菊糖及其酶解產(chǎn)物對長雙歧桿菌的促生長作用

張建平，張澤生，王金菊

(1. 天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

菊糖及其酶解產(chǎn)物對長雙歧桿菌的促生長作用

張建平1，張澤生2，王金菊2

(1. 天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

研究了長雙歧桿菌在分別以葡萄糖、菊糖和菊糖酶解所得低聚果糖為碳源的培養(yǎng)基中的生長情況，在這些培養(yǎng)基中，長雙歧桿菌最高菌體質(zhì)量濃度分別是0.30、0.37、0.41,g/L，在以菊糖和低聚果糖為碳源的培養(yǎng)基中的增殖情況要好于以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基，通過原子力顯微鏡對長雙歧桿菌的形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在分別以菊糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中其形態(tài)無明顯差別．

長雙歧桿菌；菊糖；低聚果糖

Abstract：The grow th instance of Bifitdobacterium longum at part w ith glucose，inulin，oligomerization levulose for carbon source culture medium was studied. The supreme thallus concentration in these cultures part was 0.30，0.37 and 0.41,g/L，the proliferation instance of Bifitdobacterium longum at part w ith inulin and oligomerization levulose for carbon source culture medium was better than that which was cultured in the culture which carbon source was glucose can be found through the medium of date. Through the medium of AFM versus，it was found that the shape of Bifitdobacterium longum at part with inulin and glucose for carbon source has no distinceness difference.

Keywords：Bifitdobacterium longum；inulin；oligomerization levulose

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是1899年由法國學(xué)者Tissier從母乳營養(yǎng)兒的糞便中分離出的一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌，末端常常分叉，故名雙歧桿菌，它具有維護(hù)腸道正常細(xì)菌菌群平衡、抑制病原菌的生長、防止便秘等功能[1]．但雙歧桿菌分布在胃腸的數(shù)量隨年齡階段的增長而減少[2]，所以，如何提高成人體內(nèi)的雙歧桿菌活菌數(shù)成為現(xiàn)今最受關(guān)注的課題之一．研究[3]發(fā)現(xiàn)，一些低聚果糖可以促進(jìn)雙歧桿菌的增殖．菊糖是由D–呋喃果糖分子以β–(2，1)糖苷鍵連接生成的直鏈多糖[4]．本實驗研究菊糖和菊糖酶解所得的低聚果糖對長雙歧桿菌生長和形態(tài)的影響，為找到更有效、成本更低的長雙歧因子奠定一定的理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

長雙歧桿菌(Bifitdobacterium longum)，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心．

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：大豆蛋白胨0.5,g，胰蛋白胨0.5,g，酵母糖1.0,g，葡萄糖1.0,g，無機鹽溶液4,m L，蒸餾水100,m L，半胱氨酸鹽酸鹽0.05,g(培養(yǎng)基煮沸后加入)，pH,7.0．此培養(yǎng)基在接種前煮沸驅(qū)氧后接種，于厭氧環(huán)境下培養(yǎng)．無機鹽溶液：CaCl2(無水)0.2,g，MgSO4·7H2O,0.48,g，K2HPO4,1.0,g，KH2PO4,1.0,g，NaHCO3,10.0,g，NaCl,2.0,g．混合CaCl2和MgSO4在300,m L蒸餾水中直至溶解，加500,m L蒸餾水，邊攪拌邊緩慢加入其他鹽類至全部溶解，加200,m L蒸餾水混勻，4,℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

菌體增殖培養(yǎng)基：將葡萄糖碳源替換為實驗用碳源適量．

上述各培養(yǎng)基均經(jīng)121,℃滅菌30,m in 后使用．

1.2 方法

1.2.1 菊糖低聚果糖的制備[5]

按本實驗室建立的方法制備，相對分子質(zhì)量為509，聚合度為2～3．

1.2.2 長雙歧桿菌菌體活化和增殖培養(yǎng)

在100,m L三角瓶中裝入50,m L活化培養(yǎng)基，121,℃滅菌30,m in后趁熱塞緊橡皮塞．采用萃裂法開啟安瓿管，利用無菌吸管吸取5.0,m L培養(yǎng)基至安瓿管，充分洗滌凍干菌粉至三角瓶，然后塞緊橡皮塞，恒溫37,℃，定時搖晃小三角瓶，厭氧培養(yǎng)36,h得長雙歧桿菌菌種母液．

在10,m L的具塞螺紋試管中加入9,m L 菌體增殖培養(yǎng)基，121,℃滅菌30,m in 后趁熱旋緊試管塞．接入菌種母液1.0,m L(接種量10%)．恒溫37,℃厭氧培養(yǎng)，定時搖晃培養(yǎng)試管．

長雙歧桿菌是厭氧菌，需厭氧培養(yǎng)．厭氧缸法是一種簡便實用的厭氧培養(yǎng)方法，適用于小規(guī)模厭氧菌培養(yǎng)．厭氧缸是普通的干燥缸，把接種好的長雙歧桿菌液體培養(yǎng)基試管放入?yún)捬醺變?nèi)，然后在缸內(nèi)點燃一支蠟燭，蓋好缸蓋，用凡士林封口，蠟燭熄滅后，缸內(nèi)就形成了厭氧環(huán)境．

1.2.3 長雙歧桿菌菌體濃度的測定

采用干質(zhì)量法和比濁法相結(jié)合的方法[6–7]：在620,nm下測定長雙歧桿菌菌種懸濁液吸光度，再根據(jù)吸光度與菌體濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得菌體濃度(測菌體吸光度前，需洗滌菌體培養(yǎng)液數(shù)次，以除去培養(yǎng)液本身顏色)．

1.2.4 長雙歧桿菌生長曲線測定

實驗中分別以菊糖、菊糖酶解所得低聚果糖代替活化培養(yǎng)基中的葡萄糖(加入量為1%)，初始pH 7.0，接種量10%，37,℃培養(yǎng)30,h，每隔6,h測定1次長雙歧桿菌菌體濃度，繪制其生長曲線．

1.2.5 長雙歧桿菌代謝產(chǎn)物分析

用酸度計測定代謝產(chǎn)物pH，采用苯酚硫酸法測定總糖濃度．

1.2.6 不同濃度的葡萄糖、菊糖及菊糖酶解低聚果糖1.2.6 對長雙歧桿菌生長的影響

在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，加入葡萄糖的量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，在以菊糖為碳源的培養(yǎng)基中，加入菊糖的量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，在以菊糖酶解低聚果糖為碳源的培養(yǎng)基中，加入菊糖酶解低聚果糖的量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，測定在這些培養(yǎng)基中長雙歧桿菌的生長情況．

1.2.7 長雙歧桿菌形態(tài)觀察

采用JSPM-5200型原子力顯微鏡(日本JEOL)觀察長雙歧桿菌形態(tài)．制片前將長雙歧桿菌用清水多次洗滌，離心，除去培養(yǎng)基，用蒸餾水稀釋到適合倍數(shù)，用毛細(xì)管滴在干凈的蓋玻片上，常溫常壓下晾干，備用．原子力掃描采用輕敲模式．

2 結(jié)果與討論

2.1 長雙歧桿菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

在波長620,nm處測得長雙歧桿菌培養(yǎng)液的吸光度與菌體質(zhì)量濃度之間相關(guān)曲線如圖1所示，回歸方程為y＝4.158x＋0.082 3，R2＝0.989 6．

圖1 長雙歧桿菌菌體質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of concentration of Bifitdobacterium Fig.1 longum

2.2 菊糖及其酶解產(chǎn)物對長雙歧桿菌增殖影響的比較

2.2.1 對菌體質(zhì)量濃度的影響

長雙歧桿菌生長曲線如圖2所示．從圖中可以看出：在以低聚果糖作為碳源的培養(yǎng)基中，長雙歧桿菌生長最快，最先達(dá)到生長對數(shù)期，在12,h時菌體質(zhì)量濃度達(dá)到最高，為0.41,g/L，是初始菌體質(zhì)量濃度的4.5倍；在以菊糖為碳源的培養(yǎng)基中，18,h時達(dá)到頂峰，菌體質(zhì)量濃度為0.37,g/L，是初始菌體質(zhì)量濃度的4.1倍，之后出現(xiàn)緩慢下降；在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，長雙歧桿菌生長最慢，菌體質(zhì)量濃度也低，在24,h時為0.30,g/L，是初始菌體質(zhì)量濃度的3.3倍．由此可見，菊糖和低聚果糖對長雙歧桿菌的增殖有促進(jìn)作用，其中低聚果糖的促進(jìn)效果更為明顯．

圖2 長雙歧桿菌生長曲線Fig.2 Grow th curve of Bifitdobacterium longum

2.2.2 發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH的變化

發(fā)酵液pH的變化如圖3所示．從圖3可以看出：各培養(yǎng)基的pH都是在0～6,h下降最快，6,h后下降速度趨于緩慢．經(jīng)過6,h培養(yǎng)，以低聚果糖作為碳源的培養(yǎng)基的pH由初始的7.0下降到5.5；以菊糖為碳源的培養(yǎng)基pH由初始的7.0下降到5.8；以葡萄糖為碳源的最慢，pH由初始的7.0下降到6.0．pH下降的這種現(xiàn)象是完全符合長雙歧桿菌的生理特性的，即它們在生長過程代謝產(chǎn)生大量的醋酸、乳酸或B族維生素等代謝產(chǎn)物[8]，使培養(yǎng)基pH降低．

圖3 長雙歧桿菌培養(yǎng)基pH變化Tab.3 Change of pH in culture medium

2.2.3 發(fā)酵液中糖含量的變化

2.3 葡萄糖、菊糖及菊糖酶解低聚果糖濃度對長雙歧桿菌生長的影響

長雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基中不同濃度的葡萄糖、菊糖和菊糖酶解低聚果糖對長雙歧桿菌增殖的影響如圖5—圖7所示．

圖4 長雙歧桿菌培養(yǎng)基總糖含量變化Fig.4 Change of concentration of deoxidization suger in culture medium

圖5 不同濃度葡萄糖、菊糖和低聚果糖對長雙歧桿菌增殖的影響Fig.5 Effect of different concentration of glucose，inulin and oligomerization levulose on Bifitdobacterium longum proliferation

發(fā)酵液中總糖含量的變化如圖4所示．從圖中可以看出：培養(yǎng)30,h后，低聚果糖的消耗量最多，由最初的9.20,mg/m L下降到4.18,mg/m L，消耗率為52.9%；其次為菊糖，由9.20,mg/m L下降到4.70,mg/m L，消耗率為48.9%；最后為葡萄糖，由9.20,mg/m L下降到5.12,mg/m L，消耗率為40.6%．

從圖5(a)可以看出，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為2.0%時長雙歧桿菌菌體質(zhì)量濃度在培養(yǎng)24,h達(dá)到0.32,g/L，此后再增加葡萄糖的加入量，菌體質(zhì)量濃度變化不大．從圖5(b)可以看出，培養(yǎng)基中菊糖濃度在2.0%時長雙歧桿菌菌體質(zhì)量濃度在培養(yǎng)18,h達(dá)到0.45,g/L，此后再增加菊糖的投入，菌體質(zhì)量濃度變化不大．從圖5(c)可以看出，培養(yǎng)基中菊糖酶解低聚果糖濃度在2.0%時長雙歧桿菌菌體質(zhì)量濃度在培養(yǎng)12,h達(dá)到0.5,g/L，此后再增加低聚果糖的投入，菌體質(zhì)量濃度變化不大．

由此可見，長雙歧桿菌在碳源為菊糖和菊糖酶解低聚果糖的培養(yǎng)基中生長旺盛，在碳源為葡萄糖的培養(yǎng)基中，長雙歧桿菌達(dá)到最高菌體質(zhì)量濃度0.32,g/L時葡萄糖加入量為2.0%，但在以菊糖或低聚果糖為碳源的培養(yǎng)基中，達(dá)到相同的菌體質(zhì)量濃度時，菊糖或低聚果糖的加入量僅為0.5%，并且在加入低聚果糖培養(yǎng)12,h后就可達(dá)到相同的菌體質(zhì)量濃度．因此，得到相同數(shù)量的長雙歧桿菌，菊糖或菊糖酶解低聚果糖的用量更少，培養(yǎng)時間更短，從而可以達(dá)到降低成本，提高經(jīng)濟效益的效果．

2.4 原子力顯微鏡下長雙歧桿菌的形態(tài)

圖6為長雙歧桿菌在以菊糖和葡萄糖為碳源培養(yǎng)基中的菌體形態(tài)的原子力顯微鏡照片．

圖6 長雙歧桿菌菌體形態(tài)Fig.6 Thallus shape of Bifitdobacterium longum

圖6中右側(cè)圖片為顯微鏡照片的立體效果圖．長雙歧桿菌新分離菌株多呈Y或V型、刀狀或棒狀，經(jīng)繼代培養(yǎng)后常呈直或曲棒狀，也可呈枝狀[9]．由于觀察到的是長雙歧桿菌經(jīng)過繼代后的形態(tài)，因此，圖中長雙歧桿菌呈直棒狀或曲棒狀，長為1～3,μm，寬為0.5,μm，高為0.4～0.7,μm．不同碳源的培養(yǎng)基中長雙歧桿菌的形態(tài)無明顯差別，說明菊糖在促進(jìn)長雙歧桿菌增殖的同時不會對長雙歧桿菌的形態(tài)造成影響．

3 結(jié) 論

長雙歧桿菌在以菊糖和低聚果糖為碳源的培養(yǎng)基中的增殖情況均好于以葡萄糖為碳源，得到相同數(shù)量的長雙歧桿菌，菊糖或菊糖酶解低聚果糖的用量要少于葡萄糖的用量，培養(yǎng)時間也大大縮短，從而可以達(dá)到降低成本，提高經(jīng)濟效益的效果．長雙歧桿菌在分別以菊糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中形態(tài)無明顯差別，說明菊糖在促進(jìn)長雙歧桿菌增殖的同時不會影響其菌體形態(tài)．

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Promoting Effect of Inulin and Oligomerization Levulose on the Grow th of Bifitdobacterium Longum

ZHANG Jian-ping1，ZHANG Ze-sheng2，WANG Jin-ju2
(1. College of Marine Science and Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

TS245.9

A

1672-6510(2011)02-0017-04

2010–09–30；

2011–01–11

天津科技大學(xué)科學(xué)研究基金資助項目(20090214)

張建平（1982—），女，天津人，助理實驗師，碩士，zhangjianping@tust.edu.cn.