VEGF蛋白及mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義

朱德為，劉庚勛，李正賢

（1.解放軍169醫(yī)院病理科，湖南 衡陽 421002；2.湖南省師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院，解放軍163醫(yī)院病理科，湖南 長沙 410003）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，癌細(xì)胞的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移均離不開新生血管及淋巴管的生成。VEGF是最重要的血管內(nèi)皮刺激因子，腫瘤血管生成過程中發(fā)揮核作用[1]。本研究應(yīng)用免疫組化En-visionTM和半定量RT-PCR法，檢測乳腺癌和乳腺纖維腺瘤中VEGF蛋白及mRNAVEGF的表達(dá)情況，并分析其臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，旨在探討VEGF蛋白和mRNA在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有病例均為我院2007年6月～2009年6月間臨床資料完整的乳腺癌(均為浸潤性癌)病例56例 ，年齡37～72歲,中位年齡為45.3歲,所有患者均接受手術(shù)治療，術(shù)前未接受過放療、化療或免疫治療，經(jīng)病理確診。組織學(xué)分級：I級15例，II級28例，III級13例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例；同時(shí)隨機(jī)抽取同時(shí)期確診的乳腺纖維腺瘤30例作對照組。標(biāo)本分兩份，一份經(jīng)4%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,連續(xù)3 μm切片,常規(guī)HE染色及VEGF免疫標(biāo)記。另一份迅速投入液氮中速凍,然后置于-70℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 免疫組化染色

即用型VEGF單克隆抗體、EnvisonTM試劑盒及DAB顯色劑均購于福州邁新公司,染色步驟按試劑盒說明進(jìn)行操作。以已知的試劑盒提供的VEGF陽性切片做陽性對照，以PBS液代替一抗作空白對照和用非免疫血清代替一抗的陰性對照。

1.3 陽性結(jié)果評定

VEGF以細(xì)胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞。在奧林帕斯光學(xué)顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞比例和陽性著色深淺。對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析,按照細(xì)胞著色的深淺分成:陽性細(xì)胞數(shù)<10%為(-),陽性細(xì)胞數(shù)10%～25%為(+)，25%～50%(++),多于 50%為(+++)。

1.4 乳腺癌中mRNAVEGF的表達(dá)

將保存于-70℃冰箱的腫瘤組織在無酶操作下，按Trizol(Invitrogen公司)試劑盒說明抽提組織總RNA后測吸光度值,計(jì)算RNA的純度，然后吸取相同劑量的RNA(2～4 μg),按照MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒具體操作，按說明合成cDNA。合成的cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，VEGF引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[2]合成，上游引物序列為:5'-GAGGGCAGAATCATCACGAAGT-3',下游序列為:5'-TCCTATGTGCTGGCCTTGGTGA-3',內(nèi)對照GAPDH(三磷酸甘油醛脫氫酶)的引物采用Primer5.0設(shè)計(jì)，GAPDH上游引物序列為5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3',下游引物序列為5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3',擴(kuò)增片段分別為258bp和540bp,由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性33min,94℃ 40s,58℃ 40 s,72℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 5 min。PCR擴(kuò)增后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物,進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。紫外燈下觀察結(jié)果、拍照,在電腦凝膠成像系統(tǒng)中分析電泳帶的灰度，用VEGF/GAPDH的比值表示VEGF的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)，非參數(shù)Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)

免疫組化方法檢測乳腺癌組織中VEGF蛋白的陽性率為75.0%，陽性染色定位于癌細(xì)胞胞漿(見圖1，圖2)。VEGF的表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級成正相關(guān)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；腫瘤組織學(xué)分級越高者其陽性表達(dá)率也增高，組間比較亦有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

圖1 VEGF在乳腺纖維腺瘤中陰性表達(dá)(EnvisionTM×200)

圖2 VEGF在乳腺癌中陽性表達(dá)(EnvisionTM×400)

表1 乳腺癌組織中VEGF表達(dá)與臨床病理聯(lián)系

2.2 乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤組織中mRNA VEGF的表達(dá)

圖3 乳腺癌組織中mRNAVEGF的表達(dá)

半定量RT-PCR方法檢測乳腺癌組織中mRNAVEGF的表達(dá) (見圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有病例均有mRNAVEGF表達(dá),正常乳腺纖維腺瘤組織mRNAVEGF相對表達(dá)量為(0.3275±0.0384)；乳腺癌組織mRNAVEGF 相對表達(dá)量為(0.8207±0.1042)，明顯高于對照組 (P＜0.05)，在VEGF蛋白表達(dá)高的病例中,mRNAVEGF表達(dá)也較高。與腫瘤的組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

3 討論

腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與多步驟的復(fù)雜過程，血管形成在腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮極其重要的作用。眾多的血管形成相關(guān)因子中，VEGF被認(rèn)為可能是最強(qiáng)烈的促強(qiáng)烈的血管生成因子[2]，VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性的有絲分裂原，可特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長及血管生成，并能提高血管通透性，刺激血管和淋巴管的生成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生與遷移，增加血管和淋巴管通透性，促進(jìn)某些蛋白質(zhì)水解酶的作用導(dǎo)致基質(zhì)水解，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供基質(zhì)[3]。VEGF與乳腺癌血管生成密切相關(guān)，并能促進(jìn)其生長、浸潤及轉(zhuǎn)移[4]。

Adams等[1]在研究中發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)量與乳腺癌的分期直接相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在乳腺癌組織中陽性表達(dá)率顯著高于乳腺纖維腺瘤組(P＜0.05);乳腺癌VEGF表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤組織學(xué)分級有相關(guān)性(P＜0.05)。說明VEGF蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)VEGF陽性率在分化較差的乳腺癌中較高,其陽性率隨組織學(xué)分級增高而增高。與Koyama，Berezov，施紅旗等的研究結(jié)果一致[5-7]。本研究顯示通過檢測VEGF蛋白的表達(dá),可以預(yù)測乳腺癌的惡性程度,為臨床治療提供重要參考。

本實(shí)驗(yàn)還采用半定量RT-PCR法檢測mRNA VEGF的水平，結(jié)果顯示其平均表達(dá)水平與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織學(xué)分級顯著相關(guān);組織學(xué)分級越高mRNAVEGF的表達(dá)水平越高,并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)，與章樂虹等[8]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明,VEGF蛋白及mRNA在乳腺癌進(jìn)展過程中起重要作用,與腫瘤的惡性生物學(xué)行為直接相關(guān)。

總之，VEGF蛋白和mRNAVEGF在乳腺癌中的表達(dá)率高，而在乳腺纖維腺瘤中表達(dá)率低下，且與乳腺癌的組織學(xué)分級、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，VEGF有可能成為判斷乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的有價(jià)值指標(biāo)和新的治療靶點(diǎn)。

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