勻漿法提?。咝б合嗌V法測(cè)定金銀花中的綠原酸

薛景嬌，和順琴，楊光宇，胡秋芬

(云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500)

勻漿法提?。咝б合嗌V法測(cè)定金銀花中的綠原酸

薛景嬌，和順琴，楊光宇，胡秋芬

(云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500)

分別用3種前處理方法對(duì)金銀花中的綠原酸進(jìn)行提取，用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè).結(jié)果表明，用勻漿法提取所需時(shí)間明顯少于熱回流提取法和超聲波提取法，采用80%的甲醇勻漿法提取金銀花中的綠原酸，提取液中的綠原酸以Waters Xterra RP18(3.9 mm×150 mm，5 μm)色譜柱為固定相，1%醋酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長345 nm.在該色譜條件下，綠原酸質(zhì)量濃度在5.0～200 μg/mL內(nèi)成良好的線性關(guān)系，樣品平均加標(biāo)回收率為118%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.5%(n=6)，結(jié)果令人滿意.

金銀花;綠原酸;勻漿法提取;高效液相色譜法

金銀花(Flos Lonicerae)為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thumb)、紅腺忍冬(Lonicera hypoinlauca Miq)、山銀花 (Lonicera confusa DC)或毛花柱忍冬(Lonicera dasystyla Rehd)的干燥花蕾或帶初開的花，可供藥用的品種達(dá)40余種，廣泛分布于全國各地［1］.金銀花忍冬花蕾中含有木犀草素、肌醇、綠原酸、異綠原酸、皂貳等.其中綠原酸和異綠原酸為主要抗菌成分［2］，綠原酸被稱為“植物黃金”.目前《中國藥典》(2005版一部)以金銀花中所含綠原酸的含量作為評(píng)價(jià)本藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)之一，它是一種由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，為抗菌消炎的主要成分，與人體血小板凝集和凝血因子的生成有關(guān)，還具有抗生育作用及對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用［3－4］.

金銀花中綠原酸的傳統(tǒng)提取方法有水提法、乙醇回流法、酶解法、動(dòng)態(tài)溫浸法、超聲波提取法、滲漉法、超濾法和離子液體微波輔助萃取法［5－10］.綠原酸含量檢測(cè)測(cè)定方法的研究報(bào)道很多，主要有紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、蒸發(fā)光散射檢測(cè)法和流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［11－15］.其中，高效液相色譜法是最常用的方法.文中研究了勻漿、超聲波提取及熱回流3種不同的前處理方法，建立了一種高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定勻漿法提取金銀花中綠原酸的方法.本方法操作簡(jiǎn)便，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn).

1 材料與方法

1.1 儀器及材料

Agilent1100高效液相色譜儀(包括二元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器，柱溫箱，Chemstation色譜工作站);IKA T25型高速勻漿機(jī)，Elma D－78224型超聲儀.綠原酸對(duì)照品(購于瑞士Fluka公司)，使用時(shí)用80%甲醇配成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，所需標(biāo)準(zhǔn)工作液由該儲(chǔ)備液稀釋得到，甲醇、乙醇、醋酸為分析純，所用水為高純水.樣品為粉碎后過0.441 mm篩孔的金銀花.

1.2 色譜條件

色譜柱:Waters XTerra RP 18(3.9mm ×150 mm，5μm);流動(dòng)相(A:純甲醇，B:1%醋酸);梯度洗脫條件(0～6 min:100% ～70%;6～12 min:70% ～20%;12～15 min:20%;15～17 min:20%～100%);流速:0.8 mL/min;柱溫:20℃;檢測(cè)波長:345 nm.

1.3 樣品前處理

1)80%甲醇勻漿提取.準(zhǔn)確稱取0.25 g樣品，加入50 mL 80%甲醇水溶液，在IKA T25型高速勻漿機(jī)20 000 r/min的條件下，進(jìn)行2.0 min勻漿提取，取5.0 mL的提取液用0.25 μm針頭過濾器過濾，進(jìn)樣 10.0 μL 進(jìn)行分析;

2)熱回流提取.準(zhǔn)確稱取0.25 g樣品，加入50 mL 80%甲醇水溶液，在50℃的條件下，進(jìn)行40 min回流提取，取5.0 mL 的提取液用0.25 μm 針頭過濾器過濾，進(jìn)樣10.0 μL 進(jìn)行分析;

3)超聲波提取.準(zhǔn)確稱取0.25 g樣品，加入50 mL 80%甲醇水溶液，用Elma D－78224型超聲儀，進(jìn)行30 min超聲提取，取5.0 mL的提取液用0.25 μm 針頭過濾器過濾，進(jìn)樣 10.0 μL 進(jìn)行分析;

4)80%乙醇勻漿提取.準(zhǔn)確稱取0.25 g樣品，加入50 mL 80%乙醇水溶液，在IKA T25型高速勻漿機(jī)20 000 r/min 的條件下，進(jìn)行 2.0 min ，取 5.0 mL的提取液用 0.25 μm針頭過濾器過濾，進(jìn)樣10.0 μL 進(jìn)行分析;

5)高純水勻漿提取.準(zhǔn)確稱取0.25 g樣品，加入50 mL高純水，在IKA T25型高速勻漿機(jī)20 000 r/min的條件下，進(jìn)行 2.0 min ，取 5.0 mL 的提取液用 0.25 μm 針頭過濾器過濾，進(jìn)樣 10.0 μL 進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

綠原酸屬于有機(jī)酸類物質(zhì)，在HPLC測(cè)定時(shí)易發(fā)生前伸或拖尾峰，流動(dòng)相加入酸可以改善這種現(xiàn)象.用1%的醋酸，進(jìn)行梯度洗脫，可得到較好的色譜峰形［16］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇1%的醋酸為流動(dòng)相.綠原酸在345 nm處有最大吸收，因此實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)波長為345 nm.在上述條件下，標(biāo)樣和實(shí)際樣品的色譜圖見圖1.

2.2 樣品的制備

發(fā)現(xiàn)利用勻漿法提取綠原酸，綠原酸在3種提取液中的溶解度依次是:80%甲醇＞80%乙醇＞高純水，因此本實(shí)驗(yàn)中采用80%的水－甲醇提取.分別用1.3中1)、2)和3)方法制備樣品溶液，結(jié)果表明:把0.25 g樣品中的綠原酸提出，超聲波提取需要30 min，熱回流提取需要40 min，而高速勻漿提取只需2.0 min，在該條件下，HPLC所測(cè)3種前處理方法的峰面積見表1.高速勻漿法效率明顯高于熱回流提取和超聲波提取法;因此本實(shí)驗(yàn)選用高速勻漿法的前處理方法.

表1 3種前處理方法的峰面積

2.3 工作曲線

分別配制 200，100，50，10，5 μg/mL 的綠原酸標(biāo)樣，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積，以綠原酸的質(zhì)量濃度C(μg/mL)對(duì)峰面積(A)進(jìn)行回歸，結(jié)果表明，綠原酸在5.0～200 μg/mL和峰面積成良好的線性關(guān)系，回歸方程為:

2.4 精密度試驗(yàn)

在上述色譜條件下，取金銀花樣品連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算6次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD=1.8%，表明進(jìn)樣方式和儀器精密度良好.

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

上述色譜條件下，精密稱取同一批號(hào)的金銀花樣品6份，進(jìn)樣測(cè)得綠原酸峰面積，RSD=2.1% ，方法重現(xiàn)性好.

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

相同樣品7份，其中1份為對(duì)照，另外6份分別加入100 μg/mL的綠原酸標(biāo)樣1 mL，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，樣品平均加標(biāo)回收率為118%，RSD=4.5%.

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)采用了勻漿法、超聲波和熱回流3種前處理方法對(duì)金銀花中的綠原酸進(jìn)行提取.實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果表明，勻漿提取法具有提取完全、效率高、能耗低等特點(diǎn)，所需時(shí)間明顯少于熱回流和超聲波提取法，提取后可直接進(jìn)樣分析，樣品前處理步驟簡(jiǎn)單，處理過程中目標(biāo)物的損失少，方法回收率和精密度均很高.本方法適用于金銀花中綠原酸含量的分析.

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(責(zé)任編輯王 琳)

Determination of Chlorogenic Acid Extracted from Flos Lonicerae with High－Speed Homogenization and High Performance Liquid Chromatography

XUE Jing-jiao，HE Shun-qin，YANG Guang-yu，HU Qiu-fen
(Key laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry，State Ethnic Affairs commission ＆ Ministry of Education，School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China)

In this paper，three sample preparation for determination of chlorogenic acid in flos lonicerae was studied.Test results showed that the time spent on high － speed homogenization extraction was obviously less than the ultrasonic extraction and the hot reflux extraction.The chlorogenic acid was extracted from samples by high－speed homogenization with 80%methanol solution.The extract was separated on a Waters Xterra RP18 column(3.9mm×150 mm，5 μm)using 1%acetic acid as the mobile phase with gradient elution，the flow rate was 0.8 mL/min.The detection wavelength was 345 nm.Under this condition，the linear of chlorogenic acid was in the range of 5.0—200 μg/mL.The average recoveries of the samples were 118%，and the relative standard deviation was 4.5%(n=6).This method for the extraction and determination of chlorogenic acid in flos lonicerae has good results.

flos lonicerae;chlorogenic acid;high-speed homogenization;HPLC

O 658

A

1672－8513(2011)02－0086－03

10.3969/j.issn.1672 －8513.2011.02.002

2010－10－09.

國家自然科學(xué)基金(20961012);民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(MJY090102).

薛景嬌(1984－)，女，碩士研究生.主要研究方向:民族藥質(zhì)量評(píng)價(jià).

胡秋芬(1973－)，女，博士，教授.主要研究方向:藥物質(zhì)量控制.