DNA穩(wěn)定同位素探針技術(shù)在宏基因組學(xué)中的應(yīng)用及前景

劉威，魏曉，袁靜，黃留玉

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，北京 100071

DNA穩(wěn)定同位素探針技術(shù)在宏基因組學(xué)中的應(yīng)用及前景

劉威，魏曉，袁靜，黃留玉

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，北京 100071

DNA穩(wěn)定同位素探針 (DNA-SIP) 是一種新興的技術(shù)，通過將同位素穩(wěn)定結(jié)合到特定的底物來確定環(huán)境中微生物的作用。DNA-SIP與宏基因組學(xué)結(jié)合可以讓某些微生物的特性與其特殊新陳代謝聯(lián)系在一起，不僅可以從宏基因組庫里檢測到低含量的微生物，而且加速了對新的酶類和其他生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。以下總結(jié)了 SIP-宏基因組學(xué)技術(shù)的原理、應(yīng)用及研究進(jìn)展，并討論了其在環(huán)境微生物學(xué)和生物技術(shù)的應(yīng)用前景。

宏基因組學(xué)，同位素探針，微生態(tài)，DNA-SIP

Abstract:DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a recently developed method with which the incorporation of stable isotope from a labeled substrate is used to identify the function of microorganisms in the environment. The technique has now been used in conjunction with metagenomics to establish links between microbial identity and particular metabolic functions. The combination of DNA-SIP and metagenomics not only permits the detection of rare low-abundance species from metagenomic libraries but also facilitates the detection of novel enzymes and bioactive compounds. We summarize recent progress in SIP-metagenomic techniques and applications and discuss prospects for this combined approach in environmental microbiology and biotechnology.

Keywords:metagenomics, stable-isotope probing, microecosystem, DNA-SIP

基因序列的研究大致經(jīng)歷了3個過程，早期主要關(guān)注對16S rRNA基因的分析[1]，后來開始關(guān)注長 DNA片段和整個群落基因序列的分析，隨著高通量基因測序技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在則以宏基因組作為分析研究的對象[2]。宏基因組學(xué)的研究方法目前已經(jīng)應(yīng)用到各種各樣的生態(tài)環(huán)境中，從人類腸道微生物到土壤微生物[3-5]，從深海微生物到室內(nèi)空氣微生物[6-7]。傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)直接研究從環(huán)境樣品中提取的 DNA，但最近發(fā)展起來的 DNA-SIP技術(shù)則像一個濾器一樣可以篩選感興趣的微生物DNA[8-9]。DNA-SIP最早用來研究環(huán)境中微生物新陳代謝作用，通過小規(guī)模的原位孵育把穩(wěn)定同位素標(biāo)記的化合物 (例如13C，15N) 結(jié)合到環(huán)境樣品中的微生物DNA上[10]，再通過等密度超速離心技術(shù)分離標(biāo)記的重 DNA，這樣可以輕易獲得目的基因，避免了從浩瀚基因庫里一個個篩選目的基因的煩勞工作。目前宏基因組學(xué)結(jié)合 DNA-SIP技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)從概念變成了現(xiàn)實，并引起了眾多科學(xué)家的廣泛關(guān)注。

1 宏基因組學(xué)

宏基因組是由 Handelsman等[11]1998年首先提出，指的是環(huán)境樣品中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組學(xué)就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。從環(huán)境樣品中直接提取基因組 DNA，一方面可以通過克隆 DNA片段到合適的載體 (質(zhì)粒、粘粒等) 而建立宏基因組庫，也可以直接對 DNA進(jìn)行高通量測序[12]。宏基因組文庫既包含了可以培養(yǎng)的微生物基因，又包含了不能培養(yǎng)的微生物基因，避開了微生物分離培養(yǎng)的問題，極大地擴(kuò)展了微生物資源的利用空間，增加了獲得新的微生物物種和生物活性物質(zhì)的機(jī)會，為新的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和新的生物技術(shù)提供豐富的基因文庫，并有利于環(huán)境微生物有機(jī)群體的分布和功能的研究。

Tyson等首次應(yīng)用宏基因組學(xué)的技術(shù)研究微生態(tài)[13]，他們用于一個不太復(fù)雜的環(huán)境——以美國鐵山酸性礦山排水系統(tǒng)作為模型，采用宏基因組測序的方法對細(xì)菌進(jìn)行了 16S rRNA基因克隆分析，發(fā)現(xiàn)在排水系統(tǒng)中主要存在兩類細(xì)菌；他們隨即用了鳥槍法測序技術(shù)，從100 Mb DNA序列信息里，重建了這兩種優(yōu)勢微生物的完整基因組，同時也部分重建了其他 3種非優(yōu)勢微生物的基因組，把這個相對簡單的生態(tài)系統(tǒng)的新陳代謝途徑整合到一起，闡明了細(xì)菌在環(huán)境中所扮演的角色。此后，科學(xué)家們開展了大批關(guān)于群落微生物鳥槍法測序的工作，這些技術(shù)為探索非培養(yǎng)的環(huán)境微生物潛在新陳代謝途徑提供了豐富的信息[3,14-17]。此外，宏基因組學(xué)的應(yīng)用可以發(fā)現(xiàn)和描述新的生物催化劑及制藥中的重要化合物[18-19]。許多中小型公司 (例如 Diversa) 已經(jīng)將一些以宏基因組學(xué)為手段發(fā)現(xiàn)的生物活性化合物以及感受態(tài)建立的方法、克隆的策略以及高通量的篩選方法申請了專利。

然而對于復(fù)雜的環(huán)境樣品，則要求很高的宏基因組DNA片段整合能力，傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)方法往往難以解決這個問題。如在研究馬尾藻海洋生物多樣性時，Venter等[20]發(fā)現(xiàn)只能從最優(yōu)勢的菌種中富集濃度較高的染色體組DNA，并且大部分通過鳥槍法獲得的序列不能確定具體的微生物，也就是說在預(yù)測群落低豐度成員方面很有限，因此為了獲得對低豐度群落成員的了解，需要開展強(qiáng)度更大的測序。此外，稀有生物微生態(tài)在特定功能上具有非凡意義(例如海洋里的一種細(xì)菌能以甲基為營養(yǎng)物質(zhì)，但其本身含量很低)，用傳統(tǒng)宏基因組學(xué)方法都無法進(jìn)行捕獲[21]，這就需要新的技術(shù)來解決這個問題。

2 DNA-SIP的技術(shù)原理

DNS-SIP是研究環(huán)境生物特性與特定功能之間的聯(lián)系且不需分離培養(yǎng)的方法之一[22]。相對于RNA-SIP和PLFA-SIP[23-24]，它的敏感性較低，但是仍然可以獲得感興趣微生物的 DNA。在進(jìn)行DNA-SIP實驗之前，需要準(zhǔn)備3臺儀器：一是可以測定培養(yǎng)基利用活性的儀器；二是可以進(jìn)行等密度離心的超速離心機(jī)；三是一臺分析天平。接著要準(zhǔn)備的是特殊培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基里含有穩(wěn)定同位素12C或14N標(biāo)記的某種營養(yǎng)物質(zhì)，可以從公司購買得到。在進(jìn)行 SIP孵育之前需要測定目標(biāo)培養(yǎng)基對同位素的利用活性，實驗發(fā)現(xiàn)在同位素標(biāo)記DNA孵育的時候，對每克土壤或沉淀物來說50 μmol13C，對每克水溶液來說5 μmol13C是比較合適的。然后把樣品放在含有12C或14N培養(yǎng)基里進(jìn)行SIP孵育，微生物通過攝取培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)而將同位素標(biāo)記在其DNA上，事實上，樣品中很難完全避免不同微生物消耗同一營養(yǎng)物質(zhì)的問題，在 SIP孵育時應(yīng)盡可能滿足目標(biāo)微生物得到足夠的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的營養(yǎng)物質(zhì)。在一些情況下，可以通過營養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑來追蹤碳的流量，進(jìn)而解決穩(wěn)定同位素標(biāo)記時不同微生物消耗同一營養(yǎng)物質(zhì)的問題。接著通過等密度超速離心的方法可以把穩(wěn)定同位素標(biāo)記的DNA(也就是重DNA) 從未標(biāo)記的DNA中分離出來，如果需要長的重DNA片段，就盡量避免采用可能破壞DNA片段完整性的方法；如果樣品中存在高濃度腐質(zhì)，就需要在等密度離心前純化 DNA。分離出來的重DNA就可以進(jìn)行測序及代謝途徑的重建，或者建立宏基因組庫以及進(jìn)行以序列和功能為基礎(chǔ)的染色。

等密度離心后確定重DNA的方法有6種，應(yīng)用的方法越多，數(shù)據(jù)也就越詳實。這些方法是：1) 最直接的方法就是用同位素比率質(zhì)量光譜法 (IRMS)檢測DNA標(biāo)記的程度 (就是13C含量)，該方法需要 IRMS設(shè)備和大量的 DNA樣本。2) 溴化乙啶(EtBr) 染色法。早期的 SIP-DNA實驗就是用 EtBr將重DNA和輕DNA染色，直接從熒光顯微鏡下觀察。目前為了增加靈敏度，大都采用 SYBR safeTM來進(jìn)行重DNA和輕DNA染色[25]。3) 指紋分析法。指紋分析 (例如變性梯度凝膠電泳，末端限定的片段呈多態(tài)性) 可以對比不同片段的圖像分辨重DNA片段。一旦重DNA被確定，就可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法沉淀，然后作進(jìn)一步分析。4) 測定每一碎片的密度。在等密度離心和分餾法后可以測定每一碎片的密度。根據(jù)重DNA的理論密度，或者用高純度克隆的12C-DNA和13C-DNA混合物控制等密度離心。5) 使用DNA載體。13C載體DNA (例如酵母菌和古生菌的13C-DNA) 也可以用來確定重 DNA[26]。6) 通過半定量 PCR來確定目標(biāo)基因的數(shù)量。DNA的每個片段沉淀下來，可以通過實時PCR確定目標(biāo)基因的數(shù)量 (例如16S rRNA基因)[27]。往往在低密度時出現(xiàn)一個較大的峰，表明大部分未標(biāo)記背景DNA的位置，形成的第二個峰 (往往是在主要峰旁邊出現(xiàn)一個小小的角) 是被標(biāo)記的重DNA。

開展整個 SIP實驗詳細(xì)的方法和步驟請參閱資料[21-28,32-33,36-37]。

3 DNA-SIP宏基因組學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展

以鳥槍法測序為基礎(chǔ)的宏基因組學(xué)無法確定微生物的多樣性，因為它不能完全說明復(fù)雜的群落。Schloss和Handelsman認(rèn)為DNA-SIP與宏基因組學(xué)上的結(jié)合應(yīng)用可以減少樣品的復(fù)雜性[28]，因為 SIP可以作為一個濾器富集攜帶特殊功能的 DNA。Dumont等第一次提出來 DNA-SIP與宏基因組學(xué)結(jié)合的概念，他們采用這種方法對森林土壤嗜甲烷細(xì)菌進(jìn)行了研究[8]，用13CH4標(biāo)記森林土壤的樣本并獲得重 DNA，還建立了其中一個細(xì)菌的人工染色體組 (BAC) 庫。通過對2 300個克隆 (平均大小為25 kb) 篩選后，找到了一個含 pmoCAB操縱子的BAC克隆，它編碼甲烷單加氧酶的3個亞基，這是分解甲烷通路上的一個重要的酶。通過對非 SIP的研究[8]可以看出DNA-SIP的優(yōu)勢非常明顯，在非SIP的實驗中要找到一個pmoCAB操縱子需要250 000個福斯質(zhì)粒克隆 (平均大小40 kb)。

DNA-SIP在孵育的時候需要高濃度的13C復(fù)合物，這樣才能保證在孵育一定時間后同位素能穩(wěn)定結(jié)合到DNA上，但培養(yǎng)基中同位素標(biāo)記的營養(yǎng)物質(zhì)濃度過高或過低會抑制有些生物的生長，而且由于共生同位素的標(biāo)記物可能被一個微生物吸收后又被另一個吸收[8-29]。2008年，Neufeld等通過對海洋中嗜甲醇微生物的研究確定了合適的標(biāo)記培養(yǎng)基的濃度[21]，用1 μmol/L13C標(biāo)記甲醇，嗜甲醇菌相關(guān)的微生物便可以在海洋水里消化甲醇，但在DNA-SIP試驗中只發(fā)現(xiàn)了毫微克的重DNA，所以需要多重置換擴(kuò)增獲得足夠DNA的量以便建立福斯質(zhì)粒文庫；通過PCR篩選福斯質(zhì)粒文庫，在宏基因組庫里發(fā)現(xiàn)了一個新的甲醇脫氫酶簇，很明顯這來自于一個細(xì)菌，而且和嗜甲醇菌Methylophaga相關(guān)，這也就表明這些細(xì)菌在海洋環(huán)境里具有消化甲醇的能力。環(huán)境微生物學(xué)家最近開始用MDA (Multiple displacement amplification) 方法[30]，2008年，Chen等發(fā)現(xiàn)可以在建立福斯質(zhì)粒文庫之前通過用一系列酶來處理MDA產(chǎn)生 DNA[31]，這樣就不會影響 MDA產(chǎn)生的DNA的大小。以上兩項研究表明，可以在盡量接近原始條件培養(yǎng)基的情況下，把DNA-SIP和宏基因組學(xué)結(jié)合到一起來全面地研究低豐度成員的功能。美國能源部聯(lián)合基因組研究所利用其高通量快速測序的優(yōu)勢做了一個很好的試驗，Kalyuzhnaya等著重研究了華盛頓湖淤泥的碳循環(huán)[32]，他們用13C1復(fù)合物進(jìn)行了DNA-SIP試驗，隨后利用純化的重DNA建立了宏基因組庫，通過回收的13C-DNA宏基因組庫序列幾乎重建了嗜甲基菌 Methylotenera mobilis的完整染色體組，這個細(xì)菌無疑在華盛頓湖底的C1循環(huán)中扮演著重要的角色[33]?？傊?，全基因組鳥槍測序的宏基因組學(xué)方法可以用來重建低豐度微生物的基因組和新陳代謝通路，但前提是需要應(yīng)用DNA-SIP技術(shù)。

目前，有許多實驗正在用傳統(tǒng)以功能為基礎(chǔ)的宏基因組學(xué)，致力于改進(jìn)基因探測的重復(fù)性問題，以提高在提取 DNA之前富集培養(yǎng)含需要功能的微生物數(shù)量[34-35]，然而這也不可避免地破壞了微生物菌群的多樣性，因為快速生長的微生物可以抑制其他的生物種群。1999年，Urbach等和Borneman運用5-Bromo-2-deoxyuridine (BrdU) 從生物體中富集目標(biāo) DNA[36-37]，通過刺激的方法 (比如培養(yǎng)基) 使BrdU在代謝過程中結(jié)合到剛合成的DNA中，然后再用抗BrdU的抗體來分離BrdU標(biāo)記的DNA，該方法的缺點是在尋找功能相關(guān)的微生物時，同樣的刺激有些微生物并沒有把 BrdU合成到其 DNA中[36]。從一個宏基因組庫里通過功能篩選有意義的克隆的概率是非常低的 (往往是1.14 Gbp里有1個)[34]，因此，Schwarz等用以下兩種方法從環(huán)境樣本中發(fā)現(xiàn)丙三醇的脫水酶類，并做了比較，另一種是富集培養(yǎng) (40 mmol/L12C-丙三醇) 獲得的DNA，一種是通過同位素標(biāo)記 (40 mmol/L13C3-丙三醇) 試驗獲得的重DNA，分別來建立宏基因組庫，結(jié)果表明后者基因檢測的成功率是前者的2~3倍。最近也發(fā)表了另一個很相似的研究[38]，從污染的河底獲得樣品，然后用13C標(biāo)記聯(lián)苯，再收集重DNA，得到了聯(lián)苯雙加氧酶序列，與已發(fā)現(xiàn)的聯(lián)苯雙加氧酶序列是不一樣的，表明這個酶有獨特之處。這些研究都表明 SIP參與的宏基因組學(xué)在發(fā)現(xiàn)工業(yè)相關(guān)的生物催化劑方面有極大的潛力。

表1 傳統(tǒng)宏基因組學(xué)與DNA-SIP宏基因組學(xué)的比較Table 1 Comparison of conventional metagenomics and DNA-SIP-enabled metagenomics

4 展望

到目前為止，DNA-SIP與宏基因組學(xué)結(jié)合的研究報道還很少，但從這些研究可以明顯地看出它比傳統(tǒng)宏基因組學(xué)具有更大的優(yōu)勢，通過運用DNA-SIP可以提高新酶類發(fā)現(xiàn)的概率，也可以減少鳥槍測序法很難解決種群復(fù)雜的問題。傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)需要做大量的序列分析，而這些分析大多數(shù)都是無意義的[39]，雖然新一代測序技術(shù)大大降低了DNA測序的費用，但對于做宏基因組序列分析來說仍然是一個高成本的方法，同時還需要熟練的生物信息學(xué)技術(shù)。目前宏基因組學(xué)研究僅僅是從微生物的DNA序列來猜測微生物的代謝過程，必須進(jìn)行進(jìn)一步的實驗確認(rèn)。

將DNA-SIP與宏基因組學(xué)結(jié)合技術(shù)可以幫助我們在種群水平解決目標(biāo)微生物的功能，這一技術(shù)發(fā)展非常迅速，其中包括在宏基因組學(xué)上應(yīng)用細(xì)胞分選和微流體技術(shù)，在單細(xì)胞染色體組方面應(yīng)用激光拉曼光譜顯微鏡技術(shù)[40]，在熒光原位雜交上應(yīng)用等離子聚焦光譜測定技術(shù)[41]以及放射自顯影技術(shù)[42]。從宏基因組序列上來推斷功能所遇到的另一個問題是，大多數(shù)公開的數(shù)據(jù)庫中缺少明確的功能分類。一項研究原核生物蛋白多樣性的報告指出30%~60%的蛋白都不能和已知的數(shù)據(jù)庫相匹配[12]，即便是現(xiàn)在最好的研究模型大腸桿菌，其50%基因的功能還是需要試驗來確定的[43]。目前無論是宏基因組還是單個染色體組的功能分類主要是以相同的 Blast為基礎(chǔ)的，這要求目前的數(shù)據(jù)庫要有很高的質(zhì)量和完整性。一方面序列很相似的基因并不一定產(chǎn)生相同的生物學(xué)效應(yīng)，另一方面功能上的冗余暗示著一個特定的功能可能由若干個不相同的蛋白共同完成[44]。因此在目前宏基因組學(xué)功能分類上以及重建和預(yù)測代謝通路時可能存在很大的不精確或錯誤。

DNA-SIP在宏基因組學(xué)上潛在的應(yīng)用，在不久的將來會給我們帶來很大的提高，尤其是可以解決工業(yè)上對新酶類的迫切需求，并可顯著地改進(jìn)基因探測成功率，也大大降低了尋找新酶類的花費。但是這項技術(shù)在廣泛運用之前還需要解決一系列的問題，如建立一個具高生產(chǎn)能力的生產(chǎn)線進(jìn)行分析多重DNA-SIP孵育和13C-DNA分離。生物工業(yè)用高產(chǎn)出的方法來篩選多個樣品，在 SIP宏基因組學(xué)上應(yīng)用將能更好地理解我們看不到的大多數(shù)微生物，發(fā)現(xiàn)大量新酶類。

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西西和很多女人不一樣，她三十七八歲，微微發(fā)胖，卻又不是令人厭惡的潘美麗的那種肥，而是那種睡上去像棉花一樣柔軟的胖，特別是彎下腰在口袋里取鹽或白糖時，那圓溜溜的屁股直直地對著甲洛洛，讓他那閑置多年的小兄弟蘇醒過來，抖擻起來。但甲洛洛心里很清楚，這女人不簡單，雖然是個寡婦，也上了年紀(jì)，可像個修女一樣遠(yuǎn)離著男人，哪怕一個帶點小色情的玩笑，她都會撕下臉面，怒目相向。而她的這種堅守，讓很多男人們更加想入非非。

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Applications and perspectives of DNA stable-isotope probing in metagenomics: a review

Wei Liu, Xiao Wei, Jing Yuan, and Liuyu Huang
Institute of Disease Control and Prevention, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Received: August 11, 2010; Accepted: October 29, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA02Z118), National Natural Science Foundation of China (No. 30771809).

Corresponding author: Liuyu Huang. Tel: +86-10-66948301; E-mail: huangliuyuly@163.com

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2007AA02Z118)，國家自然科學(xué)基金 (No. 30771809) 資助。