紫甘薯花色苷對人肝癌細胞HepG2的作用

曹東旭，董海葉，李 妍，呂曉玲

(1. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津市食品加工工程中心，天津 300457)

紫甘薯花色苷對人肝癌細胞HepG2的作用

曹東旭1,2，董海葉1，李 妍1，呂曉玲1

(1. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津市食品加工工程中心，天津 300457)

以人肝癌細胞HepG2為模型研究紫甘薯花色苷的抗腫瘤活性．通過MTT實驗檢測紫甘薯花色苷對HepG2細胞的生長抑制作用，HE染色觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀測定細胞周期變化．MTT結(jié)果表明，不同濃度的紫甘薯花色苷處理HepG2細胞24、48、72,h后，低濃度的紫甘薯花色苷促進腫瘤細胞的生長，高濃度的紫甘薯花色苷抑制腫瘤細胞的生長，800,μg/m L花色苷處理72,h抑制率高達80%．HE染色結(jié)果表明，正常HepG2細胞的細胞核和細胞質(zhì)清晰可見，而加入花色苷后，出現(xiàn)細胞核固縮、染色質(zhì)濃集于核膜表面、形成新月形致密小斑塊、細胞膜形態(tài)變得不規(guī)則等凋亡的特征．流式細胞儀分析結(jié)果表明，花色苷能夠促進腫瘤細胞的凋亡，且細胞的凋亡率隨花色苷濃度的增加而增大．

紫甘薯花色苷；HepG2細胞；抗腫瘤

Abstract：The anti-tumor activity of purple sweet potato anthocyanin to human liver cancer HepG2 cells was studied. Cell viability，morphology characteristic and cell cycle distribution were analyzed by MTT experiment，HE dyeing and flow cytometry，respectively. The MTT results indicated that after being treated w ith purple sweet potato anthocyanin for 24，48，72,h，the grow th of HepG2 cell was slightly promoted by low concentration of purple sweet potato anthocyanin and obviously inhibited by high concentration of purple sweet potato anthocyanin. The cell grow th inhibitory rate could reach up to 80% when HepG2 cells were treated w ith 800,μg/m L of anthocyanin for 72,h. The HE dyeing results indicated that the normal HepG2 cell nucleus and cytoplasm are clearly discernible，while after being treated w ith anthocyanin，HepG2 cells showed typical morphological changes associated w ith the characters of apoptosis，such as karyopyknosis，the chromatin enrich in the karyotheca surface，form ing the meniscus compact small mottling，the cell membrane shape becomes anomalous. Flow cytometry analysis results indicated that the anthocyanin could induce cell apoptosis，and the apoptotic percentage increased along w ith the anthocyanin concentration.

Keywords：purple sweet potato anthocyanin；HepG2 cells；anti-tumor

花色苷是一類廣泛地存在于植物中的水溶性天然色素，是一大類多酚化合物的總稱，也是植物的主要呈色物質(zhì)[1]．何會等[2]研究了荔枝皮色素提取液中花色苷的抗氧化能力，分別測定花色苷的總抗氧化能力(TAC)，清除羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基的能力，結(jié)果表明花色苷具有極佳的抗氧化能力．吳信子等[3]測定了花色苷的氧自由基吸收能力，發(fā)現(xiàn)在14種花色苷中，花青素具有最高活性，其活性比傳統(tǒng)抗氧化劑維生素E強得多．近年來花色苷抗腫瘤的作用越來越受到人們的關(guān)注，有研究表明花色苷對人腫瘤細胞有殺傷作用，對多種癌細胞如乳腺癌細胞、前列腺癌細胞等都具有不同程度的抑制作用[1]．然而，花色苷抑制人肝癌細胞HepG2 增殖、誘導(dǎo)凋亡作用的機制尚不清楚，本文以HepG2細胞為模型，初步探討紫甘薯花色苷對肝癌細胞的抗腫瘤效應(yīng)，為肝病的預(yù)防、治療及保肝功能食品的開發(fā)提供一定的實驗依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

紫甘薯花色苷為本學(xué)院實驗室提取[4–5]，樣品Ⅰ色價為40.7，樣品Ⅱ色價為85．

細胞株為人肝癌細胞HepG2，南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院．

主要試劑：胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司；青霉素、鏈霉素，哈藥集團制藥總廠；MTT(噻唑藍)，Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)，天津市化學(xué)試劑一廠．

1.2 細胞培養(yǎng)

將HepG2細胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基(Gibico公司)中，置37,℃、飽和濕度CO2,5%的2123TC型水套式CO2培養(yǎng)箱(美國Shellab公司)中恒溫培養(yǎng)，2～3,d傳代1次，取對數(shù)生長期的HepG2細胞進行實驗．

1.3 HepG2細胞生長抑制率的測定

采用MTT法進行測定．取對數(shù)生長期的HepG2細胞調(diào)整濃度為105,m L–1，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100,μL．培養(yǎng)24,h后倒掉培養(yǎng)基，用PBS洗2次，實驗組加入終質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400、800,μg/m L的紫甘薯花色苷200,μL，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個平行孔．培養(yǎng)24、48、72,h后倒掉紫甘薯花色苷溶液，用PBS洗2次，每孔加入質(zhì)量濃度為0.5,mg/m L的MTT,200,μL．繼續(xù)培養(yǎng)4,h后倒掉上清液，用PBS洗2次，每孔加入DMSO,150,μL，振蕩使紫色結(jié)晶物充分溶解．在酶標儀上測定波長570,nm處各孔的吸光度，進行不同色價紫甘薯花色苷的實驗及其吸光度的測定．

抑制率＝(1－A加藥孔/A對照孔)×100%

1.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察[6–10]

用HE染色方法觀察細胞形態(tài)．取對數(shù)生長期的HepG2細胞，調(diào)整其濃度為105,m L–1，接種于底部鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔2,m L．培養(yǎng)12,h待細胞貼壁后吸走培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入紫甘薯花色苷樣品Ⅰ使終質(zhì)量濃度分別為100、200、400、800,μg/m L，同時設(shè)置對照組．培養(yǎng)24,h后取出蓋玻片，固定前先用PBS清洗細胞2次(1 000 r/m in離心5 m in，棄去上清液)，去除妨礙染色的血清．用10%甲醛固定細胞40,m in．蒸餾水洗1次后，滴入蘇木精染液作用3,m in．加入0.5%鹽酸–70%乙醇溶液作用1,m in，脫去胞質(zhì)的著色，此時核呈紫紅色．加入堿性溶液堿化，使細胞核變成藍色．用自來水(呈弱堿性)浸泡5,m in．蒸餾水洗作用1,m in，去除殘留的堿性溶液，否則影響伊紅著色．加入伊紅染液作用1,m in．用梯度乙醇溶液脫水：70%、90%、95%的乙醇各脫水45,s，100%乙醇脫水2次，每次2,m in．用二甲苯透明細胞2次，每次5,m in．樹膠封固，即將蓋玻片用樹膠粘于載玻片上，以利保存和觀察．

1.5 細胞周期測定[10–11]

分別取終質(zhì)量濃度為100、200、400、800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅰ處理的HepG2細胞各105,m L–1，用PBS洗2次后將細胞重懸于1,m L,PBS中，緩慢滴入預(yù)冷的2.3,m L,100%乙醇中，于4,℃冰箱固定18,h．離心去除乙醇，將細胞用PBS洗2次，重懸于1,m L,PBS中．加入20,μL,PI染液、5,μL的RNaseA室溫避光作用1 h．加2.5,m L PBS稀釋300目濾膜過濾．流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)測定細胞周期，用熒光共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)觀察細胞的凋亡情況．

2 結(jié)果與討論

2.1 MTT法的檢測結(jié)果

終質(zhì)量濃度為25、50,μg/m L紫甘薯花色苷作用HepG2細胞后，花色苷促進了細胞的生長，25、50,μg/m L樣品Ⅰ作用HepG2細胞24、48,、72,h的促進率分別為15%、10%、6%和9%、5%、3%．25、50,μg/m L樣品Ⅱ作用HepG2細胞24、48、72,h的促進率分別為12%、8%、3%和6%、4%、1%．

由圖1(a)可知：在100、200、400、800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅰ作用HepG2細胞24,h后，抑制了細胞生長，抑制率分別為8%、19%、27%和36%；在加藥培養(yǎng)48 h后，抑制率達到23%、31%、48%和61%；800,μg/m L紫甘薯花色苷與HepG2細胞共培養(yǎng)72,h，抑制率達到75%．其中24、48、72,h的IC50值分別為2 253±11.9，459±13.75和199±13.5．

MTT法測定細胞的生長抑制率顯示，在100～800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅰ對HepG2細胞有明顯的抑制作用．紫甘薯花色苷樣品Ⅰ在25～800,μg/m L具有以下特點：紫甘薯花色苷低濃度促進細胞的生長，高濃度抑制細胞生長，其抑制作用隨藥物濃度的增大而增大，隨著作用時間的延長而增大．

由圖1(b)可知：在終質(zhì)量濃度為100、200、400、800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅱ作用HepG2細胞24,h后，抑制率分別為12%、23%、30%和38%；在加藥培養(yǎng)48,h后，抑制率達到25%、40%、52%和63%，800,μg/m L 紫甘薯花色苷與HepG2細胞共培養(yǎng)72,h，抑制率達到80%．其中24、48、72,h的IC50值分別為2,039±8.25、399±12.50和151±12.75．

圖1 花色苷對HepG2細胞的影響Fig.1 Effect of anthocyanin on HepG2 cells

實驗中所用的紫甘薯花色苷樣品Ⅱ的色價要高于紫甘薯花色苷樣品Ⅰ的色價，結(jié)果顯示紫甘薯花色苷樣品Ⅱ的抑制率明顯高于樣品Ⅰ的抑制率，可見在本實驗中所使用的紫甘薯花色苷濃度范圍內(nèi)，色價不同其抑制率也明顯不同，色價越高，抑制率越強．

紫甘薯花色苷是類黃酮化合物，可能通過阻止腫瘤細胞增殖生長、降低金屬蛋白酶的活力、激活JNK途徑、阻止活性氧和致癌物以及DNA加合物的作用，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡．紫甘薯花色苷濃度越高，抑制效果越明顯．而MTT法測定低濃度的紫甘薯花色苷組表現(xiàn)出促進細胞生長的結(jié)果，這可能是由紫甘薯花色苷本身顏色與MTT實驗中生成的紫色結(jié)晶顏色相近造成的吸光度偏高．

2.2 HE染色觀察細胞形態(tài)變化

HE染色觀察到的細胞形態(tài)見圖2．

圖2 HepG2 細胞形態(tài)Fig.2 HepG2 cells morphology

正常細胞形態(tài)呈貼壁狀態(tài)比較良好的菱形，細胞核呈藍色清晰可見，細胞質(zhì)呈微紅色．加入藥物處理后細胞呈現(xiàn)貼壁不太牢固的橢圓形，且形態(tài)大小不一．深藍色的顆?？赡苁氢}鹽顆粒，灰藍色的為細胞核黏液，鮮紅色的顆粒為胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒，而粉紅的為蛋白質(zhì)液體．加藥處理后的細胞由于其細胞膜的損壞，由輕度嗜堿呈現(xiàn)嗜伊紅濃染，伊紅著色由淺變深．200,μg/m L紫甘薯花色苷處理細胞，部分細胞核已消失，染色質(zhì)濃集于核膜表面，形成新月形致密小斑塊，細胞膜形態(tài)變得不規(guī)則．800,μg/m L紫甘薯花色苷處理的細胞，大部分細胞已經(jīng)不能維持原來的形態(tài)，很多碎裂出現(xiàn)凋亡晚期的特征．

2.3 細胞周期的變化

終質(zhì)量濃度為100、200、400、800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅰ作用于HepG2細胞24,h，實驗結(jié)果如圖3所示．

在實驗所取紫甘薯花色苷濃度范圍內(nèi)，隨著紫甘薯花色苷濃度的增加，其抑制效果明顯增強，呈濃度依賴關(guān)系，在紫甘薯花色苷質(zhì)量濃度分別為100、200、400、800,μg/m L時，細胞凋亡率分別為4.59%、20.87%、27.05%和33.92%．

圖3 花色苷樣品Ⅰ對HepG 2細胞周期的影響Fig.3 Effect of anthocyanin samp le Ⅰ on HepG2 cell cycle

3 結(jié) 論

(1),通過MTT實驗結(jié)果證明，紫甘薯花色苷能夠顯著抑制人肝癌HepG2細胞的生長，抑制率與濃度、時間成劑量依賴性．

(2),HE染色觀察HepG2細胞的形態(tài)學(xué)變化，花色苷質(zhì)量濃度為100、200,μg/m L時，細胞逐漸變圓，細胞核固縮，當花色苷質(zhì)量濃度為400、800,μg/m L時，細胞膜基本破裂，幾乎不能維持細胞形態(tài)．

(3),流式細胞儀測定細胞周期，分析得出紫甘薯花色苷對HepG2細胞凋亡率的影響，即細胞凋亡比例隨著花色苷濃度增大而增大．

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Effect of Purp le Sweet Potato Anthocyanin on Human Liver Cancer HepG2 Cells

CAO Dong-xu1,2，DONG Hai-ye1，LI Yan1，Lü Xiao-ling1
(1. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. Tianjin Food Engineering Center，Tianjin 300457，China)

TS202.3

A

1672-6510(2011)02-0009-04

2010–10–08；

2010–12–28

曹東旭（1973—），女，遼寧開原人，副教授，博士，carol@tust.edu.cn.