白楊素敏化TRAIL誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡

任 翔 ，劉 飛 ，韓守恒 ，曹建國

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013；2.南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 (tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)具有誘導(dǎo)被病毒感染的細(xì)胞、惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡而對正常組織及細(xì)胞幾乎沒有毒性作用的特點[1-3]，使其極有可能成為新的抗腫瘤候選藥。白楊素 (chrysin,ChR)能抑制包括人胃癌SGC-7901細(xì)胞在內(nèi)的多種人腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞生長[4-5]。Szliszka等[6]最近報道富含ChR的蜂膠乙醇提取物增強TRAIL誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本文旨在研究ChR敏化TRAIL誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡作用。

1 材料和方法

1.1 試劑

ChR和碘化丙啶(PI)為美國Sigma公司產(chǎn)品，TRAIL為英國PeproTech公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢市)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，置于37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d傳代1次。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)分析

參照文獻[7]取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，用含0.1%的小牛血清的培養(yǎng)基處理24 h進行細(xì)胞周期同步化后，分別加入含標(biāo)示濃度受試物的培養(yǎng)基處理48 h,0.1%DMSO作為溶媒對照。收集所有貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，用4℃的75%乙醇固定24 h，經(jīng)碘化丙啶(PI)染色，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞DNA含量。

1.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳

參照文獻[8]取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞，分別加入含標(biāo)示濃度受試物的培養(yǎng)基處理48 h,培養(yǎng)基作為細(xì)胞對照，含0.1%DMSO的培養(yǎng)基作為溶媒對照。收集所有貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，按北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司凋亡細(xì)胞DNA ladder檢測試劑盒說明書步驟分別提取DNA，置于4℃冰箱過夜。再將提取的DNA樣品5 μL與6×Buffer 1 μL混勻后，加到1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，Alphaimager TM 2200凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并攝影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)錄入SPSS 15.0 for windows evaluation軟件，建立數(shù)據(jù)庫，各組實驗數(shù)據(jù)用mean±SD表示，用行方差分析；對照組均數(shù)與實驗組均數(shù)間的比較用LSD法，P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 亞毒性濃度ChR、TRAIL及兩者合用對SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響

ChR 40 μmol/L或TRAIL 100 ng/mL單獨處理SGC-7901細(xì)胞48 h，其亞二倍體DNA含量細(xì)胞百分率 (凋亡率)分別為 (4.57±0.54)%、(3.70±0.1)%(圖1)；說明二者單獨作用時，在受試濃度水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用微弱；但是，用40 μmol/L的ChR預(yù)孵育30 min，再加入100 ng/mL的TRAIL處理48 h，發(fā)生凋亡的SGC-7901細(xì)胞顯著增加，細(xì)胞凋亡率為(48.81±4.11)%(圖1)。提示：亞毒性濃度的ChR能有效地增強TRAIL導(dǎo)誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡。

圖1 亞毒性濃度的 ChR、TRAIL及兩者合用對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

2.2 亞細(xì)胞毒性濃度的ChR、TRAIL及兩者合用對SGC-7901細(xì)胞DNA斷裂的影響

DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示：單用ChR 40 μmol/L或TRAIL 100 ng/mL作用48 h，未見典型DNA 梯形條帶(圖 2)；但是，用 40 μmol/L的 ChR 預(yù)孵育30 min，再加入100 ng/mL的TRAIL處理48 h，展示出典型DNA梯形條帶圖譜(圖2)；證實亞細(xì)胞毒性濃度的ChR具有顯著增強TRAIL誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡作用。

圖2 亞毒性濃度的ChR、TRAIL及兩者合用對SGC-7901細(xì)胞DNA斷裂的影響(DNA瓊脂糖凝膠電泳)

3 討論

TRAIL相對其家族成員TNF和Fas L而言，其抗瘤譜更廣，具有腫瘤細(xì)胞特異性毒性，并且其誘導(dǎo)凋亡作用不依賴p53機制，使其有望成為抗腫瘤新候選藥物[9]。但隨著研究廣泛開展，發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞耐受TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用。本文單用TRAIL(100 ng/mL)處理SGC-7901細(xì)胞，PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析其細(xì)胞凋亡率僅為(3.70±0.1)%，同時DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測未見凋亡細(xì)胞的典型DNA梯形條帶，說明人胃癌SGC-7901細(xì)胞對TRAIL耐藥。

有研究報道，化療藥物5-氟尿嘧啶、阿霉素、依托泊苷及喜樹堿等可顯著提高TRAIL誘導(dǎo)多種人腫瘤細(xì)胞系凋亡[9]。我們先前的研究證實：ChR及其衍生物可通過激活PPARγ，抑制Bcl-2和NF-kappaB蛋白表達，增加Bax蛋白表達誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡[10]。促使我們研究亞毒性濃度的ChR能否敏化TRAIL誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡。

本文研究顯示，ChR(40 μmol/L)與 TRAIL(100 ng/mL)聯(lián)合誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別是單用 ChR 和 TRAIL的 10.7和 13.2倍 (圖 1)，提示：亞毒性濃度的ChR能有效增強TRAIL導(dǎo)誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡。本文最后用瓊脂糖凝膠電泳試驗發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合處理展示出典型DNA梯形條帶圖譜(圖2)，說明兩者合用能誘導(dǎo) SGC-7901細(xì)胞DNA核小體間斷裂。證實：亞細(xì)胞毒性濃度的ChR具有增強TRAIL誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，本文的結(jié)論是ChR具有增敏TRAIL誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡作用，因此，飲食黃酮ChR與TRAIL聯(lián)合應(yīng)用可望成為治療人胃癌的新策略。

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