaccharides from Camellia oleifera

TAO Jun，WEN Han*
(School of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)

The crude polysaccharides which were extracted under the condition of 120min of the extraction time，50℃of the extraction temperature，the 1∶3 ratio of material to liquid，and camellia oil was

for crude polysaccharide from protein by the Sevage method，DEAE－cellulose column，SephadexG－100 column chromatography for further purification of polysaccharides camellia oil.The results showed that the Camellia oleifera polysaccharides was composed of three types of polysaccharides(CPSⅠ，CPSⅡ，CPSⅢ).What’s more，by ultraviolet－visible spectrum between 190nm and 210nm，there was a absorbance of polysaccharides’features between 190nm and 210nm，not 260nm point and 280nm point，which was two absorbability peaks of nucleic acids’and proteins’features respectively.Through the thin－layer chromatography，we can initially infer that CPSⅠwas composed of galactose and xylose，CPSⅡwas composed of fructose and xylose，as well as another unidentified monosaccharide composition，and CPSⅢ was composed by galactose.And through standard samples by column chromatography，CPSⅠ molecular weight was about 256035Da，CPSⅡ was about 10290.3Da，CPSⅢ was about 3590Da.Through infrared spectral analysis，CPSI speculate may contain phosphoric acid group of polysaccharide，CPSII and CPSIII contain pure alcohol based corporations，and CPSII contain more unitary alcohol，binary alcohol than the CPSIII.Both CPSII and CPSIII contain α polysaccharide glucoside bond and β glucoside bond.

Camellia seed;polysaccharide;isolation;purification;thin－ layer chromatography;infrared spectral analysis

TS225.1+6

A

1002－0306(2011)06－0132－04

2010－04－26 *通訊聯(lián)系人

陶俊(1985－)，男，在讀碩士研究生，研究方向:生物化學(xué)和分子生物學(xué)。