蒸汽爆破玉米秸稈酶解動(dòng)力學(xué)

任省濤，程可可，宋安東，張建安

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002

2 清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084

蒸汽爆破玉米秸稈酶解動(dòng)力學(xué)

任省濤1,2，程可可2，宋安東1，張建安2

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002

2 清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084

為了掌握蒸汽爆破玉米秸稈的酶解特性，研究了不同底物濃度、酶濃度、溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響。運(yùn)用米氏方程對(duì)酶解動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行擬合，結(jié)果表明，纖維素酶對(duì)該玉米秸稈的水解反應(yīng)在反應(yīng)前3 h符合一級(jí)反應(yīng)，可用米氏方程對(duì)其進(jìn)行擬合。在轉(zhuǎn)速為120 r/min、酶濃度為1.2 FPU/mL、pH 5.0、溫度為45 ℃時(shí)米氏常數(shù)Km為11.71 g/L，最大反應(yīng)速率Vm為1.5 g/(L·h)。確立了包括底物濃度、酶濃度、溫度在內(nèi)的酶解動(dòng)力學(xué)模型，該模型適合溫度為30 ℃~50 ℃。

米氏方程，玉米秸稈，酶解，動(dòng)力學(xué)，纖維素酶

Abstract:In order to learn the enzymatic hydrolysis characteristics of steam-explosion pretreated corn straw by cellulase, the effects of substrate concentration, cellulase concentration and temperature were determined. The kinetics of the hydrolysis reaction could be described with the Michealis-Menten equation, and the hydrolysis reaction obeyed the classical first-order reaction rate in the first three hours. In the condition of 45 °C and pH 5.0 and the stirring rate 120 r/min, the Michealis constant (Km) and maximum rate (Vm) for 1.2 FPU/mL of cellulase were 11.71 g/L and 1.5 g/(L·h). The kinetic model, including the parameters such as substrate concentration, enzymatic concentration and temperature, was suit for the hydrolysis reaction under the temperature range from 30 °C?50 °C.

Keywords:Michealis-Menten equation, corn stover, enzymatic hydrolysis, kinetics, cellulase

最近幾十年內(nèi)，全球變暖日益嚴(yán)重，溫室氣體特別是 CO2氣體的排放已經(jīng)成為人類關(guān)注的焦點(diǎn)?；剂系娜紵钱a(chǎn)生溫室氣體的直接來(lái)源，已成為環(huán)境污染的主要根源[1-2]。化石燃料是不可再生資源[3]，隨著化石燃料的日益枯竭，許多國(guó)家都在積極探索新的能源以應(yīng)對(duì)能源危機(jī)。生物質(zhì)能源一直是人類賴以生存的重要資源，在整個(gè)能源系統(tǒng)中占據(jù)重要地位。我國(guó)生物質(zhì)原料非常豐富，年產(chǎn)量約11.45億噸，其中秸稈就達(dá)7億多噸，玉米秸稈占到了35%，為我國(guó)能源問(wèn)題提供了巨大的資源[4-5]。

但是由于植物本身對(duì)纖維素酶的抗逆性，直接利用纖維素酶酶解植物秸稈效率很低，一般進(jìn)行預(yù)處理。其中，蒸汽爆破以對(duì)環(huán)境無(wú)污染、能耗低被認(rèn)為是最有前景的預(yù)處理方式之一。通過(guò)蒸汽爆破預(yù)處理可使物料的結(jié)構(gòu)變得分散，從而使纖維素得到充分暴露[6-8]，繼而有利于后續(xù)的酶解和發(fā)酵。纖維素類物質(zhì)的酶解需要幾種纖維素酶的協(xié)調(diào)作用，是一個(gè)復(fù)雜的物理化學(xué)變化過(guò)程。其中包括一些物理的、動(dòng)力學(xué)的和大量的轉(zhuǎn)化參數(shù)，并且有些情況下這些參數(shù)又是可變的，從而導(dǎo)致對(duì)纖維素酶酶解纖維素類物質(zhì)的動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建相當(dāng)困難[9]。纖維素酶解動(dòng)力學(xué)已經(jīng)研究了將近50年，但是我們對(duì)于纖維素酶解動(dòng)力學(xué)的認(rèn)識(shí)仍然是不完善的，仍然不能對(duì)結(jié)果進(jìn)行很好的預(yù)測(cè)。學(xué)術(shù)界關(guān)于纖維素酶酶解纖維素有很多分歧，有人認(rèn)為酶解纖維素是一個(gè)不同纖維素酶的協(xié)調(diào)作用；有人認(rèn)為纖維素類物質(zhì)底物的結(jié)構(gòu)、中間產(chǎn)物 (纖維二糖) 和終產(chǎn)物 (葡萄糖) 對(duì)酶解有抑制[10]。Nidetzky等[11]發(fā)現(xiàn)各種纖維素酶的協(xié)調(diào)作用起很重要的作用，在纖維素被綠色木酶復(fù)合物降解過(guò)程中，各個(gè)纖維素酶的吸附慢慢增加，不存在偏好性；而 Converse和 Optekar[12]認(rèn)為纖維素外切酶更容易被吸附。Andric等[13]研究了葡萄糖在小麥秸稈酶解過(guò)程中的抑制作用，發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，特別是當(dāng)葡萄糖初始濃度達(dá)到40 g/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)在酶解的初期葡萄糖的濃度卻在下降，低于初始的 40 g/L，其認(rèn)為是由于轉(zhuǎn)糖苷的作用；同時(shí)用滲透膜對(duì)酶解過(guò)程中的葡萄糖進(jìn)行在線分離，從而使酶解速度大大提高。Kadam等[14]認(rèn)為除了產(chǎn)物如葡萄糖、纖維二糖的抑制外，底物本身的一些性質(zhì)也是影響酶解速率的一個(gè)重要原因，他的研究表明無(wú)定形纖維素的酶解速率是結(jié)晶纖維素的5~10倍，由此提出了關(guān)于底物本身特性的底物活力參數(shù)的概念，并構(gòu)建了包括產(chǎn)物葡萄糖、纖維二糖和底物活力在內(nèi)的模擬方程。Zheng等[15]用朗繆爾吸附方程模擬了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶酶解纖維素的負(fù)面影響，并構(gòu)建了適用于底物濃度范圍為 4%~12%、酶加載量為 15~50 FPU/g纖維素的酶解反應(yīng)方程。本研究采用蒸汽爆破預(yù)處理 (2.5 MP，10 min) 的玉米秸稈為底物，進(jìn)行纖維素酶酶解實(shí)驗(yàn)，研究了底物濃度、酶濃度、反應(yīng)溫度對(duì)其酶解速率的影響，運(yùn)用米氏方程并結(jié)合Arrhenius方程、范特霍夫方程模擬了包括溫度、底物濃度、酶濃度在內(nèi)的酶解動(dòng)力學(xué)模型，為酶解反應(yīng)的進(jìn)一步工藝優(yōu)化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米秸稈：取自鄭州北郊河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，干燥并粉碎40~60目的玉米秸稈進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理 (2.5 MPa，10 min)。

纖維素酶：自制的纖維素酶，酶活為100 FPU/mL。酶活測(cè)定用DNS法。

1.2 方法

汽爆預(yù)處理后的玉米秸稈樣中，除含纖維素外，還含有多種水溶性抑制物，可能抑制酶解反應(yīng)速率[16]。在研究酶解動(dòng)力學(xué)前，先對(duì)樣品進(jìn)行充分水洗，以洗脫抑制物。取水洗、干燥后的固體部分，加入所需的酶、水及緩沖液，最后定容為25 mL。用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH為5.0。測(cè)前3 h的葡萄糖濃度變化情況，每樣2個(gè)平行，取平均值。

葡萄糖的測(cè)定：高效液相色譜測(cè)定。

色譜條件：色譜柱為 Aminex HPX-87H，流動(dòng)相為0.005 mol/L硫酸，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)器為RID-10A折光示差檢測(cè)器，柱溫為65 ℃，進(jìn)樣體積為 20 μL。

葡萄糖的生成速率 (V) =生成的葡萄糖的含量/溶液體積/反應(yīng)時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響

蒸汽爆破預(yù)處理的玉米秸稈經(jīng)過(guò)水洗，取固體部分作底物，在溫度為45 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，底物濃度[S]分別為 5、10、20、30、40、50、60 g/L時(shí)進(jìn)行酶解。由葡萄糖生成速率對(duì)數(shù) (lnv) 對(duì)底物對(duì)數(shù) (ln[S]) 作圖得到圖1所示直線，表明在反應(yīng)開始 3 h內(nèi)，纖維素酶降解玉米秸稈的反應(yīng)遵循一級(jí)反應(yīng)規(guī)律。由葡萄糖生成速率V對(duì)底物濃度[S]作圖得到圖 2，可以看出初始時(shí)由于隨著底物濃度的增加，酶的利用率也增加，表現(xiàn)為葡萄糖生成速率不斷增加；當(dāng)?shù)孜镞_(dá)到一定值，酶完全與底物結(jié)合，此時(shí)葡萄糖生成速率達(dá)到最大值。此后盡管底物不斷加大，反應(yīng)速率卻不再上升而是趨于平衡。曲線符合經(jīng)典的米氏方程曲線，可以用米氏方程描述。

圖1 lnV與ln[S] 的關(guān)系圖Fig. 1 Relationship between lnV and ln[S].

圖2 反應(yīng)速率與玉米秸稈濃度的關(guān)系圖Fig. 2 Relationship between reaction velocity and corn stover concentration.

Michealis-Menten 提出酶促反應(yīng)步驟如下：

酶 (E) 與底物 (S) 結(jié)合形成中間產(chǎn)物 (ES)，中間產(chǎn)物分解成產(chǎn)物 (P)，從而酶重新游離出來(lái)。K1為 (ES) 生成的反應(yīng)速率常數(shù)，K2、K3分別代表(ES) 的分解反應(yīng)速率常數(shù)。K4為 (E)+(P) 復(fù)合生成(ES) 的反應(yīng)速率常數(shù)。在反應(yīng)初期，由于產(chǎn)物P的濃度很低，不足以引起可逆反應(yīng)，K4可以忽略，因此 (ES) 的形成速率可以寫為

開始時(shí)底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度，即[S]遠(yuǎn)大于[E]，因此被酶結(jié)合的底物[ES]可以忽略。所以[S]?[ES]≈[S]

[ES]的分解速率為

根據(jù)反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡，可知[ES]的形成速率跟分解速率相等。

得出動(dòng)態(tài)平衡時(shí)的[ES]

因?yàn)槊阜磻?yīng)速率V與[ES]成正比，所以V=K3[ES]將 (3) 代入得

運(yùn)用Lineweaver-Burk法，以1/V對(duì)1/[S]作圖，得到圖 3，用最小二乘法線性擬合，可以得到 Vm=1.50 g/(L·h)，Km=11.71 g/L。

回歸方程

方程的相關(guān)系數(shù)r=0.998，表明差異極顯著。

圖3 纖維素酶水解玉米秸稈的Lineweaver-Buck圖Fig. 3 Lineweaver-Buck plots for corn stover hydrolyzed with cellulose.

高培基等[17]用純纖維素粉為酶解底物，得到酶解初速度為12 g/(L·h)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈為底物所進(jìn)行的酶解初速度?？赡苁且?yàn)殡m然蒸汽爆破使秸稈中的纖維素得到了有效的分離，但是仍然有部分纖維素被半纖維素和木質(zhì)素包裹；此外不溶的木質(zhì)素和蒸汽爆破產(chǎn)生的一些抑制物也是產(chǎn)生酶解初速度偏低的原因。

Kadam等[14]認(rèn)為決定酶解初速度高低的主要原因是底物的無(wú)定形區(qū)所占的比例。

2.2 酶濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響

在溫度為45 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，底物濃度為60 g/L，反應(yīng)液酶濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 FPU/mL時(shí)進(jìn)行酶解，酶濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系如圖4所示。

圖4 反應(yīng)速率與酶濃度的關(guān)系圖Fig. 4 Relationship between reaction velocity and enzyme concentration.

從圖 4可以看出，隨著酶濃度的增加，反應(yīng)速率與酶濃度基本呈線性關(guān)系，反應(yīng)速率與酶濃度呈正比。當(dāng)酶促反應(yīng)體系的溫度、pH不變，底物充分過(guò)量的情況下，酶量越大，則生成的產(chǎn)物越多，反應(yīng)速率就越快?？梢杂妹复俜磻?yīng)機(jī)理解釋，有方程 (3) 可以寫為=K[Et]，在底物濃度極大時(shí)，[S]在反應(yīng)過(guò)程中的改變量很小，K=K3[S]/(Km+[S])可視為常數(shù)，因此反應(yīng)速率V正比于[Et]，兩者呈線性關(guān)系，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。Linda等[18]用蒸汽預(yù)處理的小麥秸稈作底物，酶的加載量分別為3、6、12、14 FPU/g小麥秸稈，發(fā)現(xiàn)隨著酶濃度的增加，反應(yīng)速率依次增加，與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致。

2.3 溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響

在底物濃度為50 g/L，轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度分別為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃時(shí)進(jìn)行酶解，反應(yīng)溫度與反應(yīng)速率見圖5。隨溫度的升高，酶解速率也隨著升高。這一現(xiàn)象與酶促反應(yīng)的規(guī)律相吻合，即在一定范圍內(nèi)，溫度升高，酶促反應(yīng)速率加快。

用lnV對(duì)1/T (×103K?1) 作圖 (T為華氏溫度，K) 如下，運(yùn)用最小二乘法線性回歸可以得到如圖6所示直線，可見，lnV在30 ~50 ℃℃范圍內(nèi)與溫度倒數(shù)呈線性關(guān)系，表明纖維素酶降解玉米秸稈反應(yīng)的反應(yīng)速率隨溫度的變化符合Arrhenius方程

圖5 反應(yīng)速率與溫度的關(guān)系圖Fig. 5 Relationship between reaction velocity and temperature.

圖6 lnV與1/T關(guān)系圖Fig. 6 Relationship between lnV and 1/T.

變?yōu)橹笖?shù)形式為：V=A×exp(?Ea/RT)

通過(guò)線性回歸方程求得Ea=38.56 kJ/mol，指前因子 A=14.42 g/(L·h)。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)r2=0.982，表明 Arrhenius方程對(duì)本研究數(shù)據(jù)的擬合是極顯著的。余洪波等[19]以白腐菌生物-堿氧化預(yù)處理的玉米秸稈作底物，運(yùn)用響應(yīng)面分析了包括溫度、pH、轉(zhuǎn)速在內(nèi)的纖維素酶解反應(yīng)。結(jié)果表明溫度在49 ℃，pH為4.8，轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)酶解反應(yīng)結(jié)果最好。Oh等[20]研究了酶解溫度為30 ℃~50 ℃的酶解情況，結(jié)果顯示隨著溫度的升高，酶解初速率也依次增高，得到活化能為43.6483 kJ/mol，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之接近。

平衡常數(shù)Ks與溫度T的關(guān)系，服從范特柯夫方程

酶促反應(yīng)K3>>K2，Ks≈Km，以不同溫度梯度下測(cè)定的米氏常數(shù)Km回歸求得焓度H?=14.424 kJ/mol，頻率因子 C=2.498×103。統(tǒng)計(jì)相關(guān)性 r=0.975。由此確立纖維素酶水解蒸汽預(yù)處理玉米秸稈的酶解動(dòng)力學(xué)模型方程為：

3 結(jié)論

纖維素酶酶解蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈的前3 h，反應(yīng)遵循一級(jí)反應(yīng)規(guī)律，可以用米氏方程進(jìn)行模擬。用雙倒數(shù)法和最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到米氏常數(shù)Km為11.71 g/L，最大反應(yīng)速率Vm為1.5 g/(L·h)。

附錄

[Et]：總的酶量

[ES]：酶與底物所形成的中間產(chǎn)物的濃度

[Et]?[ES]：游離狀態(tài)的酶的濃度

[S]：底物濃度

B：積分常數(shù)

R：氣體常數(shù)，J/(mol×K)

Ea：活化能，kJ/mol

A：指前因子，g/(L·h)

Ks：平衡常數(shù)

? H ：焓度，kJ/mol

C：頻率因子

REFERENCES

[1] Ni WD, Jin H, Li Z, et al. DME economy: the key to the problems of energy and environment of China. Coal Chem Ind, 2003, 31(4): 3?9.

倪維斗, 靳暉, 李政, 等. 二甲醚經(jīng)濟(jì): 解決中國(guó)能源與環(huán)境問(wèn)題的重大關(guān)鍵. 煤化工, 2003, 31(4): 3?9.

[2] Liu M. Chinese energy utilization and environmental protection on the current situation. Shanxi Energy Conservation, 2002(3): 17?18.

劉明. 關(guān)于我國(guó)能源利用與環(huán)境保護(hù)的現(xiàn)狀分析. 山西能源與節(jié)能, 2002(3): 17?18.

[3] Liu ZX, Liu ZQ, Huang WH. The key countermeasures of controlling fossil fuel environment pollution in China.Resour Ind, 2005, 7(5): 49?52.

劉志遜, 劉珍奇, 黃文輝. 中國(guó)化石燃料環(huán)境污染治理重點(diǎn)及措施. 資源·產(chǎn)業(yè), 2005, 7(5): 49?52.

[4] Zhang XY, Lei ZT. Overview of biomass energy in China.J Chem Ind Forest Products, 1997, 31(4): 20?22.張雪元, 雷振天. 中國(guó)生物質(zhì)能源概況. 林產(chǎn)化工通訊,1997, 31(4): 20?22.

[5] Chen HZ, Li ZH. Ligncellulosical microorganisms and biomass total utilization. Biotechnology Bull, 2002, (2):25?29, 34.

陳洪章, 李佐虎. 纖維素原料微生物與生物量全利用.生物技術(shù)通報(bào), 2002, (2): 25?29, 34.

[6] Kumar S, Gupta R, Lee YY, et al. Cellulose pretreatment in subcritical water: effect of temperature on molecular structure and enzymatic reactivity. Bioresour Technol,2010, 101(4): 1337?1347.

[7] Wang K, Jiang JX, Xu F, et al. Influence of steaming pressure on steam explosion pretreatment of Lespedeza stalks (Lespedeza crytobotrya): part 1. Characteristics of degraded cellulose. Polym Degrad Stab, 2009, 94(9):1379?1388.

[8] Kuo CH, Lee CK. Enhancement of enzymatic saccharification of cellulose by cellulose dissolution pretreatments. Carbohydr Polym, 2009, 77(1): 41?46.

[9] Gan Q, Allen SJ, Taylor G. Kinetic dynamics in heterogeneous enzymatic hydrolysis of cellulose: an overview, an experimental study and mathematical modelling. Process Biochem, 2003, 38(7): 1003?1018.

[10] Zhou XG, Qi FM, Wheeler MM, et al. Inhibition of termite cullulases by carbohydrate-based cellulase inhibitors:evidence from in vitro biochemistry and in vivo feeding studies. Pestic Biochem Physiol, 2008, 90(1): 31?41.

[11] Nidetzky B, Steiner W, Hayn M, et al. Cellulose hydrolysis by the cellulases from Trichoderma reesei: a new model for synergistic interaction. Biochem J, 1994,298(3): 705?710.

[12] Converse AO, Optekar JD. A synergistic kinetics model for enzymatic cellulose hydrolysis compared to degree-of-synergism experimental results. Biotechnol Bioeng, 1993, 42(1): 145?148.

[13] Andric P, Meyer AS, Jensen PA, et al. Effect and modeling of glucose inhibition and in situ glucose removal during enzymatic hydrolysis of pretreated wheat straw. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 160(1): 280?297.

[14] Kadam KL, Rydholm EC, McMillan JD. Development and validation of a kinetic model for enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass. Biotechnol Prog, 2004, 20(3): 698?705.

[15] Zheng Y, Pan ZL, Zhang RH, et al. Kinetic modeling for enzymatic hydrolysis of pretreated creeping wild ryegrass.Biotechnol Bioeng, 2009, 102(6): 1558?1569.

[16] Palmqvist E, Hahn-H?gerdal B, Galbe M, et al. The effect of water-soluble inhibitors from steam-pretreated willow on enzymatic hydrolysis and ethanol fermentation.Enzyme Microb Technol, 1996, 19(6): 470?476.

[17] Gao PJ, Qu YB, Wang ZN. Analysis and estimation of cellulose hydrolysis. Chin J Biotech, 1988, 4(4): 321?326.高培基, 曲音波, 王祖農(nóng). 纖維素酶解過(guò)程的分析和測(cè)定. 生物工程學(xué)報(bào), 1988, 4(4): 321?326.

[18] Linda M, Jakobsson EL, Galbe M, et al. Steam pretreatment of dilute H2SO4-impregnated wheat straw and SSF with low yeast and enzyme loadings for bioethanol production. Biomass Bioenergy, 2008, 32(4):326?332.

[19] Yu HB, Zhang XY, Ke J, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of corn straw after biological-alkaline/oxidative pretreatment. Transact Chin Soc Agri Eng, 2009, 25(4):201?205.

余洪波, 張曉昱, 柯靜, 等. 生物-堿氧化預(yù)處理玉米秸稈酶解條件的優(yōu)化. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2009, 25(4):201?205.

[20] Oh KK, Kim TY, Jeong YS, et al. Bioconversion of cellulose to ethanol by the temperature optimized simultaneous saccharification and fermentation.Renewable Energy, 1996, 9(1/4): 962?965.

Kinetics of enzymatic hydrolysis of steam-explosion pretreated corn straw

Shengtao Ren1,2, Keke Cheng2, Andong Song1, and Jian’an Zhang2
1 College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
2 Institute of Nuclear and New Energy Technology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Received: June 28, 2010; Accepted: October 20, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA100702-3), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB707406).

Corresponding author: Jian’an Zhang. Tel/Fax: +86-10-89796086; E-mail: zhangja@tsinghua.edu.cn

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2007AA100702)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB707406) 資助。