利用雨生紅球藻表達(dá)系統(tǒng)高通量篩選活力提高的阿特拉津氯水解酶突變子

王繪磚，陳喜文，郝曉華，陳德富

南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

呼延霆，尹大川，王偉，宋凱，王燕，盧慧甍，楊慧，薛小平

西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，西安 710072

利用雨生紅球藻表達(dá)系統(tǒng)高通量篩選活力提高的阿特拉津氯水解酶突變子

王繪磚，陳喜文，郝曉華，陳德富

南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

阿特拉津氯水解酶定向改造的關(guān)鍵是開發(fā)一種廉價(jià)的、表型改變明顯的高通量篩選方法。利用高錯(cuò)誤傾向PCR和DNA洗牌相結(jié)合的突變方法，對(duì)來源于假單胞菌ADP和節(jié)桿菌AD1的阿特拉津氯水解酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變，以雨生紅球藻為受體、以阿特拉津?yàn)檫x擇壓力對(duì)突變文庫進(jìn)行高通量篩選。篩選到的12個(gè)突變子序列分析顯示，突變均為點(diǎn)替換，位點(diǎn)分散在全基因上，是在高錯(cuò)誤傾向PCR及DNA洗牌過程中逐漸累積形成的。酶活力分析顯示，突變子的酶活力均高于野生株，在添加1.0 mg/L阿特拉津培養(yǎng)液中的活力是野生株的1.9~3.6倍，在添加2.0 mg/L阿特拉津培養(yǎng)液中的活力是野生株的1.7~2.6倍，粗酶提取物的活力是野生株的1.7~2.7倍。上述結(jié)果表明，雨生紅球藻表達(dá)系統(tǒng)是定向改造阿特拉津氯水解酶的高通量篩選平臺(tái)。

阿特拉津氯水解酶，定向進(jìn)化，雨生紅球藻，高通量篩選，酶活性

Abstract:Developing a high-throughput screening method is of great importance for directed evolution of atrazine chlorohydrolase.A mutagenesis library of atzA from Pseudomonas sp. ADP and Arthrobacter sp. AD1 was constructed using error-prone PCR and DNA shuffling. Candidate mutants were screened through Haematococcus pluvialis expression system, using atrazine as selection pressure. Sequence analysis showed that mutations in the obtained 12 mutants with enhanced activity were all point-substitutions and scattered throughout the gene. Enzymatic activity analysis showed that the mutants all had higher activities than that of the wild type.The activities were 1.8?3.6 fold of the wild-type enzyme when cultured in BBM medium with 1 mg/L atrazine, whereas 1.8?2.6 fold with 2 mg/L atrazine. These results indicated that Haematococcus pluvialis expression system is an ideal high throughput screeningsystem for directed evolution of atrazine chlorohydrolase.

Keywords:atrazine chlorohydrolase, directed evolution, Haematococcus pluvialis, high throughput screening, enzyme activity

阿特拉津 (Atrazine) 是一種世界范圍內(nèi)廣泛使用了 50多年的、廉價(jià)的、適合于玉米高粱果園和林地等雜草防除的“選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型”苗前/苗后除草劑，在有效控制雜草、顯著提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)方面發(fā)揮重要作用[1]。然而，阿特拉津在土壤中的殘留期長(zhǎng) (4~57周)、不易流失，因此在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)揮重要作用的同時(shí)，也嚴(yán)重污染了農(nóng)業(yè)和人居環(huán)境[2]，已引起世界各國(guó)廣泛關(guān)注 (如歐盟規(guī)定飲用水的最大允許濃度為0.1 μg/L、美國(guó)為3 μg/L、加拿大為5 μg/L)，并將其列為當(dāng)前“亟需解決的實(shí)際問題”[3-4]。

利用抗性基因解毒機(jī)制，構(gòu)建高效去除污染物的轉(zhuǎn)基因植物，是20世紀(jì)90年代以來環(huán)境修復(fù)研究的重要方向[5]。阿特拉津化學(xué)名稱為 2-氯-4-乙氨基-6-異丙氨基-1,3,5-三氮苯 (2-chloro-4-ethylamino-6-isopropylamino-1,3,5-triazine)。一旦2-位上的氯原子被水解掉，即變成無毒的羥基阿特拉津[6]。因此，尋找合適的阿特拉津氯水解酶基因是利用植物修復(fù)阿特拉津污染環(huán)境的關(guān)鍵。1995年，Mandelbaum等[7]克隆到降解阿特拉津的阿特拉津氯水解酶(Atrazine chlorohydrolase，AtzA，EC.3.8.1.8) 基因(atzA)。但隨后的植物轉(zhuǎn)基因研究顯示，苜蓿、水稻、煙草等轉(zhuǎn)基因株的降解阿特拉津能力仍需提高[8-10]。

自1995年來，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室從其他菌株中也克隆到 atzA。序列比對(duì)和功能分析發(fā)現(xiàn)，不同來源的阿特拉津氯水解酶不僅氨基酸序列高度同源，而且比活力無明顯差異[11-13]。如假單胞菌Pseudomonas sp.ADP菌株來源的 AtzA與節(jié)桿菌Arthrobacter AD1菌株來源的AtzA，僅在278位上有一個(gè)對(duì)阿特拉津脫氯活性無影響的氨基酸殘基的差異[14]。AtzA序列的高度同源及功能的一致特性，表明 AtzA結(jié)構(gòu)保守、進(jìn)化緩慢，要想從自然界中尋找高活性的 atzA基因可能并非易事。

模擬生物自然進(jìn)化過程的定向進(jìn)化技術(shù)是蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)[15]，其策略非常適合于結(jié)構(gòu)不清楚的AtzA的改造。由于AtzA介導(dǎo)的酶促反應(yīng)無特異性的顏色改變，大腸桿菌本身又可耐受一定濃度的阿特拉津，因此定向改造AtzA的關(guān)鍵是開發(fā)一種廉價(jià)的、表型改變明顯的高通量篩選方法。為此，本文利用雨生紅球藻 Haematococcus pluvialis表達(dá)體系建立了一種穩(wěn)定高效的高通量篩選 AtzA酶活力提高的突變子方法。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

雨生紅球藻藻種“H1”購自中鹽制鹽工程技術(shù)研究院。大腸桿菌DH5α-FT、質(zhì)粒pCAMBIA1301、pET21b-atzA-NK (含節(jié)桿菌 AD1來源的 atzA-AD1基因，基因注冊(cè)號(hào)為 AF543694) 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pMD4 (含假單胞菌ADP來源的atzA-ADP基因，基因注冊(cè)號(hào)為U55933) 為美國(guó)Minnesota大學(xué)Michael Sadowsky教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 制備雨生紅球藻感受態(tài)細(xì)胞

參照Brown等[16]的方法并稍做修改。雨生紅球藻接種于 BBM 培養(yǎng)基[17]中，于 (25±3) ℃、50~60 μmol/(m2·s) 光照 12 h/黑暗 12 h條件下不定期振蕩 (1次以上/d)培養(yǎng)。3 000 r/min離心5 min收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞 (約 1×106個(gè))，所得沉淀懸浮于電擊緩沖液 (含500 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、5 mmol/L CaCl2、20 mmol/L Hepes、200 mmol/L甘露醇和200 mmol/L山梨醇) 中，反復(fù)懸浮離心2次所得藻體最終用電擊緩沖液調(diào)整密度至1×107個(gè)細(xì)胞/mL，分裝成 40 μL/管備用。

1.2.2 確定抑制雨生紅球藻生長(zhǎng)的阿特拉津臨界濃度

取1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期雨生紅球藻分別轉(zhuǎn)至20 mL含0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L阿特拉津的BBM培養(yǎng)液中，21 d后鏡檢統(tǒng)計(jì)綠色的、結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞數(shù)，以此確定雨生紅球藻忍耐阿特拉津的臨界濃度。

1.2.3 atzA雙元載體的構(gòu)建及雨生紅球藻的遺傳轉(zhuǎn)化

根據(jù)基因 atzA-ADP和 atzA-AD1序列及質(zhì)粒pCAMBIA1301多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)PCR引物，上 游 為 atzA-S-FTCAGCATCC-3′，下劃線為 Sac I酶切位點(diǎn))，下游為 atzA-X-R (5′-AATCTAGA CTAGAGGCTGCGCCA AGC-3′，下劃線為Xba I酶切位點(diǎn))。以質(zhì)粒pMD4或 pET21b-atzA-NK為模板，以 atzA-S-F/atzA-X-R為引物進(jìn)行高保真擴(kuò)增，PCR方法參見文獻(xiàn)[18]。擴(kuò)增產(chǎn)物用Sac I和Xba I消化后，與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶消化的植物雙元載體 pCAMBIA1301連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。篩選序列未突變的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)以提取其重組的雙元質(zhì)粒 pCAMBIA1301-atzA。

取 1 μL 攜 帶 有 0.4 μg 的 雙 元 質(zhì) 粒pCAMBIA1301-atzA加入到雨生紅球藻感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰浴靜置10 min，再轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.1 cm Bio-Rad電轉(zhuǎn)化杯中。電擊3次 (間隔10 s、試驗(yàn)電擊強(qiáng)度為 3~8 kV/cm) 后冰浴靜置 5 min，再轉(zhuǎn)入BBM液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)24 h，然后平鋪到含阿特拉津的BBM固體培養(yǎng)基上，倒置光照培養(yǎng)至單藻落出現(xiàn)。

1.2.4 atzA突變文庫的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pMD4或 pET21b-atzA-NK為模板，以atzA-S-F/atzA-X-R為引物進(jìn)行易錯(cuò)PCR (Error-prone PCR，EP-PCR)。EP-PCR 體系為：0.2 mmol/L dATP、0.2 mmol/L dGTP、1.0 mmol/L dCTP、1.0 mmol/L dTTP、0.1 mmol/L dITP、每種引物 0.3 μmol/L、7.5 mmol/L MgCl2、0.01% Triton X-100、1.0 μmol/L NaNO2(或 37.5 μmol/L CoCl2)、0.05 U/μL rTaq DNA聚合酶及 0.01 ng/μL atzA-ADP (或 atzA-AD1)。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 40 s℃，58 ℃32 s，72 ℃ 1 10 s ，循環(huán)50次；72 ℃延伸7 min。隨后經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離EP-PCR產(chǎn)物，分別 命 名 為 ADP-atzA-NO2?、ADP-atzA-Co、AD1-atzA-NO2?、AD1-atzA-Co。15 ℃下 0.1 U/μL DNase I消化EP-PCR產(chǎn)物5~15 min后，85 ℃保溫20 min，再添加5% (V/V) 預(yù)冷緩沖液A [含50 mmol/L EDTA和 30% (V/V) 甘油] 終止反應(yīng)?；厥战?jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離的約100 bp DNA片段后，等摩爾比混合進(jìn)行無引物重排反應(yīng)。無引物重排反應(yīng)條件同EP-PCR，但不加引物，100 bp左右DNA混合片段的濃度為20~80 ng/μL，循環(huán)數(shù)為25。

0.7%瓊脂糖凝膠電泳回收無引物重排反應(yīng)產(chǎn)生的1.2~1.5 kb條帶，再進(jìn)行有引物PCR。擴(kuò)增體系為：0.2 mmol/L dNTPs、每種引物 0.3 μmol/L、0.05 U/μL rTaq DNA 聚合酶及適量 (5~20 ng/μL) 無引物重排 DNA。有引物 PCR條件同無引物重排反應(yīng)。產(chǎn)物回收后用Sac I和Xba I消化，并與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶消化的 pCAMBIA1301載體連接，然后電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α-FT，計(jì)算庫容。

1.2.5 AtzA突變子的篩選

回收突變文庫全部菌落，提取其質(zhì)粒DNA，按1.2.3建立的遺傳轉(zhuǎn)化方法將atzA突變質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)雨生紅球藻細(xì)胞，然后平鋪在含0.5 mg/L (5倍臨界濃度) 阿特拉津的BBM固體培養(yǎng)基上，倒置光照培養(yǎng)至單藻落出現(xiàn)。挑選生長(zhǎng)明顯的單藻落逐級(jí)轉(zhuǎn)接至阿特拉津濃度為0.5 mg/L、1 mg/L和2 mg/L的BBM培養(yǎng)液中，3周后提取仍生長(zhǎng)良好的雨生紅球藻轉(zhuǎn)化株的基因組 DNA，以 atzA-S-F/atzA-X-R為引物通過Ex Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測(cè)。PCR和RT-PCR方法參見文獻(xiàn)[18]。回收PCR條帶與pMD19-T Simple Vector (TaKaRa) 連接后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.6 AtzA突變酶的活力分析

取 1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 AtzA轉(zhuǎn)化株，4 ℃、5 000 r/min離心收集所得藻體轉(zhuǎn)至4 mL含1 mg/L或2 mg/L阿特拉津的BBM培養(yǎng)液中，第0、1、7、14、21天取樣測(cè)定培養(yǎng)液中的阿特拉津殘留量，以確定酶活測(cè)定時(shí)間。

不同突變株培養(yǎng) 21 d后取樣測(cè)定培養(yǎng)液上清中的阿特拉津殘留量，以降解1 μg阿特拉津?qū)?yīng)的培養(yǎng)液體積 (mL) 為1個(gè)AtzA酶活力單位，以此比較不同突變子的活力差異。相同轉(zhuǎn)化株的酶活力取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，處理間差異經(jīng)新復(fù)極差檢測(cè)。

取20 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化株，4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集藻體，液氮研磨后迅速加入600 μL預(yù)冷植物蛋白提取緩沖液 (150 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25%甘油，2% PVP40)，冰上靜置3~4 h后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清即為酶粗提取液。粗酶提取液的蛋白含量測(cè)定按照 Bradford法[19]進(jìn)行。取3 mg蛋白量對(duì)應(yīng)的粗酶提取液，添加0.6 mg阿特拉津后25 ℃保溫16 h，再測(cè)其阿特拉津殘留量，以降解1 mg阿特拉津所需粗酶提取液的量(mg蛋白) 為1個(gè)AtzA酶活力單位，以此比較不同突變子的活力差異。相同轉(zhuǎn)化株的酶活力取 3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，處理間差異經(jīng)新復(fù)極差檢測(cè)。

1.2.7 阿特拉津殘留量的高壓液相法測(cè)定

在培養(yǎng)液上清或粗酶提取液中加入等體積的二氯甲烷，混勻后25 ℃、200 r/min下振蕩1 h，再經(jīng)12 000 r/min離心15 min，取下層 (二氯甲烷層)10 μL進(jìn)行高壓液相分析[20]。高壓液相檢測(cè)儀為美國(guó)CoMetro公司的CoM 6000 HPLC Pressure Liquid Delivery System，色譜柱為 Comatex C18 (5 μm，Ф4.6×250 mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm，阿特拉津保留時(shí)間為20.925 min。流動(dòng)相為乙腈和水混合物，0~6 min，乙腈由10%升到25%，水由90%降到75%；6~21 min，乙腈由25%升到65%，水由75%降到35%；21~23 min，乙腈由65%升到100%，水由35%降到0；23~25 min，乙腈保持100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化雨生紅球藻表達(dá)atzA體系的建立

雨生紅球藻對(duì)阿特拉津的耐受力測(cè)試顯示，0.1 mg/L阿特拉津即可完全抑制其生長(zhǎng) (表1)，因此，確定該濃度為阿特拉津抑制雨生紅球藻生長(zhǎng)的臨界濃度。

表1 雨生紅球藻對(duì)阿特拉津的耐受力測(cè)試Table 1 Tolerance test of Haematococcus pluvialis to atrazine

在不同電壓條件下，將重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-atzA電轉(zhuǎn)化進(jìn)雨生紅球藻細(xì)胞，對(duì)獲得的單藻落進(jìn)行PCR抽檢。結(jié)果顯示 (表2)，隨著電擊強(qiáng)度的增大，獲得的單藻落數(shù)隨之減少，當(dāng)電擊強(qiáng)度達(dá)到8 kV/cm時(shí)，培養(yǎng)基表面發(fā)白，無明顯單藻落，表明雨生紅球藻細(xì)胞被電擊致死。PCR抽檢顯示，電擊強(qiáng)度在7 kV/cm以下，陽性率隨電壓增強(qiáng)而提高。根據(jù)單藻落數(shù)和抽檢陽性率計(jì)算陽性單藻落數(shù)，顯示6 kV/cm最多，為atzA轉(zhuǎn)化雨生紅球藻最適電擊強(qiáng)度。

表2 不同電壓對(duì)雨生紅球藻轉(zhuǎn)化率的影響Table 2 Effect of voltage on transformation efficiency of Haematococcus pluvialis

2.2 atzA突變文庫的構(gòu)建

分別以質(zhì)粒 pMD4和 pET21b-atzA-NK為模板，以 atzA-S-F/atzA-X-R為引物，以 NaNO2或CoCl2為誘變劑進(jìn)行 EP-PCR。圖 1顯示，目的條帶 (1.4 kb) 清晰。電泳切膠回收該目的條帶后用DNase I消化，結(jié)果如圖2所示，隨消化時(shí)間延長(zhǎng)，片段變短，當(dāng)消化15 min時(shí)，片段集中在100 bp左右。

圖1 atzA的EP-PCR電泳圖譜Fig. 1 Electrophosis pattern of atzA after EP-PCR. M: marker NTKV-3 (bp); 1: ADP-atzA-NO2?; 2: ADP-atzA-Co; 3:AD1-atzA-NO2?; 4: AD1-atzA-Co.

圖2 atzA的DNase I消化電泳圖譜Fig. 2 Electrophosis pattern of atzA restricted with DNase I.M: marker NTKV-3 (bp); 1?6: treated time was 5 min, 10 min,and 15 min, respectively.

切膠回收100 bp左右條帶進(jìn)行無引物重排，電泳顯示在1.4 kb處有一明顯亮帶 (圖3)，表明DNase I消化的短片段重新組裝成了全長(zhǎng)片段。當(dāng)模板濃度為80 ng/μL時(shí)，無引物重排的條帶最亮。切膠回收該重排條帶進(jìn)行有引物 PCR，發(fā)現(xiàn)模板濃度為10~20 ng/μL時(shí)，能有效擴(kuò)增出1.4 kb條帶 (圖4)。

圖3 atzA片段的無引物重排Fig. 3 Reassembly of the restricted atzA fragments. M: marker NTKV-3 (bp); 1: full-length of the atzA fragment; 2?4: the amount of the digested fragments were 80 ng/μL, 40 ng/μL and 20 ng/μL, respectively.

圖4 atzA重排產(chǎn)物的有引物PCRFig. 4 Amplification profile with primers using different amount of reassembled fragments as template. M: marker NTKV-3 (bp); 1?3: the amount of the reassembled fragments were 5, 10 and 20 ng/μL, respectively; 4: full-length atzA fragment.

2.3 AtzA突變庫的篩選及序列分析

回收有引物PCR產(chǎn)物，Sac I/Xba I雙酶切后與經(jīng)同樣酶酶切的 pCAMBIA1301片段連接，電轉(zhuǎn)化進(jìn) DH5α-FT，得庫容為 1.5×105的突變文庫。收集全部轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒，然后電轉(zhuǎn)化雨生紅球藻，再平鋪于含0.5 mg/L或1.0 mg/L阿特拉津的BBM 固體培養(yǎng)基上，倒置光照培養(yǎng)至單藻落出現(xiàn)(圖 5)。

分析不同轉(zhuǎn)化批次所得的12株AtzA突變子序列(表3)發(fā)現(xiàn)，突變子10-7和10-15、22-4和22-11、40-8和48-6/49-10的氨基酸突變位點(diǎn)完全相同，表明不同轉(zhuǎn)化批次轉(zhuǎn)化子可篩選出相同的 AtzA突變子，暗示以雨生紅球藻為平臺(tái)能穩(wěn)定篩選出活力提高的AtzA突變子。

圖5 可能攜帶AtzA進(jìn)化酶的雨生紅球藻單藻落Fig. 5 Haematococcus pluvialis single colony which may carry evolved AtzA.

表3 獲得的12個(gè)酶活力提高的AtzA進(jìn)化子的序列分析Table 3 Sequence analysis of the obtained 12 improved AtzA mutants

比對(duì)表3突變序列發(fā)現(xiàn)，AtzA突變均為點(diǎn)替換，位點(diǎn)分散在全基因上，突變子10-7 (V12A) 和21-1(L395P) 為單點(diǎn)替換；22-4 (M226V、V/M278A) 為雙點(diǎn)替換；15-1 (T195A、M337T、F439L) 和 16-1(V58A、H80R、T121A) 為三點(diǎn)替換；7-10 (M315I、H399Q、N429S、V466A) 為四點(diǎn)替換；48-6 (A30G、M315I、R389C、H399Q、N429S、V466A) 為六點(diǎn)替換；32-2 (A30G、Q71R、M315I、R389C、H399Q、N429S、V466A) 為七點(diǎn)替換。7-10、32-2和 48-6(40-8/49-10) 均在315位、399位、429位和466位上發(fā)生了點(diǎn)替換，48-6 (40-8/49-10) 在上述4個(gè)位點(diǎn)基礎(chǔ)上又在30位和389位上發(fā)生了點(diǎn)替換，32-2比48-6(40-8/49-10) 在71位多一個(gè)點(diǎn)替換，表明位點(diǎn)突變是在EP-PCR及DNA洗牌過程中逐漸累積形成的。

2.4 AtzA突變酶活力分析

選取突變序列完全不同的 3株突變株 15-1、16-1和48-6，接種到含2 mg/L阿特拉津的BBM培養(yǎng)液中，第 0、1、7、14、21天取樣分析其阿特拉津降解率與時(shí)間的關(guān)系 (圖6)，顯示未含atzA的雨生紅球藻僅降解很少的阿特拉津 (約 2%~5%)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，降解率無明顯提高；3株突變株的阿特拉津降解率隨時(shí)間延長(zhǎng)，降解率明顯提高，第21天時(shí)降解率最高 (15-1為41.3%，16-1為42.9%，48-6為 43.6%)。

圖6 不同AtzA突變株不同時(shí)間的阿特拉津降解率Fig. 6 Atrazine degradation rate of Haematococcus pluvialis with mutated atzA at different times.

為比較不同突變子的阿特拉津降解活力，將含atzA突變基因的雨生紅球藻培養(yǎng)在含1 mg/L或2 mg/L阿特拉津的BBM培養(yǎng)液中，21 d后測(cè)定不同突變子的酶活力；同時(shí)，提取突變株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期粗酶提取液測(cè)定其酶活力 (表 4)，結(jié)果顯示，所有突變株的上清酶活力或粗酶提取液酶活力都明顯高于野生株AtzA-ADP。以AtzA-ADP酶活力為1，得各突變子的相對(duì)酶活力，可以看出，培養(yǎng)液中添加1 mg/L阿特拉津時(shí)，22-4活力最高，為 3.6；10-7次之，為3.2；21-1再次之，為3.1；其余突變株介于1.8~2.3之間。培養(yǎng)液中添加2 mg/L阿特拉津時(shí)，22-4活力最高，為2.6；48-6次之，為2.4；10-7和32-2再次之，為2.3；其余突變株介于1.7~2.2之間。粗酶提取液相對(duì)酶活力比較發(fā)現(xiàn)，10-7、21-1和32-2最高，為2.7；16-1、22-4和48-6次之，分別為2.6、2.5和2.3；7-10和15-1最低，為1.7和1.9。結(jié)合突變位點(diǎn)信息，發(fā)現(xiàn) 12位 (10-7)、226位 (22-4) 和395位 (21-1) 氨基酸殘基的改變對(duì)酶活力影響較大，可能是重要的酶活力位點(diǎn)。由于突變株7-10的酶活力提高最小，而與 7-10具有相同突變位點(diǎn)的32-2和48-6又有較高的相對(duì)活力，暗示30位、71位和389位可能是重要的酶活力位點(diǎn)，315位、399位、429位和466位可能不是重要的酶活力位點(diǎn)。

表4 不同AtzA突變酶的阿特拉津降解活力分析Table 4 Analysis of the atrazine degradation activity among the evolved AtzA mutants

3 討論

阿特拉津作為世界范圍內(nèi)廣泛使用的除草劑，在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)揮積極作用的同時(shí)，也給環(huán)境帶來嚴(yán)重的污染。對(duì)阿特拉津污染環(huán)境的治理和修復(fù)已成為目前急需解決的實(shí)際問題，atzA的分離為該問題的解決提供了幫助，但目前分離得到的atzA具有很高的同源性，編碼的AtzA功能無差異[11-13]，因此限制了該酶的綜合利用。對(duì)AtzA進(jìn)行改造以提高酶活力，將會(huì)大大促進(jìn)該酶的應(yīng)用，為阿特拉津污染環(huán)境修復(fù)奠定基礎(chǔ)的同時(shí)也會(huì)推動(dòng)對(duì)該酶結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究。2001年Seffernick等[21]對(duì)atzA的DNA洗牌研究和2009年Scott等[22]對(duì)atzA的有限點(diǎn)飽和突變研究，均獲得了 AtzA酶活力提高的突變子。Seffernick等的篩選方法是氣相色譜法，氣相色譜法顯然不是高通量篩選方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高，因此篩選規(guī)模僅在1 600突變株水平，且僅篩選出1個(gè)酶活力提高 1.4倍的突變酶，效果很不理想。Scott等[22]的篩選方法是降解圈大小的比較，降解圈大小的比較雖然是高通量篩選方法，但降解圈通常不清晰、時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，其大小判定人為影響很大，且與菌落生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)，難以重復(fù)，因此以其來判定突變子優(yōu)劣缺乏足夠的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。所以，建立穩(wěn)定的、簡(jiǎn)單易行的高通量篩選方法是AtzA大規(guī)模定向改造的關(guān)鍵。

本文開發(fā)的雨生紅球藻篩選系統(tǒng)是以atzA為標(biāo)記基因、以阿特拉津?yàn)楹Y選壓力對(duì)突變酶進(jìn)行篩選，完全基于培養(yǎng)基自動(dòng)篩選機(jī)制，因此是一種典型的正向高通量篩選方法——無或低 AtzA活性藻株在高濃度阿特拉津培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制，難以形成單藻落；高AtzA活性藻株因生長(zhǎng)不受影響而迅速發(fā)育成單藻落。所以，通過阿特拉津選擇壓力的人為調(diào)節(jié)，從atzA突變文庫中可有效獲取高活性突變子。本文選擇雨生紅球藻為受體系統(tǒng)，是因?yàn)槠涫且环N具有雙鞭毛的淡水單細(xì)胞綠藻[23]，繁殖速度快 (幾個(gè)小時(shí)可繁殖一代)、培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單 (可在固體培養(yǎng)基上生成單藻落)、對(duì)阿特拉津敏感 (致死濃度為0.1 mg/L)，且通過操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高的電擊轉(zhuǎn)化方法可大量獲取單藻落，因此可實(shí)現(xiàn)AtzA突變子的大規(guī)模篩選。本文得到的12個(gè)突變子的AtzA活力明顯改善這一結(jié)果，表明該篩選手段非常有效。由于阿特拉津篩選壓力僅人為調(diào)節(jié)，因此篩選工作也非常簡(jiǎn)單。

本文結(jié)果雖證實(shí)該高通量篩選系統(tǒng)簡(jiǎn)單有效，但其自身也存在瑕疵。外源atzA在雨生紅球藻基因組中的重組是基于Ti載體插入原理，而Ti載體插入具一定隨意性[24]，使得突變酶活力除序列相關(guān)外，還與插入位置有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在 5倍阿特拉津臨界濃度篩選壓力下得到了 1株陽性轉(zhuǎn)化子，但測(cè)序顯示其序列與野生型atzA-ADP序列完全相同，顯示插入隨意性對(duì)定向篩選的干擾。依此推測(cè)，某些有益突變子也可能因插入位點(diǎn)不合適而被遺漏掉。為避免此干擾，可將突變的atzA基因定點(diǎn)插入到雨生紅球特定藻基因組中進(jìn)行篩選，但遺憾的是，目前植物同源重組頻率尚很低 (最高為 10?3~10?4)[25]，無法保證篩選規(guī)模。此外，細(xì)菌來源的atzA基因在雨生紅球藻中的表達(dá)還可能因密碼子偏好性問題而出現(xiàn)干擾，比如細(xì)菌atzA基因突變?yōu)橛晟t球藻偏好密碼子而出現(xiàn)高表達(dá)，或突變?yōu)橛晟t球藻稀有密碼子而出現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)，都將導(dǎo)致假陽性或假陰性干擾。在序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)過程中確實(shí)存在基因序列發(fā)生突變但氨基酸序列未發(fā)生改變的突變子。為避免密碼子偏好性干擾，可將篩選到的突變基因再轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，以準(zhǔn)確闡明對(duì)其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。

本文結(jié)果顯示，雨生紅球藻在阿特拉津濃度低于0.1 mg/L的BBM培養(yǎng)基中能緩慢生長(zhǎng)，表明雨生紅球藻自身對(duì)阿特拉津有一定耐受性。該耐受性不僅影響高通量篩選，還影響突變酶活性分析。為此，篩選中務(wù)必增加突變子序列分析過程，同時(shí)對(duì)突變酶進(jìn)行活性分析時(shí)還應(yīng)排除雨生紅球藻自身對(duì)阿特拉津的吸收。本文所得突變子的酶活力均扣除了未轉(zhuǎn)化atzA雨生紅球藻對(duì)阿特拉津的吸收，所得酶活力比較準(zhǔn)確地反映了其真實(shí)活力變化。

本文構(gòu)建的 atzA突變文庫為 EP-PCR與 DNA洗牌相結(jié)合的隨機(jī)突變文庫，庫容雖僅 105水平，但突變種類是豐富的。在文庫篩選前，隨機(jī)測(cè)定了5個(gè)突變子的序列，發(fā)現(xiàn)其中 4個(gè)突變子為多點(diǎn)替換突變，另1個(gè)突變子除缺失1 061 bp片段外還增加了非同源的183 bp片段，顯示突變文庫除點(diǎn)突變外，還有缺失和插入突變。但5倍阿特拉津篩選壓力篩選到的7個(gè)突變子 (7-10、15-1、16-1、21-1、40-8、48-6和49-10)，10倍篩選壓力篩選到的5個(gè)突變子 (10-7、10-15、22-4、22-11和32-2) 序列分析發(fā)現(xiàn)，突變均為點(diǎn)突變，不存在缺失或插入突變類型，表明AtzA高度保守，不允許氨基酸殘基數(shù)目發(fā)生改變。在篩選到的 12個(gè)突變子中，17%的突變子 (10-7和10-15) 在12位上發(fā)生突變 (V12A)，17%的突變子 (22-4和22-11) 在226位上發(fā)生突變(M226V)，25%的突變子 (40-8、48-6和 49-10) 在30、315、389、399、429和 466位上共同突變 (A30G、M315I、R389C、H399Q、N429S、V466A)，表明其中的某些突變位點(diǎn)可能與酶活性有關(guān)，但其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系尚需更多數(shù)據(jù)支持。

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人類天冬胺?；?羥化酶的表達(dá)及其單克隆抗體的制備

呼延霆，尹大川，王偉，宋凱，王燕，盧慧甍，楊慧，薛小平

西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，西安 710072

摘 要:旨在深入研究人類天冬胺?；?羥化酶 (HAAH) 在腫瘤早期診斷中的作用機(jī)制。應(yīng)用RT-PCR方法從肝癌組織中獲得人類天冬胺?；?羥化酶HAAH編碼基因，并在原核表達(dá)載體pBV-IL1中進(jìn)行融合表達(dá)，將Ni柱純化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠，獲得了3株穩(wěn)定的陽性單克隆細(xì)胞株 (H3/E10、E4/F12、G4/D8)，間接ELISA和Western blotting鑒定單抗的特異性和靈敏度，以單抗H3/E10介導(dǎo)的間接免疫熒光檢測(cè)HAAH在各種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)，可見特異的熒光。試驗(yàn)中成功構(gòu)建了可表達(dá)HAAH基因的原核表達(dá)載體pBV-IL1-HAAH，并制備了3株抗HAAH的單克隆抗體，為HAAH的結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步將該抗體應(yīng)用于腫瘤的早期診斷以及研究HAAH在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移中的機(jī)理提供了重要工具。

關(guān)鍵詞:人類天冬胺?；?羥化酶，pBV-IL1，原核表達(dá)，單克隆抗體

Abstract:We investigated the mechanism of human aspartyl β-hydroxylase (HAAH) in early diagnosis of tumors. The encoding gene of HAAH was cloned from the hepatic carcinoma by RT-PCR and expressed as a fused protein in the prokaryotic vector pBV-IL1. The expressed HAAH was purified by Ni2+-NTA purification column and the purified protein was then used to immunize Balb/c mice. Three hybridoma cell lines (respectively designated H3/E10, E4/F12and G4/D8) stably expressing the monoclonal antibody specific to HAAH fusion protein were obtained. The specificity and sensitivity of the monoclonal antibody were assessed by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blot analysis. Finally, the monoclonal antibody expressed by H3/E10cell line was used to detect the expression of HAAH in several tumor cell lines by indirect immuno-fluorescence, and the specific fluorescence was observed. In conclusion, this study successfully constructed the recombinant prokaryotic vector pBV-IL1-HAAH and prepared HAAH-specific monoclonal antibody for further study of the structure and function of the protein. Theresult may also lay solid foundation for the research of the molecular mechanism of HAAH in early diagnosis of tumors.

Keywords:human aspartyl β-hydroxylase, pBV-IL1, prokaryotic expression, monoclonal antibody

人類天冬胺?；?β-羥化酶 (Human Aspartyl/Asparaginyl β-hydroxylase，HAAH) 是胚胎期即存在于細(xì)胞內(nèi)的一種酶，屬于依賴 α-酮戊二酸雙加氧酶家族，可催化特定蛋白中表皮生長(zhǎng)因子 (EGF) 受體樣結(jié)構(gòu)域的天冬氨酸或天冬酰胺殘基上的 β-碳原子羥基化[1]。10余年的研究表明HAAH在腫瘤細(xì)胞表面的高表達(dá)，使得瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和擴(kuò)散性顯著增加，并通過血管和淋巴管擴(kuò)散到臨近的正常組織，最終引起腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤病灶的形成，但其作用機(jī)制尚不明確。因此它可能是體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的重要靶點(diǎn)，被認(rèn)為是一種新型惡性腫瘤高特異性的分子標(biāo)記物[2]。

本研究利用溫度誘導(dǎo)的原核表達(dá)載體pBV-IL1[3]重組表達(dá)了HAAH蛋白，經(jīng)純化后用重組蛋白免疫小鼠，篩選并獲得了抗HAAH特異的單克隆抗體細(xì)胞株，為HAAH的結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步將該抗體應(yīng)用于腫瘤的早期診斷以及研究HAAH在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移中的機(jī)理提供了重要工具。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌組織：由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病醫(yī)院趙青川教授提供，樣品的取得均遵守現(xiàn)行的道德規(guī)范準(zhǔn)則，并正式得到所有參與者和該研究各方的同意，該組織標(biāo)本經(jīng)病理檢驗(yàn)確診為肝細(xì)胞肝癌，保存在液氮中。腫瘤細(xì)胞系：人腎腺癌細(xì)胞ACHN、人膀胱癌細(xì)胞BIU-87、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人喉癌細(xì)胞Hep-2、人宮頸癌細(xì)胞 HeLa、人卵巢癌細(xì)胞 SKOV、人正常肝細(xì)胞L02均購自中國(guó)科學(xué)院武漢細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購自美國(guó)GIBCO公司，新生牛血清購自杭州四季青公司。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含有100 mL/L新生牛血清、100 mg/L青霉素及 1×104U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。E. coli DH5α、HB101等菌株由本室保存。

pBV-IL1載體由本室保存； pGEMT-easy載體購自Promega公司。E. coli DH5α等菌株由本室保存；各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和 RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Sigma公司；DNA Marker和蛋白Marker為 Hybigen公司和百泰克生物技術(shù)公司產(chǎn)品；針對(duì)His的鼠源性單克隆抗體 (Catalog No.:70796-4) 為美國(guó) Merck公司產(chǎn)品，IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG熒光二抗購自美國(guó)Li-Cor生物技術(shù)公司。PCR所用引物及產(chǎn)物測(cè)序均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模板的制備

取液氮中的肝癌腫瘤組織約100 mg，依照Trizol法提取組織總 RNA，使用 PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa) 合成cDNA第一鏈。

1.2.2 HAAH基因的克隆

根據(jù)GenBank發(fā)表的HAAH的cDNA序列 (GI:14589865)，綜合利用Primer5和Oligo6引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)HAAH的全長(zhǎng)引物 (表1)。引物Forward包含Xho I酶切位點(diǎn)及His標(biāo)簽序列；引物Reverse包含Spe I酶切位點(diǎn)及終止碼。

表1 HAAH克隆引物序列Table 1 Cloning primer sequences of HAAH

以反轉(zhuǎn)錄得到的HAAH cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到HAAH基因片段，PCR產(chǎn)物電泳后回收目的片段，通過 T4 DNA連接酶將目的基因克隆到pGEMT-easy載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素 (100 mg/mL Amp)的 LB平板，挑取單克隆進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定獲得陽性克隆。

1.2.3 pBV-IL1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將測(cè)序鑒定正確的陽性克隆載體 pGEMT/HAAH，經(jīng)Xho I/Spe I酶切后得到HAAH基因片段，插入到同時(shí)經(jīng)Xho I/Xba I酶切的pBV-IL1載體中，連接轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp抗性的 LB平板，挑取單克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，獲得重組載體pBV-IL1-HAAH。

1.2.4 HAAH重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定、可溶性分析及其純化

將重組 pBV-IL1-HAAH原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入HB101宿主菌，過夜菌1:50轉(zhuǎn)接入含Amp的LB培養(yǎng)基中，30 ℃搖菌4 h，再調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至42 ℃誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間5 h。同時(shí)設(shè)空載體對(duì)照組 (培養(yǎng)條件同實(shí)驗(yàn)組) 和非誘導(dǎo)培養(yǎng)對(duì)照組(30 ℃培養(yǎng))。

4 000r/min、4 ℃離心30 min，收集得到菌體后，取少量菌液與2×上樣緩沖液混合，95 ℃、10 min裂解菌體后，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting鑒定目的蛋白的表達(dá)。以抗His 標(biāo)簽的單抗作為一抗，以羊抗鼠熒光抗體 (Goat anti mouse IRdye 800)為二抗，最后采用 Odyssey紅外發(fā)光顯色法鑒定目的蛋白的表達(dá)；其余大部分菌體使用超聲破碎，4 000 r/min、4 ℃離心30 min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行其可溶性分析。

收集2 L誘導(dǎo)表達(dá)菌，10 000 r/min離心30 min收集菌體沉淀，用100 mL平衡液重懸后，超聲波處理30 min，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，收集裂解上清。采用Ni2+NTA親和柱純化重組蛋白，并備樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 抗HAAH單克隆抗體的制備及鑒定

用純化的HAAH重組蛋白作為抗原對(duì)6~8周齡Balb/c小鼠進(jìn)行免疫。初次免疫，50 μg抗原 (溶于100 μL PBS) 以 1:1 (V/V) 的比例加入福氏完全佐劑，充分混合制成乳液，分多點(diǎn)注射于Balb/c小鼠頸背部皮下。間隔2周追加免疫1次，方法為腹腔注射 100 μg/只抗原 (溶于 100 μL PBS，不加福氏佐劑)，共追加免疫2次。每次免疫后1周尾靜脈采血，分離血清，非競(jìng)爭(zhēng)間接ELISA法測(cè)定免疫效果。細(xì)胞融合采用PEG融合法，有限稀釋法進(jìn)行陽性克隆篩選，陽性雜交瘤細(xì)胞以5×105/mL的細(xì)胞密度，注射Balb/c小鼠制備腹水，腹水的純化按辛酸-硫酸銨法進(jìn)行。

采用Western blotting對(duì)單克隆抗體特異性進(jìn)行鑒定。單克隆抗體亞型鑒定采用間接ELISA法，檢測(cè)試劑盒 (Sigma公司)，操作按使用說明進(jìn)行。

非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫法測(cè)定抗體親和力，抗原以20 μg/mL、10 μg/mL 和 5 μg/mL 三個(gè)濃度分別包被ELISA板條，純化的mAb稀釋成11種濃度：4、2、1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03、0.02、0.01、0 μg/mL，分別加入不同包被量的反應(yīng)孔中，反應(yīng)后依次加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和底物TMB顯色，測(cè)OD450。根據(jù)抗原抗體結(jié)合的S形曲線，求解不同抗原濃度下半數(shù)吸光值的抗體濃度，代入公式

計(jì)算親和常數(shù)，式中Ab和Ab′分別表示當(dāng)抗原濃度為 Ag和 Ag′時(shí)，產(chǎn)生半數(shù)吸光值的抗體濃度(mol/L)，n=Ag/Ag′。當(dāng) n=2時(shí)，可得3個(gè) Ka值，以3個(gè)Ka值的均數(shù)作為最終結(jié)果。

1.2.6 抗HAAH單克隆抗體在腫瘤細(xì)胞系中檢測(cè)HAAH的應(yīng)用

培養(yǎng)人腎腺癌細(xì)胞 ACHN、人膀胱癌細(xì)胞BIU-87、人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人喉癌細(xì)胞 Hep-2、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人卵巢癌細(xì)胞 SKOV、人正常肝細(xì)胞 L02，制備細(xì)胞爬片。以本實(shí)驗(yàn)獲得的抗HAAH單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗小鼠 IgG為二抗，并用Hoechst33258染核按常規(guī)方法進(jìn)行間接細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)HAAH的表達(dá)分布。

2 結(jié)果

2.1 HAAH基因克隆的鑒定

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物，結(jié)果獲得約750 bp的片段，與預(yù)期目的片段相符 (圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增得到的HAAH基因Fig. 1 HAAH gene isolated by PCR. M: DNA marker (HBI 1.0 kb Plus); A,B: PCR products of HAAH gene.

用Xho I與Spe I雙酶切鑒定pGEMT-HAAH，其中陽性克隆A、B、D、F切出3.1 kb和750 bp兩條片段，與預(yù)期目的片段相符 (圖 2)，表明 HAAH基因已連接到pGEMT-easy載體，并將陽性克隆A、B、D、F測(cè)序以證明其與預(yù)期序列一致。

2.2 重組原核表達(dá)載體pBV-IL1-HAAH的鑒定

用 Xho I與 Spe I雙酶切鑒定重組載體pBV-IL1-HAAH，陽性克隆切出3.6 kb和750 bp兩條片段，與預(yù)期結(jié)果相符 (圖3)，表明HAAH基因已成功連接到原核表達(dá)載體pBV-IL1。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定、可溶性分析及純化

圖2 Xho I/Spe I雙酶切鑒定pGEMT-HAAH質(zhì)粒Fig. 2 pGEMT-HAAH digested with Xho I and Spe I. M:DNA marker (HBI 1.0 kb Plus); A,B,D,F (positive clone):plasmid of GEMT-easy (3.1 kb), HAAH segment (750 bp);C,E: negative clone.

圖3 Xho I/Spe I雙酶切鑒定pBV-IL1-HAAHFig. 3 pBV-IL1-HAAH digested with Xho I and Spe I. M:DNA marker (HBI 1.0 kb Plus); A?D (positive clone): pBV-IL1(3.6 kb) HAAH segment (750 bp).

圖4 重組蛋白在HB101中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig. 4 Expression of recombinant protein His-HAAH in HB101. M: protein marker; A?D: product of the fusion protein induced in 42 °C; E: negative control induced in 30 °C; F: the blank positive control induced in 42 °C.

42 ℃誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白HAAH的誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明目的蛋白HAAH獲得了表達(dá)，電泳條帶經(jīng)灰度掃描分析顯示，表達(dá)的融合蛋白約占菌體總蛋白的25% (圖4)，而在30 ℃下誘導(dǎo)的陰性對(duì)照 (E) 并無特異表達(dá)的條帶，42 ℃誘導(dǎo)的空載體陽性對(duì)照中 (F) 在18 kDa處有一特異表達(dá)條帶，該表達(dá)帶是 pBV-IL1空載體誘導(dǎo)的 IL1蛋白[3]。Western blotting鑒定結(jié)果進(jìn)一步表明該 His-HAAH融合蛋白能與抗 His單抗發(fā)生特異反應(yīng)，并得到了預(yù)期表達(dá) (圖5)。

經(jīng)超聲裂解后的菌體分為上清和沉淀，可溶性分析表明目的蛋白主要存在于菌體裂解上清中 (圖6)。將裂解上清經(jīng) Ni2+NTA親和柱層析后，得到了純化的融合蛋白His-HAAH (圖7)。

圖5 重組蛋白的Western blotting分析結(jié)果Fig. 5 Western blotting analysis of fusion protein. M: protein marker; A: negative control; B: induction of fusion protein.

圖6 融合蛋白表達(dá)菌體裂解液的可溶性分析Fig. 6 Solubility analysis of expression fusion protein. M:protein marker; A: precipitate of induced pBVIL1-HAAH; B:supernatant of induced pBVIL1-HAAH.

圖7 融合蛋白的純化Fig. 7 Purification of fusion protein. M: protein marker; A:expression of fusion protein without purification; B: purified fusion protein.

2.4 單克隆抗體的制備

小鼠經(jīng)3次免疫后，尾靜脈采血，間接ELISA檢測(cè)其效價(jià)均超過1:104。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行PEG融合后，ELISA檢測(cè)確定陽性孔并進(jìn)行了 3次克隆化篩選得到了 H3/E10、E4/F12、G4/D8三株可穩(wěn)定分泌抗HAAH抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，取其中的 H3/E10株注射小鼠腹部制備腹水并進(jìn)行純化 (圖8)。

2.5 單克隆抗體的鑒定

2.5.1 Western blotting單抗特異性鑒定

用H3/E10單抗檢測(cè)表達(dá)的HAAH蛋白，Western blotting分析結(jié)果顯示，所制備的單克隆抗體能特異地與HAAH蛋白反應(yīng) (圖9)，而與空載體經(jīng)溫度誘導(dǎo)后產(chǎn)生的IL-1片段無特異性結(jié)合反應(yīng)。

2.5.2 單抗的亞類鑒定

Ig亞類測(cè)定：經(jīng)間接ELISA試劑盒鑒定亞類，所制備的mAb為IgG1，κ輕鏈。

2.5.3 單抗的親和力測(cè)定

以非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA對(duì)初步純化后的單克隆抗體做親和力常數(shù)的測(cè)定。單克隆抗體的親和常數(shù)為5×108，圖 10是對(duì)不同濃度包被的抗原結(jié)合的反應(yīng)曲線。

2.6 在腫瘤細(xì)胞系中檢測(cè)HAAH的初步應(yīng)用

圖8 H3/E10單克隆抗體的純化Fig. 8 Purification of monoclonal antibody H3/E10. M: protein marker; A: purified antibody.

圖9 Western blotting鑒定單抗的特異性Fig. 9 Specificity test of monoclonal antibody by Western blotting. A: purified fusion protein; B: the blank positive control.

在各種腫瘤細(xì)胞系中以本實(shí)驗(yàn)制備的單抗H3/E10為一抗進(jìn)行HAAH的間接免疫熒光分析結(jié)果如圖11所示，藍(lán)色熒光是Hoechst所激發(fā)，標(biāo)記結(jié)構(gòu)為細(xì)胞核。各種腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)域有綠色熒光，為FITC所激發(fā)，證明在各種腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)有抗原 HAAH存在，而在正常肝細(xì)胞L02中只有藍(lán)色熒光并未有特異綠色熒光，表明在正常細(xì)胞L02中未檢測(cè)到HAAH表達(dá)。

圖10 單克隆抗體對(duì)抗原的ELISA反應(yīng)曲線Fig. 10 Experimental ELISA curve for mAb with different antigen coating concentrations. (Antigen coating concentrations:20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL).

圖11 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果Fig. 11 Results of indirect cellular immuno-fluorescence. (A) ACHN. (B) BIU-87. (C) MCF-7. (D) SMMC-7721. (E) Hep-2. (F)HeLa. (G) SKOV. (H) L02 (×40).

3 討論

人們對(duì)HAAH的研究已有10多年的歷史，早在1996年，Laurent等以肝癌細(xì)胞株FOCUS的細(xì)胞提取物為免疫原制備了針對(duì)肝癌細(xì)胞系的一系列單克隆抗體，用以鑒定人肝細(xì)胞惡變時(shí)的上調(diào)表達(dá)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單克隆抗體FB-50可與其中一種膜蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，該蛋白在肝癌和膽管癌組織中高表達(dá)，并在多種變異的非正常細(xì)胞株中高表達(dá)，而在正常肝細(xì)胞和非新生上皮細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)，在正常人體組織中只在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞和腎上腺細(xì)胞高表達(dá)。后用RT-PCR法從HepG2人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系的γGT11表達(dá)文庫中分離出該蛋白的全序列 cDNA，并最終鑒定該蛋白為 HAAH。編碼基因長(zhǎng)度為2 277 bp[1]。隨后，研究發(fā)現(xiàn)受HAAH催化的含有表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域的蛋白 (如Notch及其配體) 與細(xì)胞分化有關(guān)，特別是其胞內(nèi)區(qū)與致瘤性密切相關(guān)[2]，因此HAAH與腫瘤的關(guān)系引起了科學(xué)家的關(guān)注，初期的研究結(jié)果表明HAAH可在膽管癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌中高表達(dá)[4-8]，而正常組織細(xì)胞中不表達(dá)或僅僅是彌散性弱表達(dá)。近年來研究顯示HAAH是受胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1調(diào)節(jié)的基因，Erk MAPK和AKT/PKB通路均參與對(duì)其表達(dá)的調(diào)節(jié)[9]。HAAH的作用機(jī)制目前還不完全清楚，但作為一種腫瘤相關(guān)抗原，HAAH與惡性腫瘤細(xì)胞的形成具有顯著相關(guān)性，已越來越受到關(guān)注。

本研究所利用的 pBV-IL1表達(dá)載體是在pBV220表達(dá)載體的基礎(chǔ)上改構(gòu)而得到的載體。它保留了pBV220上的抗性基因、啟動(dòng)子PRPL以及溫度誘導(dǎo)系統(tǒng)。在重組質(zhì)粒pBV220-IL1中插入Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)，不改變起始密碼子和終止密碼子前后的結(jié)構(gòu)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)HAAH在其他原核表達(dá)載體中很難獲得高效表達(dá) (數(shù)據(jù)未列出)，因此將HAAH基因克隆至pBV-IL1載體，pBV-IL1載體上的IL-1序列對(duì)融合蛋白的表達(dá)具有促進(jìn)作用，表達(dá)的蛋白雖然是有IL-1存在的融合蛋白，但是這并不影響作為抗體制備中免疫抗原的性質(zhì)[3]。胡剛等[10]在應(yīng)用pBV-L1載體表達(dá)HCV核心蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1對(duì)目的基因的表達(dá)產(chǎn)生上調(diào)的作用，融合蛋白中的IL-1并不影響目的蛋白的抗原活性；載體的改構(gòu)者宋曉國(guó)等在研究中[11]，曾對(duì) IL-1β的晶體構(gòu)象進(jìn)行分析，選擇了位于分子表面的 g環(huán)作為克隆酶切位點(diǎn)的插入部位，使得插入基因能呈現(xiàn)在IL-1的表面，這樣更有利于目的蛋白抗原位點(diǎn)的暴露，表達(dá)的抗原具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性。IL1具有免疫增強(qiáng)活性，可起到免疫佐劑的作用，有報(bào)道用細(xì)胞因子和免疫原融合表達(dá)以達(dá)到增強(qiáng)免疫的作用[12]。

所制備的單抗H3/E10在Western blotting檢測(cè)中只與表達(dá)出來的重組融合蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合反應(yīng)，而與空載體經(jīng)溫度誘導(dǎo)后產(chǎn)生的 18 kDa蛋白(IL-1片段) 無特異性結(jié)合反應(yīng)，說明制備的單抗所識(shí)別的抗原決定簇存在于HAAH上而非IL-1，所制備的抗HAAH mAb具有很好的特異性。mAb經(jīng)亞類測(cè)定，為 IgG1型，所以選擇了辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體，純化出的抗體純度高于80%，達(dá)到了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的純度要求。以間接細(xì)胞免疫熒光染色法對(duì)7株腫瘤傳代細(xì)胞作HAAH抗原檢測(cè)，結(jié)果都呈陽性，HAAH主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞膜上，這與HAAH N-末端有錨定序列，并錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)[13]。

本研究成功地構(gòu)建了高效表達(dá)HAAH的原核載體pBV-IL1-HAAH，并將純化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠，獲得了 3個(gè)穩(wěn)定的陽性單克隆細(xì)胞株，初步利用制備的單抗來介導(dǎo)間接免疫熒光檢測(cè) HAAH在各種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。獲得的抗HAAH單克隆抗體為HAAH的結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步將該抗體應(yīng)用于腫瘤的早期診斷以及研究HAAH在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移中的機(jī)理提供了重要工具。

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Ting Huyan, Dachuan Yin, Wei Wang, Kai Song, Yan Wang, Huimeng Lu, Hui Yang,and Xiaoping Xue
Faculty of Life Science, Northwestern Ploytechnical University, Xi’an 710072, China

Received: July 19, 2010; Accepted: October 12, 2010

Supported by: Research and Development Special Projects for Public Welfare Industry of State Oceanic Administration People’s Republic of China(No. 200805044), National Natural Science Foundation of China (No. 31070717).

Corresponding author: Defu Chen. Tel/Fax: +86-22-23500133; E-mail: chendefu@nankai.edu.cn

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng) (No. 200805044)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31070717) 資助。

Received: July 21, 2010; Accepted: October 28, 2010

Supported by: Doctorate Foundation of Northwestern Polytechnical University (No. CX201023), Basic Scientific Research Foundation of Northwestern Ploytechnical University (No. 003).

Corresponding author: Xiaoping Xue. Tel/Fax: +86-29-88460541; E-mail: Xiaoping@fmmu.edu.cn

西北工業(yè)大學(xué)博士論文創(chuàng)新基金 (No. CX201023)，西北工業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)科研基金 (No. 003) 資助。