江南卷柏脫氫抗壞血酸還原酶的分子特性

成子碩，蘭婷，李迪，楊海靈，曾慶銀

1 中國科學(xué)院植物研究所 系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093

2 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

3 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

江南卷柏脫氫抗壞血酸還原酶的分子特性

成子碩1,3，蘭婷1,3，李迪2，楊海靈2，曾慶銀1

1 中國科學(xué)院植物研究所 系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093

2 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

3 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

脫氫抗壞血酸還原酶 (DHAR) 在植物抗壞血酸?谷胱甘肽循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。利用同源克隆技術(shù)從江南卷柏中克隆到2個(gè)脫氫抗壞血酸還原酶基因，分別命名為SmDHAR1和SmDHAR2。SmDHAR1和SmDHAR2分別編碼218和241個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量分別是23.97 kDa和27.33 kDa?；蚪M序列分析顯示這2個(gè)基因分別含有5和6個(gè)內(nèi)含子。器官表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)這 2個(gè)基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，是組成型表達(dá)基因。在大腸桿菌中表達(dá)并純化了2個(gè)基因的重組蛋白。酶活性分析顯示SmDHAR1和SmDHAR2蛋白對底物DHA的活性有顯著差異，分別是19.76和0.17 μmol/(min·mg)。熱力學(xué)穩(wěn)定性分析顯示這2個(gè)重組蛋白的熱力學(xué)穩(wěn)定性具有明顯差異。因此，基因結(jié)構(gòu)與酶學(xué)性質(zhì)的差異預(yù)示著這2個(gè)基因可能存在功能上的分化。

江南卷柏，脫氫抗壞血酸還原酶，克隆，蛋白表達(dá)，酶活

Abstract:Plant dehydroascorbate reductase (DHAR) is a physiologically important reducing enzyme in the ascorbate-glutathione recycling reaction. In this study, two DHARs genes (SmDHAR1 and SmDHAR2) were isolated from Selaginella moellendorffii. The SmDHAR1 and SmDHAR2 genes encode two proteins of 218 and 241 amino acid residues, with a calculated molecular mass of 23.97 kDa and 27.33 kDa, respectively. The genomic sequence analysis showed SmDHAR1 and SmDHAR2 contained five and six introns, respectively. Reverse transcription PCR revealed that the SmDHAR1 and SmDHAR2 were constitutive expression genes in S. moellendorffii. The recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2 proteins were overexpressed in E. coli, and were purified byNi-affinity chromatography. The recombinant SmDHAR1 showed 116-fold higher enzymatic activity towards the substrate dehydroascorbate than recombinant SmDHAR2. The recombinant SmDHAR1 showed higher thermal stability than recombinant SmDHAR2. These results indicated obvious functional divergence between the duplicate genes SmDHAR1 and SmDHAR2.

Keywords:Selaginella moellendorffii, dehydroascorbate reductase (DHAR), cloning, protein expression, enzyme activity

還原型抗壞血酸 (Ascorbic acid，AsA) 是植物體內(nèi)普遍存在的一種小分子抗氧化物質(zhì)，可清除由光合作用、呼吸作用等氧化反應(yīng)產(chǎn)生的超氧自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧、羥自由基等活性氧自由基[1]，并被氧化成單脫氫抗壞血酸 (MDA)。MDA進(jìn)一步自氧化形成雙脫氫抗壞血酸 (DHA)，DHA在脫氫抗壞血酸還原酶 (Dehydroascorbate reductase，DHAR，EC 1.8.5.1) 和谷胱甘肽的作用下能還原成還原型抗壞血酸。因此，DHAR對于維持植物細(xì)胞中還原型抗壞血酸的水平具有重要意義。此外，DHAR在植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。例如，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過量表達(dá)水稻DHAR基因可提高對鹽脅迫的抗性[2]；在細(xì)胞質(zhì)中過量表達(dá)擬南芥DHAR基因可使轉(zhuǎn)基因馬鈴薯增強(qiáng)對臭氧和干旱脅迫的抗性[3]；在煙草中過量表達(dá) DHAR基因可以延緩葉片的衰老，同時(shí)葉綠素和葉黃素的含量增加[1]。

迄今為止，對DHAR的研究主要集中在擬南芥、小麥、菠菜、水稻等被子植物[4-7]，對于裸子植物，我們先前從白皮松中克隆了1個(gè)DHAR基因，并對它的性質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)的研究[8]，而對于在進(jìn)化上更古老的蕨類植物，還沒有關(guān)于DHAR基因的研究報(bào)道。蕨類植物是一種古老的維管植物，化石證據(jù)顯示它們起源于距今4億年前，在原始維管植物的進(jìn)化中具有重要意義[9]。江南卷柏Selaginella moellendorffii Hieron.是蕨類植物的一個(gè)現(xiàn)存種，在中國廣泛分布于長江流域和長江以南各地[10]，是一種常用的中草藥與民族藥[11]。本研究從江南卷柏中克隆到 2個(gè)DHAR基因，對該基因的基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與生化功能進(jìn)行了詳細(xì)的研究，為深入揭示DHAR在植物逆境脅迫中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

江南卷柏采自重慶晉云山。整株活體帶土移植，于光照培養(yǎng)箱 (25 ℃) 培養(yǎng)1周，取其嫩葉用于總RNA的提取。另外分離葉、菱葉、莖和根4個(gè)組織RNA，作為組織特異性表達(dá)分析材料。

1.2 工具酶和試劑

總RNA提取試劑盒Aurum Total RNA Kit購自Bio-Rad公司，DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒以及DNA maker購自Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR Kit (AMV) version 3.0、Taq DNA聚合酶和其他PCR試劑購自TaKaRa公司，pGEM-T Easy質(zhì)粒購自 Promega公司，限制性內(nèi)切酶購自Invitrogen公司。

1.3 DHAR基因序列的鑒定與命名

根據(jù)已知擬南芥 DHAR蛋白序列 (GenBank Accession No. AY039590)，利用 TBLASTN 檢索GenBank中江南卷柏的EST數(shù)據(jù)庫，獲得的2組序列與擬南芥DHAR序列均具有較高相似性。獲得序列經(jīng)過 Pfam判讀，確定該序列編碼的蛋白具有DHAR結(jié)構(gòu)域特征。我們將這 2組序列分別命名為SmDHAR1 (GenBank Accession No. FE475698.1) 和SmDHAR2 (GenBank Accession No. FE454714和FE454715)。

1.4 江南卷柏DHAR基因的克隆

取新鮮江南卷柏葉組織0.1 g，按照試劑盒說明書步驟提取江南卷柏的總RNA和基因組DNA，并以總RNA為模板，用Revert Aid First Stand cDNA試劑盒合成cDNA。

根據(jù)SmDHAR1和SmDHAR2 EST序列分別設(shè)計(jì)引物 SmDHAR1-CL1/2、SmDHAR2-CL1/2 (表 1)。引物均由 Invitrogen公司合成。分別以江南卷柏葉cDNA和基因組 DNA為模板，利用 2對引物SmDHAR1-CL1/CL2和SmDHAR2-CL1/CL2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶，純化產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中。在X-gal/IPTG Amp平板上挑取多個(gè)陽性克隆進(jìn)行雙向測序。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

SmDHAR1和SmDHAR2的蛋白序列與其他植物DHAR序列通過 Clustal X 1.83進(jìn)行氨基酸序列比對，然后經(jīng)BioEdit手動校對。利用MEGA v.4.0的neighbour-joining(NJ) 模型構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000。

1.6 江南卷柏DHAR基因的組織表達(dá)分布

為了研究DHAR基因在江南卷柏不同組織中的表達(dá)分布，按照試劑盒說明書步驟提取江南卷柏葉、菱葉、莖和根組織的總 RNA，并以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)SmDHAR1和SmDHAR2的基因序列分別設(shè)計(jì) 1對特異性引物 SmDHAR1-SP1/2和 SmDHAR2-SP1/2 (表 1)，進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，模板cDNA上樣量為3 μL，并且以江南卷柏 Actin基因作為內(nèi)標(biāo)。PCR反應(yīng)程序是：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min。在PCR反應(yīng)中以含有目的基因的pGEM-T載體作為陽性對照，以不加任何cDNA模板的PCR反應(yīng)液作為陰性對照，PCR結(jié)束后進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳上樣量為2 μL，為了進(jìn)一步驗(yàn)證所擴(kuò)增到的是否為目的基因，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.7 江南卷柏DHAR基因表達(dá)載體的構(gòu)建、融合蛋白的表達(dá)與純化

根據(jù)SmDHAR1和SmDHAR2的cDNA序列設(shè)計(jì)引物 SmDHAR1-EX1/2和 SmDHAR2-EX1/2 (表1)，以江南卷柏葉cDNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切回收，連接到帶 6×His標(biāo)簽的PET30a表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中。將測序驗(yàn)證無突變的重組表達(dá)菌于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，以1∶100稀釋后擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.5，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，37 ℃過夜誘導(dǎo)。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液4 ℃、6 500×g離心10 min收獲菌體，緩沖液A (20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.5) 重懸，冰上超聲破碎裂解。4 ℃、10 000 g離心10 min，取少量原菌液、超聲破碎后離心上清液和沉淀經(jīng)SDS-PAGE檢測具有目的蛋白峰帶，SDS-PAGE檢測采用 10%的分離膠，5%的濃縮膠。用緩沖液 A平衡Ni柱 (購自于Amersham Pharmacia Biotech公司)，將超聲破碎后離心上清液上樣，以緩沖液A平衡親和柱，用緩沖液B (0.5 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.5) 洗脫目的蛋白，收集目的蛋白洗脫峰進(jìn)行下一步酶學(xué)活性分析。

1.8 江南卷柏DHAR蛋白的酶學(xué)活性和熱力學(xué)穩(wěn)定性測定

植物 DHAR類基因是植物谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST) 超家族的一個(gè)亞類型，本實(shí)驗(yàn)對GST常見底物CDNB (Including 1-chloro-2,4-dinitrobenzene) 的活性測定參照Habig等[12]的方法，對NBD-Cl (7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole) 的催化活性測定參照Ricci等[13]的方法，對DHA (Dehydroascorbate) 的催化活性測定參照 Edwards等[14]的方法。酶熱力學(xué)穩(wěn)定性的測定方法是先將酶在指定溫度下保溫15 min，在保溫結(jié)束后檢測酶對DHA底物的催化活性。

1.9 江南卷柏DHAR蛋白結(jié)構(gòu)模擬

選取線蟲EXC-4蛋白 (PDB: 2yv9A) 的X衍射晶體結(jié)構(gòu)為模板，以 Align 2D程序 (InsightⅡ的Homology模塊) 進(jìn)行序列比對，運(yùn)用 InsightⅡ的Modeler模塊構(gòu)建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生10個(gè)結(jié)構(gòu)，每個(gè)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生 10個(gè)不同的環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)，優(yōu)化水平為高等，以Profiles-3D對各結(jié)構(gòu)進(jìn)行評價(jià)，選取最優(yōu)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 江南卷柏DHAR基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

選取5個(gè)代表不同進(jìn)化歷史的陸地植物物種的DHAR基因?yàn)檠芯繉ο螅ㄌμ\植物小立碗蘚Physcomitrella patens、蕨類植物水蕨 Ceratopteris richardii、裸子植物白云杉Picea glauca、單子葉植物水稻 Oryza sativa和雙子葉植物擬南芥Arabidopsis thaliana。另外DHAR基因被證明是GST基因家族的成員，在系統(tǒng)發(fā)育分析中，植物GST基因家族其他類型，包括 Tau、Phi、Lambda、Theta和Zeta GSTs序列也同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示所有DHAR基因聚成一大支，而且有著大于98%的支持率 (圖1)。我們發(fā)現(xiàn)這些DHAR基因聚成 2小支 (D1和 D2，圖 1)，SmDHAR1和SmDHAR2分別聚在D1支和D2支中，另外每一小支都有小立碗蘚和白云杉DHAR基因，這說明在陸地植物形成的早期，DHAR基因發(fā)生了一次古老的基因重復(fù)事件，在這次基因重復(fù)事件中產(chǎn)生的 2個(gè)重復(fù)基因拷貝在江南卷柏中被保留了下來。

圖1 江南卷柏DHAR基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Phylogenetic tree showing relationships between SmDHAR and other classes of plant GSTs.

2.2 江南卷柏DHAR基因的克隆與基因結(jié)構(gòu)分析

以江南卷柏葉cDNA以及基因組DNA為模板，引物SmDHAR1-CL1/CL2分別克隆到SmDHAR1的cDNA與基因組序列 (圖2A)。SmDHAR1 cDNA序列包括657 bp的開放閱讀框 (包括終止密碼子)、60 bp上游非編碼序列和68 bp下游非編碼序列。cDNA編碼 218個(gè)氨基酸的蛋白，預(yù)測分子量為23.97 kDa。SmDHAR1基因組序列長1 123 bp，包括5個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子長度分別為61、53、72、67和85 bp (圖 2A)。

引物 SmDHAR2-CL1/CL2分別克隆得到SmDHAR2的 cDNA 與基因組序列 (圖 2B)。SmDHAR2 cDNA序列包含726 bp的開放閱讀框 (包括終止密碼子)，60 bp上游非編碼區(qū)和35 bp下游非編碼區(qū)。cDNA編碼的蛋白包含241個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為27.33 kDa。SmDHAR2基因組序列長1 220 bp，包括6個(gè)內(nèi)含子，長度分別為68、59、58、60、78 和 76 bp (圖 2B)。

2.3 江南卷柏DHAR基因的組織表達(dá)模式分析

通過RT-PCR研究江南卷柏DHAR基因在正常生長下不同組織 (葉、菱葉、莖和根) 中的表達(dá)分布。RT-PCR后對 PCR產(chǎn)品進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明SmDHAR1和SmDHAR2基因在江南卷柏所有組織中均表達(dá) (圖3)，這表明2個(gè)DHAR基因是組成型表達(dá)基因，可能在江南卷柏的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

圖2 SmDHAR1 (A) 和SmDHAR2 (B) 的核酸及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of SmDHAR1 (A) and SmDHAR2 (B). The intron sequence is in lower case. The extron sequence is marked in gray. The stop codon is denoted by an asterix.

圖3 江南卷柏DHAR基因在不同組織中的表達(dá)模式Fig. 3 Expression of the SmDHAR1 and SmDHAR2 gene in various tissues of S. moellendorffii. 1?4: leaf, scale leaf, stem and root tissues. +: positive control using the pGEM-T constructs including target genes as PCR template; ?: negative control using RT-PCR reaction without template.

2.4 江南卷柏DHAR蛋白的三維結(jié)構(gòu)模建

圖4A展示了模擬的2個(gè)江南卷柏DHAR蛋白的三維結(jié)構(gòu)。優(yōu)化后的構(gòu)象用 Profile-3D進(jìn)行氨基酸殘基的兼容性考察，結(jié)果如圖4B所示，從圖中可以看到大部分氨基酸殘基得分都是正值，位于合理的范圍。SmDHAR1和SmDHAR2具有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 (GST) 結(jié)構(gòu)，包括2個(gè)結(jié)構(gòu)域：由α螺旋和β折疊組成類硫氧還原蛋白結(jié)構(gòu)域 (N末端結(jié)構(gòu)域)以及由多個(gè)α螺旋組成的C末端結(jié)構(gòu)域，2個(gè)結(jié)構(gòu)域由10個(gè)氨基酸組成的linker相連接。2個(gè)蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域氨基酸大約組成了蛋白全長的1/3，包括 1 個(gè) β-α-β-α-β-β-α 結(jié)構(gòu)域。C 末端結(jié)構(gòu)域占整個(gè)蛋白質(zhì)的 2/3，SmDHAR1由 6個(gè) α螺旋組成，而SmDHAR2比SmDHAR1在C末端多1個(gè)α螺旋 (圖4A黑色箭頭處)。

2.5 江南卷柏DHAR蛋白的生化特性分析

將構(gòu)建的表達(dá)載體 pET30a/SmDHAR1和pET30a/SmDHAR2分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn) SmDHAR1和SmDHAR2蛋白能在大腸桿菌 BL21中進(jìn)行可溶性表達(dá) (圖 5)。通過鎳柱親和層析純化后，獲得純化的重組蛋白 (圖5)，SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白分子量與預(yù)測的SmDHAR1和SmDHAR2蛋白大小一致。

圖4 SmDHAR1和SmDHAR2蛋白三維結(jié)構(gòu)的比較Fig. 4 Structure modelling of SmDHAR1 and SmDHAR2. (A)Structural comparison of SmDHAR1 (green) and SmDHAR2(red), N: N-terminus; C: C-terminus. (B) Evaluation of the structure of SmDHAR1 and SmDHAR2 by Profile-3D program.

圖5 SmDHAR1和SmDHAR2蛋白在大腸桿菌BL21中的表達(dá)和純化Fig. 5 Overexpression and purification of recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2. 1: protein marker; 2 and 6: total cellular extracts from induced bacteria containing recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2, respectively; 3 and 7: supernatant after ultrasonication and centrifugation of cells expressing recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2, respectively; 4 and 8:cell pellet after ultrasonication and centrifugation of cells expressing recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2,respectively; 5 and 9: the purified recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2, respectively.

DHAR是植物GST基因家族的成員，由于植物GST對多種底物如 CDNB、NDB-Cl、DHA等具有廣泛的活性[15]，所以我們分別測定了SmDHAR1和SmDHAR2蛋白對DHA、NBD-CI和CDNB三種底物的活性，結(jié)果表明，SmDHAR1和SmDHAR2對NBD-Cl和CDNB沒有活性，但是對DHA具有催化活性 (圖6)，說明江南卷柏DHAR蛋白具有脫氫抗壞血酸還原酶活性。對 DHA的催化活性測定參照Edwards等[14]的方法，純化的SmDHAR1和SmDHAR2蛋白濃度分別是0.039 mg/mL和0.655 mg/mL，反應(yīng)3 min后A265值分別是0.539和0.078 (圖6)，經(jīng)計(jì)算后 SmDHAR1和 SmDHAR2的活性分別為19.76 μmol/(min·mg) 和 0.17 μmol/(min·mg)，SmDHAR1的酶活性是SmDHAR2的116倍，說明SmDHAR1和SmDHAR2對DHA的活性有巨大的分化。

圖6 SmDHAR1和SmDHAR2的酶活性分析Fig. 6 Activity analysis of recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2.

圖7 SmDHAR1和SmDHAR2蛋白的熱力學(xué)穩(wěn)定性Fig. 7 Thermal stability of recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2.

SmDHAR1和SmDHAR2蛋白熱力學(xué)穩(wěn)定性結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示SmDHAR1和SmDHAR2蛋白的熱力學(xué)穩(wěn)定性具有較大差異。SmDHAR1在50 ℃時(shí)還保持著最高活性的 80%，這預(yù)示著SmDHAR1蛋白在 50 ℃以下都是穩(wěn)定的，表明SmDHAR1是一個(gè)熱穩(wěn)定的酶，可能在適應(yīng)高溫環(huán)境中發(fā)揮重要作用。而SmDHAR2在50 ℃時(shí)只剩50%的活性，活性隨著溫度的升高一直下降，預(yù)示著SmDHAR2蛋白熱穩(wěn)定性較低。

3 討論

抗壞血酸還原酶廣泛存在于植物的葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，對于保持植物細(xì)胞中AsA水平具有重要意義，而且廣泛地參與植物的抗逆反應(yīng)。蕨類植物約有 1.2萬多種，在植物系統(tǒng)中介于苔蘚植物和種子植物之間，分布廣泛，除沙漠外世界各地都有生長[16]。在植物漫長的演化過程中，蕨類植物是最早脫離水體束縛、最早適應(yīng)陸地生態(tài)環(huán)境和最早出現(xiàn)維管組織的類群[17]，因此在蕨類植物中研究與適應(yīng)性密切相關(guān)的DHAR基因?qū)τ诶斫庵参锏倪m應(yīng)性有重要的理論意義。在本研究中，我們從江南卷柏中克隆到2個(gè)DHAR基因，對該基因的基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與生化功能進(jìn)行了比較詳細(xì)的研究。

在我們先前的研究中發(fā)現(xiàn)DHAR基因在裸子植物白皮松和雙子葉植物楊樹中均是組成型表達(dá)基因[8,18]。最近對小麥2個(gè)DHAR基因 (TaDHAR1和TaDHAR1) 的研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)DHAR基因在小麥的各個(gè)器官中均有表達(dá)，且表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，均表現(xiàn)為在幼穗中轉(zhuǎn)錄本水平最高，在根和小花中的轉(zhuǎn)錄本水平相對較低[7]。在本研究中，利用RT-PCR并結(jié)合PCR產(chǎn)品測序，我們發(fā)現(xiàn)SmDHAR1和 SmDHAR2基因在江南卷柏所有組織中均表達(dá)(圖3)。因此這一系列研究結(jié)果預(yù)示著在蕨類植物、裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物中DHAR基因可能均是組成型表達(dá)基因，在植物的生長發(fā)育中可能發(fā)揮著重要作用。

通過蛋白質(zhì)的序列比對，我們發(fā)現(xiàn)所有 DHAR蛋白都具有CPFS的保守基序 (Motif) (圖8A)。大量研究證明CXXS基序在氧化還原酶中高度保守，在催化反應(yīng)中作為酶的催化反應(yīng)中心，CXXS基序中的第一個(gè)半胱氨酸與底物的半胱氨酸形成分子間共價(jià)二硫鍵[19]。江南卷柏SmDHAR1和SmDHAR2蛋白均含有CPFS的保守基序，位于蛋白N末端結(jié)構(gòu)域的第一個(gè) α螺旋的起始處 (圖 4A中的藍(lán)色箭頭處)。對比SmDHAR1和SmDHAR2蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SmDHAR1蛋白的CPFS保守基序中，Ser側(cè)鏈上的羥基與Pro主鏈上的羰基形成氫鍵 (圖8B)，而SmDHAR2沒有形成這個(gè)氫鍵，預(yù)示著 SmDHAR1和 SmDHAR2的活性中心的構(gòu)象可能有較大的差異，這種構(gòu)象的差異可能對酶的催化活性有重要影響，事實(shí)上，SmDHAR1的催化活性是 SmDHAR2的116倍，因此，酶學(xué)活性的結(jié)果也支持這2個(gè)酶的催化中心構(gòu)象可能有較大差異。

圖8 DHAR蛋白CPFS保守基序的序列與結(jié)構(gòu)比較Fig. 8 Sequence and structural comparison of CPFS motif in DHAR proteins. (A) N-terminal amino acid sequence alignment of DHAR protein, CPFS motif was marked in red. (B) Structural comparison of CPFS motif between SmDHAR1 and SmDHAR2, Blue dashed represent hydrogen bond.

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 (GST) 基因家族被分為 8個(gè)亞家族，分別是 DHAR、Tau、Phi、Zeta、Theta、Lambda、TCHQD 和 EF1Bγ[18]。植物 Tau、Phi和Zeta 類GST的晶體結(jié)構(gòu)已被解析，結(jié)構(gòu)顯示所有植物GST的N末端結(jié)構(gòu)域高度保守，而且主要負(fù)責(zé)和所有GST的共同底物谷胱甘肽 (GSH) 結(jié)合[15]。結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)預(yù)測的SmDHAR2與SmDHAR1蛋白的N 末端結(jié)構(gòu)域高度保守 (圖 4A)，都具有β-α-β-α-β-β-α 結(jié)構(gòu)，預(yù)示著這 2 個(gè)蛋白都能與 GSH結(jié)合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這2個(gè)蛋白都具有依賴GSH的DHA活性，因此酶學(xué)結(jié)果支持預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)。

結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)植物GST的C末端結(jié)構(gòu)域變異較大，這與GST的功能相關(guān)，因?yàn)橹参颎ST的C末端結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)結(jié)合特異性底物[18]，不同的GST能結(jié)合特定底物而發(fā)揮不同的生理功能。在本研究中，SmDHAR2與SmDHAR1蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域差異較大，SmDHAR2比SmDHAR1在C末端多1個(gè) α螺旋 (圖 4A黑色箭頭處)，而且在蛋白的第 4個(gè)與第5個(gè)α螺旋之間的Loop結(jié)構(gòu)變化較大 (圖4A紅色箭頭處)，這種C末端結(jié)構(gòu)的變化預(yù)示著這2個(gè)DHAR的功能可能不同。事實(shí)上，SmDHAR1具有較高的催化活性 (19.76 μmol/(min·mg))，而 SmDHAR2的催化活性非常低 (0.14 μmol/(min·mg))，另一方面，熱力學(xué)穩(wěn)定性分析顯示SmDHAR1比SmDHAR2蛋白更穩(wěn)定，這些生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果也預(yù)示著這2個(gè)蛋白可能存在功能上的分化。

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Molecular characterizations of two dehydroascorbate reductases from Selaginella moellendorffii

Zishuo Cheng1,3, Ting Lan1,3, Di Li2, Hailing Yang2, and Qingyin Zeng1
1 State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
2 College of Life Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
3 Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Received: February 26, 2010; Accepted: May 4, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2009AA06Z311), National Natural Science Foundation of China (No. 30770039), National Key Technology R&D Program (No. 2008BADC4B05).

Corresponding author: Ping Zheng. Tel/Fax: +86-571-86971709; E-mail: pzheng@zju.edu.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2009AA06Z311)，國家自然科學(xué)基金 (No. 30770039)，國家科技支撐計(jì)劃 (No. 2008BADC4B05) 資助。