人胚嗅鞘細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的研究

劉 波，滕曉華，段 答，周 蓉，潘林香，盧 明

（湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院，解放軍第163醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 長沙 410003）

二十世紀(jì)九十年代神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使得人們對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)的再生等都有了新的認(rèn)識,人們對干細(xì)胞的了解也將更加全面。神經(jīng)干細(xì)胞的研究仍處于初級階段，神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化仍有較大的難度。嗅鞘細(xì)胞(OECs)兼具星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膜細(xì)胞的特點(diǎn),由于其對中樞神經(jīng)的再生具有促進(jìn)作用,近年來受到研究人員的高度重視,被廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細(xì)胞移植研究。本實(shí)驗(yàn)利用嗅鞘細(xì)胞的上清液中多種成分誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化,觀察其神經(jīng)干細(xì)胞分化的方向，分化后的存活和電活動情況。

3.3 目前螺蟲乙酯在蘋果樹、梨樹、柑橘樹和番茄上進(jìn)行了登記，在在獼猴桃上沒有進(jìn)行登記。推薦在蘋果樹上的施藥方式為3000～4000倍液噴施，在梨樹和柑橘樹上的推薦劑量為4000～5000倍液，安全間隔期分別為21 d、21 d和20 d；最多施用次數(shù)均為2次。本實(shí)驗(yàn)以3000倍液稀釋液噴施2次，28 d后，獼猴桃中螺蟲乙酯母體的殘留量為0.06 mg/kg，遠(yuǎn)高于我國制定的0.02 mg/kg的最大殘留限量值。因此螺蟲乙酯在獼猴桃中施用合適劑量還有待進(jìn)一步研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12(1:1)、DMEM、B27 添加劑、重組人bFGF、EGF購自 Gbico公司，F(xiàn)BS購于 Hyclone公司，小鼠抗人Nestin、NGFR p75抗體、小鼠抗人NSE抗體為abcam公司產(chǎn)品;tunnel試劑盒購自merck公司，人胚(16周)為經(jīng)患者同意本院流產(chǎn)的胎兒。

1.2.1 嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

嗅鞘細(xì)胞在接種后24 h幾乎全部貼壁，呈球形。4 d時(shí)多數(shù)細(xì)胞呈三角形、梭形，細(xì)胞發(fā)出纖細(xì)的突起(圖1)。 純化培養(yǎng)2 d后雙極細(xì)胞所占比例較大，同時(shí)也有三極細(xì)胞出現(xiàn)。P75免疫反應(yīng)，幾乎均呈陽性，形態(tài)呈三角或條梭狀，細(xì)胞走向不一。通過免疫組化觀察，本法培養(yǎng)的細(xì)胞純度可達(dá)90%左右(圖 2)。

1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

1023 靜脈溶栓治療后不明原因早期神經(jīng)功能惡化相關(guān)因素和臨床特征分析 黃石仁，沈紅健，邢鵬飛，沈 芳，張永巍，吳 濤，鄧本強(qiáng)

1.2 神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化 分3組，每組設(shè)6個(gè)標(biāo)本，A組：嗅鞘細(xì)胞上清液誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化；B組：RTRA誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化；C組：含5%FBS的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化

1.2.1 嗅鞘細(xì)胞上清液誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化

經(jīng)純化后的嗅鞘細(xì)胞消化后用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞完全伸展開后加入神經(jīng)(DMEM/F12+2%B27)細(xì)胞培養(yǎng)基，1天后將多聚賴氨酸包被的蓋玻片置于放入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，把神經(jīng)干細(xì)胞接種于玻片上，2～3天半量換液。

迅速取出腦組織并分離兩側(cè)海馬解剖顯微鏡下剝除腦膜。D-Hanks液漂洗,用眼科剪反復(fù)切割組織,收集入離心管中,吸管反復(fù)吹打，再用200目細(xì)胞篩過濾后制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后,分裝入50 mL培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞數(shù)約為5×106/mL,培養(yǎng)基為:DMEM/F12+2%B27+20 ng bFGF+20 ng EGF,每3～4 d換液一次，每6～7 d傳代1次。將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞球接種于poly-l-lysine包被的載玻片上在10%FBS DMEM/F12中培養(yǎng)4 h，然后用4%多聚甲醛固定30 min,0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次,加入一抗巢蛋白(1:400)后4℃過夜,0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，SABC顯色。

司法實(shí)踐中，常將《侵權(quán)責(zé)任法》《人身損害賠償司法解釋》關(guān)于雇主無過錯(cuò)的責(zé)任規(guī)定稱為雇主責(zé)任。中山大學(xué)法學(xué)院張民安教授將雇主責(zé)任稱為“替代責(zé)任”[1]15，重慶大學(xué)法學(xué)院楊署東教授，則將雇主責(zé)任稱為“轉(zhuǎn)承責(zé)任”。民事轉(zhuǎn)承責(zé)任是一種責(zé)任人因與他人間的特定基礎(chǔ)關(guān)系而對他人的侵權(quán)行為承擔(dān)民事責(zé)任的責(zé)任形式。楊教授認(rèn)為，雇主責(zé)任是一種特殊的侵權(quán)責(zé)任，從屬于替代責(zé)任。[2]20筆者贊同楊教授觀點(diǎn)，認(rèn)為雇主責(zé)任是從屬于替代責(zé)任的轉(zhuǎn)移承擔(dān)。雇主轉(zhuǎn)承責(zé)任的核心內(nèi)涵是“責(zé)任的轉(zhuǎn)移承擔(dān)”。

1.2.2 RTRA和5%FBS組

將NSCs接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，培養(yǎng)基分別為加入5%FBS的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基和加入5×10-6RA的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基，2～3天半量換液。于第10天行NSE、GFAP免疫組化和tunel細(xì)胞凋亡檢測。

1.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞分化后免疫組化檢測

把各組分化的細(xì)胞經(jīng)丙酮固定20 min后涂在載玻片上,0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次,加入一抗 NSE(1:300)后 4℃過夜,0.01 mol/L PBS沖洗 5 min×3次，SABC 顯色。

總而言之，在企業(yè)經(jīng)營管理工作開展進(jìn)程中，要積極建立健全完整的監(jiān)督管理措施，充分考量管理者特質(zhì)、內(nèi)部控制機(jī)制等因素，確保能有效提升企業(yè)的市場價(jià)值，維護(hù)企業(yè)運(yùn)營管理的動力，并且有效建構(gòu)完整的發(fā)展規(guī)劃，提高企業(yè)的市場競爭力，為企業(yè)可持續(xù)進(jìn)步奠定基礎(chǔ)。

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞的分化情況

神經(jīng)干細(xì)胞4d可形成十幾個(gè)至幾十個(gè)細(xì)胞組成的呈懸浮生長的細(xì)胞球，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，折光性強(qiáng)。以后神經(jīng)細(xì)胞球逐漸變大，7 d左右可形成上百個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞球(圖3 A)，細(xì)胞克隆球進(jìn)行Nestin免疫熒光染色，呈Nestin抗原陽性(圖3 B)。

“家政服務(wù)業(yè)從業(yè)人員就業(yè)前景好，我們在市場調(diào)查的基礎(chǔ)上，總結(jié)為三個(gè)原因?！?泓福泰家政服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)人方蓓燕向記者介紹道。

于 7d、14d、21d對 A組和 B組行 tunnel細(xì)胞凋亡檢測，細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛固定，按tunnel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒流程染色后蘇木素復(fù)染。

自從那次跟同學(xué)鬧事送醫(yī)院以后，班里同學(xué)都用一種奇怪的眼神看他，甚至躲得遠(yuǎn)遠(yuǎn)的，曾經(jīng)在他身邊前呼后擁的那些小伙伴們也都疏遠(yuǎn)了他，簡單地說就是大家都怕他。

1.2.5 神經(jīng)干細(xì)胞分化后膜片鉗檢測

A組細(xì)胞于12d行膜片鉗檢測。鈉電流檢測：分化的神經(jīng)細(xì)胞鉗制在-80mV，給予-80mV至+60mv的系列峰波刺激，步幅為+10mV記錄到一系列內(nèi)向鈉電流。鉀電流的檢測：同樣將細(xì)胞鉗制在-80mV，給予-80mV至+60mV的系列刺激得到慢激活慢失活外向鉀電流。

2 結(jié)果

2.1 嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)和免疫組織化學(xué)結(jié)果

迅速取出兩側(cè)嗅球,置于D-Hanks平衡鹽溶液中除去軟膜,然后用D-Hanks液沖洗兩遍。在手術(shù)顯微鏡下去膜，剪碎。將剪碎組織離心，800 r/min,3 min后取出,棄去上清液，滴加2 mL 0.125%v/v的胰蛋白酶消化液置于37℃10 min。稍吹打后吸取上清液加入含10%FBS 2 mL DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，重復(fù)以上步驟3～4次；收集細(xì)胞懸液離心，800 r/min,3 min,棄去上清液,用含10%FBS的DMEM/F12重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)選密度為5×105個(gè)/mL接種于50cm斜口細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃)中培養(yǎng)。于培養(yǎng)第3天換無血清DMEM限制培養(yǎng)基，以后每3天半量換液一次，培養(yǎng)9 d的細(xì)胞經(jīng)消化接種于蓋玻片上，培養(yǎng)3 d后用4%多聚甲醛固定,按照SABC方法行神經(jīng)生長因子受體NGFR p75免疫組化染色。

圖1 嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)第9天結(jié)果(×200)

圖2 嗅鞘細(xì)胞免疫組織化學(xué)結(jié)果(×200)

例如講必修2“The Olympic Games”一課時(shí)，在上課前三分鐘利用Flash讓學(xué)生感受《we got it》。并且布置上網(wǎng)查閱有關(guān)“奧運(yùn)”信息的作業(yè)，大大提高學(xué)生學(xué)習(xí)英語的興趣。在教學(xué)過程中，要注意思想教育工作與教學(xué)工作的互相滲透，寓思想教育于教學(xué)中。如在學(xué)習(xí)必修1“Nelson Mandela—a modern hero”一課時(shí)，教師要給學(xué)生講述偉人的事跡及優(yōu)良品質(zhì)，讓學(xué)生樹立自己心目中的英雄形象，作為自己遇到困難時(shí)的激勵(lì)者。

1.2.4 神經(jīng)干細(xì)胞分化后tunel細(xì)胞凋亡檢測

A組和B組神經(jīng)干細(xì)胞分化過程基本相似，以不對稱雙極形為主，少量扁平狀細(xì)胞(圖3 C)。C組幾乎全為扁平狀細(xì)胞。染色結(jié)果顯示(圖3 D),A組NSE陽性率分別為80.3%,B組NSE陽性率77.5%,C組NSE陽性率2%,A組和B組明顯高于C組(2%);A組和B組對照無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，A組和B組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

式中，Kr為回波衰減系數(shù)，φn為目標(biāo)反射的隨機(jī)相位，為點(diǎn)目標(biāo)回波瞬時(shí)延時(shí)時(shí)間，發(fā)射信號和接收信號進(jìn)行混頻后得

圖3 神經(jīng)干細(xì)胞的分化情況

2.3 嗅鞘細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

7d、14d、21d對A組和B組tunnel細(xì)胞凋亡比例分別為 A組 0.9%、1.2%、1.4%，B組 1%、3.3%、8.6%，結(jié)果見圖4。

圖4 嗅鞘細(xì)胞凋亡比例

2.4 二組細(xì)胞膜片鉗檢測結(jié)果

A組細(xì)胞于12d行膜片鉗檢測：鈉電流在-30mV下被激活，-10mV左右達(dá)到最大，+40mV和+50mV之間 電流值翻轉(zhuǎn)變?yōu)橥庀螂娏?圖5)。鉀電流激活電壓為-20mV，其激活和失活都比較慢，應(yīng)為延遲整流鉀電流(圖6)。

3 討論

圖5 膜片鉗檢測鈉電流情況

圖6 膜片鉗檢測鉀電流情況

研究表明，嗅鞘細(xì)胞不但能直接參與神經(jīng)軸突髓鞘的形成而且還分泌多種營養(yǎng)因子，被許多學(xué)者認(rèn)為是治療中樞神經(jīng)損傷最好的移植細(xì)胞之一，OECs被植入損傷的中樞,可以形成細(xì)胞橋引導(dǎo)神經(jīng)軸突生長,并向遠(yuǎn)距離延伸[1-2]。成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞在體外不能生長，而來源于成熟嗅覺系統(tǒng)的OECs卻能生長。雖然其具體生長的分子及細(xì)胞基礎(chǔ)還不清楚，但是嗅覺系統(tǒng)軸突延長和特定的靶向突觸作用與嗅鞘細(xì)胞的促生長作用密不可分的。 嗅鞘細(xì)胞能分泌大量不同種類的神經(jīng)營養(yǎng)和支持因子，如血小板源生長因子、神經(jīng)肽、神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和睫狀神經(jīng)生長因子等[3]。

RTRA是公認(rèn)的能誘導(dǎo)NSC向神經(jīng)元分化的較強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，本研究顯示嗅鞘細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元比例稍高于RTRA組，雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但表明嗅鞘細(xì)胞能強(qiáng)力誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。7 d、14 d、21 d對A組和B組tunnel細(xì)胞凋亡比例檢測顯示A組細(xì)胞凋亡比例較為平穩(wěn)，B組細(xì)胞凋亡比例7 d是與A組相當(dāng)，而在14 d、21 d時(shí)凋亡比例大幅度升高明星高于A組，提示嗅鞘細(xì)胞上清液能在較長時(shí)間內(nèi)減少分化后的細(xì)胞凋亡，研究表明神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和睫狀神經(jīng)生長因子等能催進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活。此外，本實(shí)驗(yàn)對A組細(xì)胞于12 d行膜片鉗檢測顯示58%的細(xì)胞具有了電興奮性，而電興奮性是神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮功能的基礎(chǔ)和外在表現(xiàn)，說明分化后的神經(jīng)元細(xì)胞已經(jīng)具備了神經(jīng)元細(xì)胞的基本功能。

NSCs的分化受多種因素調(diào)節(jié),與細(xì)胞起源和自身狀態(tài)有密切關(guān)系[4]。體外培養(yǎng)的NSCs則與其所在微環(huán)境密切相關(guān),其中主要因素就是培養(yǎng)基質(zhì)中的各種因子,這些因子成分和濃度決定了NSCs的分化方向[5-7]。本實(shí)驗(yàn)研究表明嗅鞘細(xì)胞上清液誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化有明顯作用，促進(jìn)分化后的細(xì)胞存活，這可能與其能分泌多種細(xì)胞因子及抑制有害因子的作用相關(guān)，同時(shí)嗅鞘細(xì)胞上清能促使NSCs分化后的神經(jīng)元成為有功能的神經(jīng)元，具備了替代受損的神經(jīng)元細(xì)胞的相關(guān)基礎(chǔ)。

由于神經(jīng)干細(xì)胞具有多向分化能力,體內(nèi)移植后易于存活等特點(diǎn),可作為細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或修復(fù)損傷神經(jīng)組織的理想材料[8],隨著干細(xì)胞研究領(lǐng)域向深度和廣度不斷擴(kuò)展，神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞移植治療各種中樞神經(jīng)退行性變,腦癱以及中樞神經(jīng)損傷必將得到廣泛的應(yīng)用[9]，本實(shí)驗(yàn)研究為嗅鞘細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷奠定理論基礎(chǔ)。

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