激素對轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根植株再生及類黃酮產(chǎn)生的影響

喬獻麗，蔣曙光，呂曉芬，李鳳霞，趙德修

1 中國科學院植物研究所 光合作用與環(huán)境分子生理學重點實驗室，北京 100093

2 中國科學院研究生院，北京 100049

3 河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000

激素對轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根植株再生及類黃酮產(chǎn)生的影響

喬獻麗1,2，蔣曙光3，呂曉芬1,2，李鳳霞1,2，趙德修1

1 中國科學院植物研究所 光合作用與環(huán)境分子生理學重點實驗室，北京 100093

2 中國科學院研究生院，北京 100049

3 河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000

為了研究外源激素 GA3和IAA對 3個轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮類黃酮高產(chǎn)毛狀根系C17、C27、C46的植株再生及其總黃酮含量的影響，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的GA3和IAA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GA3濃度高于1.0 mg/L時，可誘導毛狀根系產(chǎn)生不定芽，其中以GA3濃度為2.0 mg/L時，轉(zhuǎn)基因毛狀根系C17的不定芽再生率最高，可達82%。高壓液相色譜以及紫外分光光度法測定結(jié)果表明，與未用激素處理的毛狀根和它的再生植株相比，外源激素GA3和IAA能顯著提高毛狀根培養(yǎng)物中芹菜素和總黃酮的含量。毛狀根系的組織干重與類黃酮的含量沒有相關(guān)性，但毛狀根系的再生率與類黃酮的含量幾乎呈反相關(guān)性。

新疆雪蓮，植物激素，植株再生，毛狀根，類黃酮

Abstract:We investigated the plant regeneration and production of flavonoids in three high-yield flavonods transgenic Saussurea involucrata hairy roots C17, C27 and C46 by quantification of two phytohormones GA3and IAA. The results showed that GA3concentration at more than 1.0 mg/L could induce adventitious shoots in the hairy root lines. The highest shoot regeneration rate,about 82%, was obtained when the hairy roots C17 were cultured with 2.0 mg/L GA3. The results on HPLC and UV spectrophotometry showed that exogenous application of both GA3and IAA increased the content of flavonoids in the hairy roots.The contents of flavonoids and apigenin in the hormone-treated hariy roots and regenerates were higher comparing with those in the untreated hairy roots and the regenerates. However, the content of flavonoids was not related to tissue weight, and was negativelyrelated to the regeneration efficiency.

Keywords:Saussurea involucrata, phytohormones, plant regeneration, hairy root, flavonoids

新疆雪蓮Saussurea involucrate Kar. et Kir.為菊科 (Compositae) 鳳毛菊屬多年生草本植物，是我國著名的傳統(tǒng)中藥材，具有散寒除濕、活血通經(jīng)、抗炎、鎮(zhèn)痛等功能，其主要活性成分為類黃酮物質(zhì)[1]，如芹菜素 (5,7,4'-trihydroxyflavone) 具有抑制腫瘤形成和抗炎的功能[2-3]。雪蓮生長在海拔2 400米至4 000米的石縫、礫石坡和濕潤沙地上，屬于生長期較長的耐寒植物，通常需用5年時間才能生長成熟。由于雪蓮藥用價值高、資源貧乏，已被列為國家三級保護漸危植物[4]。但掠奪式盜挖依然觸目驚心，已經(jīng)威脅到了雪蓮物種的生存。現(xiàn)在最緊迫的任務(wù)是一方面應該更加有力地保護雪蓮的自然資源，另一方面應該積極探索擴大雪蓮藥源供應的新渠道。

為保護我國頻危物種資源、滿足雪蓮臨床需求，本實驗室率先建立了雪蓮毛狀根培養(yǎng)體系[5]。在適宜條件下，毛狀根可以再生成完整植株，這一特點與DNA重組技術(shù)相結(jié)合，對植物基因工程的發(fā)展具有重要價值，因此Ri質(zhì)粒是理想的基因工程載體。目前由Ri質(zhì)粒介導轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物再生在很多種屬中獲得了成功。由毛狀根再生的植株通常表現(xiàn)出一些特定的可遺傳的表型變異，在植物育種和品種改良等方面有巨大的參考應用價值[6-7]。

外源植物激素對毛狀根的形態(tài)、生長情況、次生代謝物的產(chǎn)量以及再生成苗均具有很大影響[8-11]。為提高雪蓮毛狀根再生能力、以及再生苗的生長速率和有效成分的含量，本研究在前期工作[5]的基礎(chǔ)上選擇了3個SmChi (水母雪蓮查爾酮異構(gòu)酶基因)轉(zhuǎn)基因毛狀根系。這些毛狀根系的總黃酮含量明顯高于未轉(zhuǎn)基因的毛狀根系，轉(zhuǎn)基因毛狀根再生苗攜帶提高類黃酮的關(guān)鍵基因，可提高再生苗中類黃酮含量。本文以SmChi 轉(zhuǎn)基因毛狀根系為材料，研究了外源植物激素對轉(zhuǎn)基因毛狀根系誘導、植株再生和類黃酮物質(zhì)合成的影響。為建立轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根再生植株體系，我們利用植物次生代謝工程技術(shù)以及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行分子育種，為解決雪蓮資源貧乏提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新疆雪蓮 Smchi轉(zhuǎn)基因類黃類酮高產(chǎn)毛狀根體系 (C17、C27、C46) 由本實驗室保存[5]，Smchi基因是本實驗室從水母雪蓮Saussurea medusa Maxim cDNA文庫里克隆的查爾酮異構(gòu)酶 (Chalcone isomerase，CHI)，并命名為 Smchi基因。在裝有1/2 MS無激素液體培養(yǎng)基的三角瓶中，弱光培養(yǎng)，18 d繼代1次。搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2 不同濃度的 GA3對 C17、C27、C46不定芽誘導率的影響

選取生長旺盛 (約18 d) 的3個轉(zhuǎn)基因根系，分別切取5 cm根尖接種于含0、1.0、1.5、2.0 mg/L GA3的1/2 MS液體培養(yǎng)基上，每瓶接種15條根尖，每一種處理為5瓶，試驗重復3次。

1.3 不同濃度的IAA、GA3對C46毛狀根系類黃酮合成的影響

將 IAA、GA3分別以相同的濃度梯度 0、0.1、0.2、0.5、1 mg/L同時添加到含有新轉(zhuǎn)接的C46毛狀根根尖的1/2 MS液體培養(yǎng)基里，每瓶接種13條，每條長約5 cm。新接種的毛狀根取自于同一批生長18 d的C46。同時做3個重復。

1.4 Smchi轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根系與再生苗生長及類黃酮含量測定

將3個轉(zhuǎn)基因株系 (C17、C27、C46) 和再生苗以及對照物分別在MS中添加0.5 mg/L GA3激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。記錄接種時材料的重量，20 d后，將試管苗收獲，并記錄重量，然后將材料置于50 ℃烘箱中烘至恒重。

1.5 毛狀根干重的測定

收集生長18 d的新疆雪蓮毛狀根，蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干后，稱取鮮重 (FW)。置于50 ℃烘箱中烘干至衡重，稱量其干重。

1.6 總黃酮含量的測定

采用Beckman Coulter的DU640可見-紫外分光光度計進行比色法測定[12]。測定波長510 nm，其蘆丁標準品與其吸光度的直線方程：c=0.08089A?0.0005324 (其中，c表示總黃酮的濃度，單位是mg/mL，A為光的吸收變量)，相關(guān)系數(shù)r=0.9991。以標準品蘆丁 (Rutinum，C27H30O18·3H2O) 的含量進行換算。

1.7 新疆雪蓮再生苗及毛狀根的芹菜素 (HPLC)和總黃酮含量的測定

芹菜素的含量通過高效液相色譜 (HPLC) 法測定，樣品處理及檢測方法參照文獻[5]。芹菜素標準品濃度與峰面積的直線方程：c=28.242A?24.079(其中c表示芹菜素的濃度，單位是μg/mL；A表示峰面積)，r=0.9981，測定波長337 nm。儀器型號：Agilent 1100系統(tǒng) (Agilent，USA)，反相色譜柱Zorbax 300SB-C18 (250 mm×4.5 mm，4 μm)?？傸S酮含量測定同上述1.3。

1.8 C17、C27、C46根系再生苗的PCR檢測

毛狀根再生植株 DNA的提?。喊凑諈⒄瘴墨I[13]的方法進行。所使用的CHI基因PCR擴增的上游引物為：5′-CCCACTATCCTTCG-3′；下游引物為5′-GCATGAGAGCTCTGGGCACACAGATGATTT-3′，預期大小403 bp，而PCR反應條件為：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性 1 min，56 ℃退火 1min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果

2.1 GA3對轉(zhuǎn)Smchi基因新疆雪蓮毛狀根植株再生的影響

在檢測過的10多個毛狀根系中，C46毛狀根系的總類黃酮含量以及該根系中CHI基因的表達量和酶活性最高[5]。表 1為 GA3不同濃度對新疆雪蓮毛狀根系C46不定芽誘導和不定芽生長的影響。從表1可見，GA3對新疆雪蓮毛狀根不定芽的誘導具有顯著作用，當3個毛狀根系在不加激素的1/2 MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)至培養(yǎng)周期結(jié)束時 (35 d)，都沒有不定芽的產(chǎn)生；而當 3個毛狀根系在附加 1.5 mg/L GA3的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，以毛狀根系C17的不定芽誘導率較高，可達75%；繼續(xù)增加GA3濃度至2.0 mg/L時，不定芽再生率最高，其中C17可以達到 82%。不同的毛狀根根系對 GA3的誘導反應也不同，添加相同濃度的GA3，根系C17和C27不定芽的誘導率較高，根系 C46誘導效率相對較低(表 1)。

GA3對轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮毛狀根系C46不定芽的誘導在形態(tài)上具有顯著變化，在1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至培養(yǎng)周期結(jié)束時 (35 d)，附加1.0 mg/L GA3的1/2 MS培養(yǎng)基的毛狀根有少量的不定芽形成 (圖1A)，其毛狀根系不定芽的誘導率最低 (表1)。而在附加1.5 mg/L GA3的1/2 MS培養(yǎng)上培養(yǎng)的毛狀根不定芽生長健壯 (圖1B)，此時毛狀根系不定芽的誘導最高 (表1)。但當GA3濃度增至2.0 mg/L時，毛狀根的不定芽較細弱，玻璃化嚴重，繼續(xù)培養(yǎng)褐化嚴重，不易成活 (圖1C)，毛狀根的不定芽的誘導率開始下降 (表1)。

圖1 GA3濃度對新疆雪蓮毛狀根C46根系不定芽誘導和不定芽生長的影響Fig. 1 The effects of concentration of GA3on the induction of adventitious shoot and shoot growth of hairy root line C46. (A)1.0 mg/L GA3. (B) 1.5 mg/L GA3. (C) 2.0 mg/L GA3.

表1 GA3濃度對新疆雪蓮毛狀根不定芽誘導率的影響Table 1 Effects of concentration of GA3on induction efficiency of adventitious shoot

2.2 IAA、GA3不同濃度對毛狀根系 C46類黃酮化合物合成的影響

圖2為IAA對C46根系類黃酮化合物合成的影響。從圖2可見，IAA (0.1~1 mg/L) 能夠提高毛狀根中黃酮含量。當IAA濃度為0.2 mg/L時，每克毛狀根干重的類黃酮含量達到最大，為 29.7 mg/g干重。IAA濃度繼續(xù)增加，類黃酮含量逐漸減少，最后當IAA濃度為1 mg/L時，類黃酮含量與不加任何激素處理的毛狀根處于同一水平。圖 3為 GA3對C46根系類黃酮化合物合成的影響。由圖3可以看出，GA3 (0.1~1 mg/L) 能夠顯著促進C46毛狀根中類黃酮含量的增加。當GA3濃度為0.5 mg/L時，每克毛狀根干重的類黃酮含量達到最大，為 43 mg/g干重，是無激素培養(yǎng)條件下的1.6倍。當GA3濃度增加為1 mg/L時，類黃酮含量開始下降。

圖2 不同IAA濃度對雪蓮毛狀根系C46干重和總黃酮含量的影響Fig. 2 Effect of concentration of IAA on dry weight and flavonoid content. Each value is the x± s from three independent experiments.

圖3 不同 GA3濃度對雪蓮毛狀根系 C46干重和總黃酮含量的影響Fig. 3 Effect of concentration of GA3on dry weight and flavonoid content. Each value is the x± s from three independent experiments.

2.3 新疆雪蓮毛狀根與再生植株芹菜素和總黃酮含量的測定

在植物生長發(fā)育過程中，植物體內(nèi)的次生代謝活動會受到影響，次生物質(zhì)的含量和組成會發(fā)生很大的變化[10-11]。由毛狀根誘導出的新疆雪蓮再生苗經(jīng)過 3周的繼代培養(yǎng) (所用培養(yǎng)基中 GA3濃度為0.5 mg/L)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與各自來源的毛狀根相比，毛狀根再生苗的芹菜素和總黃酮含量都下降了 20%~30%，其中株系C46芹菜素含量下降了26%，總黃酮含量下降了21% (圖4)。但與對照組培苗 (Control-1)和農(nóng)桿菌感染的毛狀根再生植株 (Control-2) 相比，35S-Smchi轉(zhuǎn)基因再生植株的芹菜素和總黃酮含量都有顯著提高，其中株系C46芹菜素和總黃酮含量分別為 1.86 mg/g干重和 37.3 mg/g干重，分別為Control-1的12倍和2.4倍，Control-2的4倍和1.6倍 (圖5)。HPLC測定結(jié)果顯示：芹菜素標準樣品與毛狀根系 C46再生苗芹菜素的保留時間是一致(圖 6)。

2.4 再生苗的PCR檢測

對再生株系 (C17、C27、C46) 的Smchi基因的PCR檢測結(jié)果顯示 (圖7)，所選的幾個根系都檢測出了同陽性對照一樣大小的條帶，而在來源于野生型毛狀根轉(zhuǎn)化的對照再生苗，則沒有檢測到相應的條帶。表明在新疆雪蓮毛狀根植株再生的過程中，其攜帶的外源基因并沒有丟失。

圖4 轉(zhuǎn)Smchi基因新疆雪蓮毛狀根和再生苗的芹菜素和總黃酮含量Fig. 4 Content of apigenin and flavonoid in different S.involucrata plantlet and hairy root lines (20 d). (A) Apigenin content. (B) Flavonoid content. Control: induced by A.rhizogenes strain R1601; Cn: induced by A. rhizogenes strain R1601 with the binary vector pCHI (“n” indicates the line number).

圖 5 不同類型新疆雪蓮毛狀根系再生苗的芹菜素和總黃酮含量Fig. 5 Content of apigenin and flavonoid in different types of S. involucrata plantlet (20 d). Control-1: normal plantlet;Control-2: plantlet induced by wild-type hairy root which was induced by A. rhizogenes strain R1601; Cn: plantlet induced by 35S-chi transgenic hairy root lines which is induced by A. rhizogenes strain R1601 with the binary vector pCAMBIA1301-chi (“n” indicates the line number).

圖6 新疆雪蓮毛狀根系C46再生苗的HPLC圖譜Fig. 6 Chromatograms recorded at 337 nm. (A) Standard sample of apigenin. (B) A regenerant from chi-transformed root line.

圖7 轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮再生苗的PCR檢測Fig. 7 Analysis of PCR for chi of transformed S. involucrata regenerated plantlet. C: plantlet induced by wild-type hairy root which was induced by A. rhizogenes strain R1601; Cn: plantlet induced by 35S-chi transgenic hairy root lines which is induced by A. rhizogenes strain R1601 with the binary vector pCHI (“n”indicates the line number); A: A. rhizogenes strain R1601 containg pRiA4 and pCAMBIA1301-chi; M: DNA marker (DGL-2000).

3 討論

本實驗對新疆雪蓮轉(zhuǎn) Smchi基因的毛狀根植株再生進行了研究。結(jié)果顯示 Smchi轉(zhuǎn)基因雪蓮植株和未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的雪蓮試管苗相比，轉(zhuǎn)基因株系的芹菜素和總黃酮含量比對照植株有顯著提高，這一結(jié)果與木本曼陀羅毛狀根再生植株中莨菪烷類生物堿 (Tropane alkaloids，TA) 的含量較野生植株有明顯的提高的報道一致。新疆雪蓮毛狀根不定芽的產(chǎn)生類型與山葵Amoracia rusticana、百脈根Lotus corniculatus、紅豆草Onobrychis viciifolia、紫云英 Astragalus sinicus等植物不定芽產(chǎn)生類型相似[14-17]，不定芽都是在毛狀根表面、沒有可見愈傷的地方形成。而有些植物如苜蓿Medicago sativa毛狀根不定芽則是在毛狀根來源的愈傷形成胚狀體，然后再產(chǎn)生不定芽[18]。

雪蓮毛狀根分化出的再生苗與未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的再生苗在形態(tài)上有明顯差別，包括葉片邊緣皺縮、節(jié)間縮短、植株矮化、不定根多，這是由于受來自發(fā)根農(nóng)桿菌T-DNA中rol基因的影響，與有關(guān)報道一致，是一種典型的毛狀根轉(zhuǎn)化植株形態(tài)[14-16]。

植物激素是植物組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵因子，不僅影響細胞生長，還影響植物中次生代謝產(chǎn)物的合成[19]。在研究外源激素GA3和IAA對轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮毛狀根系生長及類黃酮含量的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同濃度不同種類的激素對毛狀根系C46的生長及類黃酮含量有所不同，在外源激素GA3誘導下的C46毛狀根系類黃酮的含量明顯高于在外源激素IAA誘導下的類黃酮的含量，但對毛狀根的生長沒有明顯的差別。這一研究結(jié)果與外源激素對黃芩毛狀根生長及黃芩苷合成影響的研究結(jié)果[19]一致。實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在1/2 MS附加 GA31.5 mg/L的培養(yǎng)基上，不同的雪蓮毛狀根根系對GA3的誘導反應也不同，添加相同濃度的GA3，根系C17和C27不定芽的誘導頻率較高，根系C46誘導效率相對較低。這可能是毛狀根是由單細胞起源，但單克隆與單克隆之間，T-DNA插入的片段呈現(xiàn)多樣性[9]，導致受激素影響的差異。外源激素GA3對植物次生代謝產(chǎn)物形成影響的報道有所不同，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)激素 GA3對雪蓮毛狀根及再生苗中類黃酮的含量有明顯提高。這一結(jié)果與Younghee K報道激素GA3提高了龍膽花冠中的類黃酮含量[20]一致。但Ilan等[22]在研究激素GA3對胡蘿卜細胞培養(yǎng)物中花青素形成的研究中發(fā)現(xiàn)，外源激素GA3抑制花青素的合成。以上研究結(jié)果的差異可能與花青素的合成途徑與積累在不同植物種群以及不同植物組織器官中表達不同的模型[22]有關(guān)。從圖2和3中可以觀察到，當分別在毛狀根系 C46中添加濃度為 0.1~0.5 mg/L培養(yǎng)基IAA和 GA3兩種激素與未添加激素的毛狀根 (空白對照) 相比均不同程度地提高類黃酮的含量，當濃度提高到1 mg/L時類黃酮含量及干重有所下降，此結(jié)果證明了以上兩種激素可提高雪蓮毛狀根系中類黃酮含量。已有類似的報道，植物激素可提高毛狀根代謝產(chǎn)物的含量，較高濃度的激素可抑制毛狀根代謝產(chǎn)物的形成及毛狀根組織的生長[6,19]。

從圖5中可以看到3種轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根再生苗 (C17，C27，C46) 的總黃酮含量明顯高于未轉(zhuǎn)入Smchi轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根再生苗 (Control-2) 的含量。CHI基因是黃酮代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶，上調(diào)CHI基因會導致總黃酮生物合成能力提高。在雪蓮毛狀根中CHI基因的表達量和CHI酶的活性與黃酮的含量相關(guān)[5]。攜帶 CHI基因雪蓮毛狀根再生植株 (C17，C27，C46) 的 PCR結(jié)果顯示 (圖 7)：轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根系再生植株CHI基因沒有丟失。表明CHI基因在轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根系再生植株的芹菜素和總黃酮合成中起著重要的作用。從圖5中還可以看到，與轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根系再生苗和未轉(zhuǎn)入Smchi轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根再生苗相比，野生雪蓮試管苗(Control-1，normal plantlet) 的總黃酮含量最低，從這一結(jié)果中可以推測，雪蓮毛狀根系中的rol基因?qū)μ岣哐┥徝珷罡狞S酮含量起到一定的作用，這與前面的討論也是一致的。因此，以毛狀根為受體，將類黃酮代謝途徑中的有效基因?qū)氲叫陆┥徝珷罡?，然后再生成高產(chǎn)類黃酮轉(zhuǎn)基因苗，進行人工栽培，將是解決雪蓮野生資源短缺的有效途徑。

REFERENCES

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People`s republic of China. 2005 ed. Beijing:Chemical Industry Press, 2005: 36.

國家藥典委員會編《中華人民共和國藥典》2005年版.北京: 化學工業(yè)出版社, 2005: 36.

[2] McVean M, Xiao HY, Isobe KI, et al. Increase in wild-type p53 stability and transactivational activity by the chemopreventive agent apigenin in keratinocytes.Carcinogenesis, 2000, 21(4): 633?639.

[3] Gupta S, Afaq F, Mukhtar H. Selective growth-inhibitory,cell-cycle deregulatory and apoptotic response of apigenin in normal versus human prostate carcinoma cells.Biochem Biophys Res Commun, 2001, 287(4): 914?920.

[4] China Environmental Protection Agency. The Study of Protection of Rare and Endangered Plants in China.Beijing: China Environmental Scinence Press, 1991:158.

國家環(huán)保局. 珍稀瀕危植物保護研究. 北京: 中國環(huán)境科學出版社, 1991: 158.

[5] Li FX, Jin ZP, Zhao DX, et al. Overexpression of the Saussurea medusa chalcone isomerase gene in S.inveolucrata hairy root cultures enhances their biosynthesis of apigenin. Phytochemistry, 2006, 67(6): 553?560.

[6] Zhang JD, Yang XQ, Qiao AM, et al. Plant regeneration from hairy roots of Datura arborea L. J Tropical Subtropical Botany, 2008, 16(5): 480?485.

張繼棟, 楊雪清, 喬愛民, 等. 木本曼陀羅毛狀根植株再生體系的建立. 熱帶亞熱帶植物學報, 2008, 16(5):480?485.

[7] Tiwari RK, Trivedi M, Guang ZC, et al. Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of Scutellaria baicalensis and production of flavonoids in hairy roots.Biol Plant, 2008, 52(1): 26?35.

[8] Weathers PJ, Bunk G, McCoy MC. The effect of phytohormones on growth and arthmisinin production in Artemisia annua hairy roots. In Vitro Cell Dev Biol Plant,2005, 41(1): 47?53.

[9] Farkya S, Bisaria VS. Exogenous hormones affecting morphology and biosynthetic potential of hairy root line(LYR2i) of Linum album. J Biosci Bioeng, 2008, 105(2):140?146.

[10] Grunewald W, van Noorden G, Van Isterdael G, et al.Manipulation of auxin transport in plant roots during Rhizobium symbiosis and nematode parasitism. Plant Cell,2009, 21(9): 2553?2562.

[11] Yang SH, Liu XF, Guo DA, et al. Effect of phytohormones and elicitors on growth and anthraquinone production of Cassia obtuifolia hairy roots. Chin Tradit Herb Drugs,2005, 36(5): 752?756.

楊世海, 劉曉峰, 果德安, 等.決明毛狀根誘導及激素與誘導子對毛狀根生長和蒽醌類化合物合成的影響. 中草藥, 2005, 36(5): 752?756.

[12] Guan JY, Wang WW, Ma MT, et al. Investigation of technological preparation on soak of Saussurea involucrate.J Shenyang Pharmaceutical Univ, 1995, 12(3): 209?211.

關(guān)家彥, 王瑋文, 馬慕提, 等. 天山雪蓮浸提液制備工藝的考察. 沈陽藥科大學學報, 1995, 12(3): 209?211.

[13] Doyle JJ, Doyle JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 1990, 12(1): 13?15.

[14] Cho HJ, Widholm JM, Tanaka N, et al. Agrobacterium rhizogenes mediated transformation and regeneration of the legume Astragalus sinicus (Chinese milk vetch). Plant Sci, 1998, 138(1): 53?65.

[15] Golds TJ, Lee JY, Husnain T, et al. Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of the forage legumes Medicago sativa and Onobrychis viciifolia. J Exp Bot,1991, 42(9): 1147?1157.

[16] Noda T, Tanaka N, Mano Y, et al. Regeneration of horseradish hairy roots incited by Agrobacterium rhizogenes infection. Plant Cell Rep, 1987, 6(4): 283?286.

[17] Petit A, Stougaard J, Kühle A, et al. Transformation and regeneration of the legume Lotus corniculatus: A system for molecular studies of symbiotic nitrogen fixation. Mol Gen Genet, 1987, 207(2/3): 245?250.

[18] Spanò L, Mariotti D, Pezzotti M, et al. Hairy root transformation in alfalfa (Medicago sativa L.). Theor Appl Genet, 1987, 73(4): 523?530.

[19] Qi XJ, Guo LK. Effects of exogenous phytohormones on hairy root of Scutellaria baicalensis biomass and biosynthesis baicalin. J Shaanxi Univ Sci Technol, 2009,27(2): 48?50.

齊香君, 郭樂康. 外源激素對黃芩毛狀根生長及黃芩苷合成的影響. 陜西科技大學學報, 2009, 27(2): 48?50.

[20] Kim Y. Gibberellic acid regulates flavonoid 3',5'-hydroxylase gene transcription in the corolla of Gentiana scabra. J Plant Biol, 1999, 42(4): 253?258.

[21] Ilan A, Dougall DK. Effects of gibberellic acid and uniconazole on the activities of some enzymes of anthocyanin biosynthesis in carrot cell cultures. J Plant Growth Regul, 1994, 13(4): 213?219.

[22] Nagira Y, Ikegami K, Koshiba T, et al. Effect of ABA upon anthocyanin synthesis in regenerated torenia shoots.J Plant Res, 2006, 119(2): 137?144.

Effects of phytohormones on plant regeneration and production of flavonoids in transgenic
Saussurea involucrata hairy roots

Xianli Qiao1,2, Shuguang Jiang3, Xiaofeng Lü1,2, Fengxia Li1,2, and Dexiu Zhao1
1 Key Laboratory for Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
2 Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
3 The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

Received: March 7, 2010; Accepted: August 11, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30871627), National Basic Research Program of China (973 Program) (No.2009CB119200).

Corresponding author: Deliang Peng. Tel: +86-10-62815611; E-mail: dlpeng@ippcaas.cn

國家自然科學基金 (No. 30871627)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2009CB119200) 資助。