白腐真菌產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

岳曉禹，張恒業(yè)，劉艷娟，牛天貴，劉相東

(1.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校質(zhì)檢系，河南鄭州450011;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083;3.河南商業(yè)高等專科學(xué)校，河南鄭州450044;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京100083)

白腐真菌產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

岳曉禹1，2，張恒業(yè)1，劉艷娟3，牛天貴2，劉相東4

(1.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校質(zhì)檢系，河南鄭州450011;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083;3.河南商業(yè)高等專科學(xué)校，河南鄭州450044;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京100083)

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)白腐真菌Pleurotus ostreatus SYJ042產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明:最適發(fā)酵條件為:碳源為5%的麩皮和玉米芯(1∶1)，氮源為0.5%的蛋白胨，接種量為每50mL發(fā)酵液接4塊菌絲塊，發(fā)酵時(shí)間為8.5d。該酶的最適溫度是50℃，最適pH為5.4;Zn2+、Ca2+對(duì)酶活性影響較小;Ag+、MnO2－4影響較大。

木聚糖酶，發(fā)酵條件，酶學(xué)性質(zhì)

木聚糖是木糖殘基以β－1，4木糖苷鍵連接而構(gòu)成的，是植物細(xì)胞壁中的半纖維素多糖的主要成分，約占植物碳水化合物總量的1/3，在自然界中是繼纖維素之后的含量第二豐富的再生生物資源［1］。木聚糖酶是能夠水解木聚糖的一個(gè)復(fù)合酶系的總稱，主要的酶包括內(nèi)切木聚糖酶(1，4－β－D木聚糖水解酶，EC3.2.1.8)和 β－木糖苷酶(1，4－β－D木聚糖，木寡糖水解酶)［2］。由于木聚糖酶在半纖維多聚糖資源的利用以及工業(yè)應(yīng)用方面的巨大潛力，其廣泛應(yīng)用于飼料、食品、造紙、紡織和釀造工業(yè)，是一種重要的工業(yè)用酶［3］。國(guó)內(nèi)已有不少研究者對(duì)鏈霉菌［4］、曲霉［5］、黑曲霉［6－7］、酵母［8］、木霉［9］等真菌及芽孢桿菌［10－11］等細(xì)菌的木聚糖酶進(jìn)行了研究。國(guó)外很多研究者也進(jìn)行了微生物產(chǎn)木聚糖酶的生產(chǎn)及應(yīng)用研究［12－15］。但很少有采用白腐真菌作為木聚糖酶的來(lái)源進(jìn)行研究，而白腐真菌是安全且具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［16］，并且其中的許多代謝物是制藥、食品的重要來(lái)源［17］。本實(shí)驗(yàn)利用白腐真菌作為提取木聚糖酶的微生物來(lái)源，以實(shí)驗(yàn)室分離保存的白腐真菌(Pleurotus ostreatus SYJ042)為研究菌種，優(yōu)化其產(chǎn)木聚糖酶條件，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1%木聚糖 將1.000g木聚糖(Oat spelts，購(gòu)自Sigma公司)加熱溶解于100mL蒸餾水中定容后，放于冰箱中備用;緩沖液 磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制堿性緩沖液，檸檬酸和檸檬酸鈉配制的酸性緩沖液;DNS試劑 稱取10g 3，5－二硝基水楊酸溶于水中，全部溶解后，加入20g NaOH、200g酒石酸鈉，加入蒸餾水，使總體積至500mL左右，加熱溶解后，加2g苯酚、0.5g無(wú)水亞硫酸鈉，加熱攪拌至全部溶解，冷卻，用水稀釋至1000mL，儲(chǔ)于棕色瓶中，1周后使用。

UV－2800A紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司;恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱 東西儀(北京)科技有限公司;生化培養(yǎng)箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠;超凈工作臺(tái) 上海人和科學(xué)儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基組成

1.2.1 菌種篩選培養(yǎng)基 麩皮5.0g，蛋白胨0.2g，瓊脂1.8g，Mandels鹽溶液100mL［18］。［Mandels氏組成(g/1000mL):NaNO43.0g，KH2PO43.0g，MgSO40.5g，CaCl20.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5×10－3g，MnSO4·H2O 2.5×10－3g，ZnSO4·7H2O2.0×10－3g］。

1.2.2 初始發(fā)酵培養(yǎng)基 5.0g麩皮，0.2g蛋白胨，另外，添加Mandels鹽溶液100mL(組成同上)。

1.2.3 發(fā)酵用液體培養(yǎng)基 2.5g麩皮，2.5g玉米芯，0.8g蛋白胨，添加 Mandels鹽溶液100mL(組成同上)。

1.3 培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)試管斜面培養(yǎng)、平板擴(kuò)大培養(yǎng)和搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)三個(gè)階段組成。從菌種中接入斜面試管中，25℃生長(zhǎng)7d后放在4℃條件貯存?zhèn)溆谩Ｈ缓髮⒃嚬苤信囵B(yǎng)好的一級(jí)菌種接入到平皿培養(yǎng)基中，將平板25℃條件下培養(yǎng)7d，長(zhǎng)滿平板后用于搖瓶液體培養(yǎng)。150mL三角瓶裝液量50mL，接入4塊0.25cm2菌塊，置于旋轉(zhuǎn)式搖床(轉(zhuǎn)速為160r/min)上，26℃培養(yǎng)120h。

1.4 木聚糖酶酶活的測(cè)定方法和酶活定義

木聚糖酶酶活測(cè)定采用DNS法［19］。發(fā)酵液經(jīng)6000r/min離心15min后，取上清液作為測(cè)定酶液。取1mL酶液，加入到4mL蒸餾水中(稀釋5倍，不同批次酶液稀釋倍數(shù)不同)，分成2份，其中1份沸水浴中煮沸20min，滅活作為空白。另外1份作為測(cè)定酶液。取0.2mL酶液(滅活酶液作為空白)加入到0.2mol/L、pH 7.0磷酸緩沖液配制的1%木聚糖溶液中，50℃反應(yīng)15min，煮沸10min，流水冷卻后，加入5.0mL蒸餾水，540nm條件下比色測(cè)吸光度。DNS法測(cè)定還原糖是以木糖為標(biāo)準(zhǔn)，在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生的還原糖相當(dāng)于1μmol木糖的所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)

參考岳曉禹等單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果［20］，選發(fā)酵時(shí)間、接種量、氮源和碳源這4個(gè)重要的影響因素作四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，測(cè)定酶活從而得出最佳的培養(yǎng)條件。

1.6 酶液處理

1.6.1 硫酸銨沉淀 采用固體硫酸銨法。分別取20mL酶液，室溫下，緩緩加入硫酸銨各2.26、3.50、4.84、6.24、7.80、9.48、11.20g，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶解，飽和度分別達(dá)到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。再放于4℃下靜置過(guò)夜，離心收集沉淀。將沉淀溶解于0.2mol/L、pH5.4檸檬酸緩沖液，測(cè)酶活及蛋白含量。計(jì)算酶活回收率和酶比活，得出合適的硫酸銨飽和度。

1.6.2 酶液除鹽 用中空纖維超濾器濃縮酶液，截留分子量為8000Da，工作壓力為0.12MPa，將酶液濃縮、除鹽。

1.7 木聚糖酶學(xué)性質(zhì)研究

1.7.1 酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性 調(diào)不同的水浴溫度分別為30、35、40、45、50、55、60、70、80℃。取混勻的2.8mL反應(yīng)體系(1mL 1%木聚糖和1.8mL pH5.4的檸檬酸緩沖溶液)，于不同溫度下保持10min，然后按本文的測(cè)酶活方法，測(cè)相應(yīng)酶液的OD540，再計(jì)算成相應(yīng)酶活單位，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取其平均值。以得到的各個(gè)酶活為縱軸，以不同反應(yīng)溫度為橫軸作圖，得出最適溫度。

調(diào)不同的水浴溫度為30、40、50、60、70℃。取0.2mL適當(dāng)稀釋的酶液，于不同溫度下靜置10min后取出，用流水冷卻，全部熱處理結(jié)束后，按本文的測(cè)酶活方法，加入預(yù)熱至50℃的2.8mL反應(yīng)體系，測(cè)相應(yīng)的OD540，再計(jì)算成相應(yīng)的剩余酶活力，每個(gè)樣3次重復(fù)，取其平均值。以水浴溫度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)剩余酶活力為縱坐標(biāo)作圖，從而得出酶的熱穩(wěn)定范圍。1.7.2 酶的最適pH及pH穩(wěn)定性 取0.5mL酶液與pH分別為3、4、4.6、5、6、7、8的0.5mL緩沖溶液混勻，靜置15min后，適當(dāng)稀釋，從中取出0.2mL酶液，按本文的測(cè)酶活方法測(cè)相應(yīng)的OD540nm處的吸光度。再計(jì)算出相應(yīng)酶活，每個(gè)樣3次重復(fù)，取其平均值。以酶活為縱軸，以不同緩沖液的pH為橫軸作圖，得出最適pH。

將0.5mL酶液與pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的0.5mL緩沖溶液混勻，4℃下靜置1h，再加入0.5mL pH5.4的緩沖溶液混勻，再室溫靜置10min，適當(dāng)稀釋后，從中取出0.2mL酶液，按本文的測(cè)酶活的方法測(cè)相應(yīng)OD540，再計(jì)算出相應(yīng)剩余酶活。每個(gè)處理3次重復(fù)，取其平均值。以不同pH為橫坐標(biāo)，以相對(duì)剩余酶活力為縱坐標(biāo)作圖，得出酶的pH穩(wěn)定范圍。

1.7.3 金屬離子對(duì)酶活的影響 將濃縮酶液于20mmol/L pH5.4的buffer中透析24h，檢查活性有無(wú)明顯變化。選取不同的金屬離子，加入處理好的酶液中，使金屬離子的終濃度為8mmol/L，振蕩、室溫下靜置15min，按本文的測(cè)酶活方法，得到相應(yīng)的剩余酶活力。以不同金屬離子為橫坐標(biāo)，以相對(duì)剩余酶活力為縱坐標(biāo)作圖，從而得出部分金屬離子對(duì)酶活的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實(shí)驗(yàn)

由表2結(jié)果可知，各因素對(duì)酶活的影響主次順序?yàn)榈?接種量>發(fā)酵時(shí)間>碳源。最優(yōu)化配方是A2B3C2D3，但這個(gè)組合在實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有出現(xiàn)。由實(shí)驗(yàn)得出的最佳處理是A2B3C2D2，重復(fù)這兩個(gè)組合的處理，證實(shí)最佳配方為A2B3C2D3，即碳源為5%的麩皮和玉米芯(1∶1)，氮源為0.5%的蛋白胨，接種量為每50mL發(fā)酵液接4塊菌絲塊，發(fā)酵時(shí)間為8.5d。其它條件是初始pH為6.0，通氣量為發(fā)酵液占容積的1/3。

表3 硫酸銨沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 硫酸銨沉淀結(jié)果

從表3可知，隨著硫酸銨飽和度的增加，析出的沉淀物中的酶活回收率逐漸增加，到70%時(shí)最高，但相應(yīng)的酶比活是60%硫酸銨飽和度時(shí)最高，達(dá)到26.88U/mg，這可能是因?yàn)?0%飽和度時(shí)雜蛋白較多的緣故。而60%和70%時(shí)的酶活回收率差別不是很大，所以采用60%飽和度。

用中空纖維超濾器將濃縮酶液除鹽備用，截留分子量為8000Da，工作壓力為0.12MPa。

2.3 木聚糖酶特性研究

2.3.1 酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性 從圖1可以看出，在采用的測(cè)定條件下，該酶的最適作用溫度是50℃。在低于最適溫度時(shí)，酶活性隨溫度的升高而增強(qiáng);在高于最適作用溫度時(shí)，酶活性隨溫度的升高而降低。在60℃時(shí)有64.2%殘余酶活(設(shè)50℃時(shí)的酶活為100%)，80℃時(shí)殘余酶活降到43.6%。

從圖2可見(jiàn)，在測(cè)定條件下，該酶在30℃處理90min以內(nèi)酶活殘留都保持在89%以上，在40℃下，處理90min以內(nèi)酶活殘留也基本都保持在85%以上，而在50℃處理15min殘余酶活在58.7%，處理30、60、90min殘余酶活分別為 46.7%、41.2%、30.6%，在60℃下處理15min殘余酶活僅剩20.3%，處理60、90min酶活基本全部損失，70℃處理15min殘余酶活僅剩11.4%，此后延長(zhǎng)處理時(shí)間酶活也基本全部損失，可見(jiàn)在低于40℃條件下該酶較穩(wěn)定。說(shuō)明該酶對(duì)溫度很敏感，抗高溫的能力較弱。

圖1 酶的最適溫度

圖2 酶的熱穩(wěn)定性

2.3.2 酶的最適pH和pH的穩(wěn)定性 每種微生物都有其最適pH和一定的pH范圍。最適pH實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，可以得出實(shí)驗(yàn)所得木聚糖酶的最適作用pH為5.4。

圖3 酶的最適pH

pH的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，可以得出該木聚糖酶在pH3.0～11.0之間處理1h后恢復(fù)至pH5.4，酶活性均可恢復(fù)至85%以上，說(shuō)明該酶對(duì)pH不敏感，對(duì)pH的穩(wěn)定性較強(qiáng)。

2.3.3 不同金屬離子對(duì)酶活的影響 用幾種不同金屬離子處理酶液后測(cè)定木聚糖酶活性，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，在8mmol/L濃度下，所選取的幾種金屬離子對(duì)酶活性都有影響，Zn2+、Ca2+影響較小，酶活殘留仍在80%以上;Ag+、MnO24－對(duì)酶活性影響較大，殘留酶活分別為58.7%和13.4%。

圖4 酶的pH穩(wěn)定性

圖5 金屬離子對(duì)酶活的影響

3 結(jié)論

本研究的對(duì)象是白腐真菌，優(yōu)化了該菌株的木聚糖酶產(chǎn)酶條件，并對(duì)其酶活性質(zhì)進(jìn)行了研究。該菌株產(chǎn)木聚糖酶的最適發(fā)酵條件為:碳源為5%的麩皮和玉米芯(1∶1)，氮源為0.5%的蛋白胨，培養(yǎng)溫度為25℃，接種量為每50mL發(fā)酵液接4塊菌絲塊，發(fā)酵時(shí)間為8.5d，初始pH為6.0，通氣量為發(fā)酵液占容積的1/3。酶液的硫酸銨沉淀采用60%飽和度時(shí)，所得的酶比活最高，達(dá)到26.88U/mg。在采用的測(cè)定條件下，該酶的最適作用溫度是50℃;該酶對(duì)溫度很敏感，抗高溫的能力較弱，在低于40℃條件下，該酶較穩(wěn)定。最適作用pH為5.4;該酶對(duì)pH不敏感，對(duì)pH的穩(wěn)定性較強(qiáng)，在pH3.0～11.0之間處理1h后恢復(fù)至pH5.4，酶活性均可恢復(fù)至85%以上。金屬離子在8mmol/L濃度下，對(duì)酶活性都有影響，Zn2+、Ca2+影響較小，酶活殘留仍在80%以上;Ag+、MnO24－對(duì)酶活性影響較大，殘留酶活分別為58.7%和13.4%。

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Study on the optimization of xylanase fermentation conditions by white rot fungi and the enzymological properties

YUE Xiao－yu1，2，ZHANG Heng－ye1，LIU Yan－juan3，NIU Tian－gui2，LIU Xiang－dong4
(1.Department of Quality Detection and Management of Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering，Zhengzhou 450011，China;2.Food Science＆Nutrition Engineering College of China Agriculture University，Beijing 100083，China;3.Henan Business College，Zhengzhou 450044，China;4.Technical Institute of China Agriculture University，Beijing 100083，China)

By the orthogonal test，the optimal fermented condition of xylanase secretion by white rot fungi was obtained:2.5%wheat bran+2.5%corn cob，0.5% peptone，4 pieces per 50mL liquid volume，8.5d.By the experimental method in the thesis，some properties of the xylanase were obtained:the optimal temperature was at 50℃.The optimal pH was 5.4.Ag+and MnO2－4evidently impacted on the xylanase activity.

xylanase;fermented conditions;properties

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0197－04

2010－10－08

岳曉禹(1974－)，男，博士研究生，講師，研究方向:食品微生物。

鄭州牧專博士科研啟動(dòng)資金資助項(xiàng)目。