不同強度運動對AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠MEF2/G LUT4 DNA結(jié)合活性的影響

龔豪杰 ,謝 謹 ,張 楠 ,姚 璐 ,張 纓

不同強度運動對AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠MEF2/G LUT4 DNA結(jié)合活性的影響

龔豪杰 ,謝 謹 ,張 楠 ,姚 璐 ,張 纓

肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)是一種最早在骨骼肌管核發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì),具有DNA結(jié)合活性。用電泳遷移法(EMSA)檢測到葡萄糖運載體 4(glucose transporter 4,GLUT4)啟動子上存在MEF2的結(jié)合位點[18,28,33],它可以和相關的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合共同調(diào)節(jié) GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄。同樣利用 EMSA法,Mc-Gee SL等[21]的研究發(fā)現(xiàn),7名受試者用(75±2)%˙VO2,自行車運動60 min后,MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性增加了兩倍,并伴隨著 GLUT4基因和蛋白表達的增多,推測運動通過提高MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性而提高GLUT4基因和蛋白的表達,但機制尚不清楚。近年來有研究[11]發(fā)現(xiàn),通過AICAR(5’-aminoimidazole-4carboxamide-riboside,AMPK藥物激活劑)激活 AMPK(5’-AMP activated protein kinase)可以提高 MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性,而提高骨骼肌 GLUT4基因和蛋白的表達,提示了“AMPK激活-MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性提高-GLUT4基因和蛋白表達增多”這一通路的存在。由于運動同樣激活 AMPK[7,32],推測 AMPKα2可能參與調(diào)解了運動誘導的MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因和蛋白表達的提高。

然而,值得注意的是,這只是在離體實驗中檢測到的結(jié)果,其不一定能真實地反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA結(jié)合的狀況[4],而且,AICAR是介導嘌呤生物合成的物質(zhì),并非AMPK的特異激活劑[35],提示了這些結(jié)果可能具有一定的局限性。本研究旨在研究不同強度跑臺運動對AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠和 AMPKα2基因敲除骨骼肌MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性以及 GLUT4基因表達的影響,以探討運動提高骨骼肌 MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗對象及分組

健康2月齡 C57BL/6J野生(Wild-type,WT)小鼠、AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因(over-expression,OE)和AMPKα2基因敲除鼠(Knockout,KO)各30只(不同基因型小鼠AMPKα2蛋白Western檢測結(jié)果見圖1)[2]。體重18±2 g,分籠飼養(yǎng),野生小鼠3～4只每籠,AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠和AMPKα2基因敲除鼠每籠1只,室內(nèi)溫度20℃～25℃,相對濕度50%～70%,每天光照12 h,國家標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng),自由進食和飲水。

1周的適應性飼養(yǎng)并進行1～2次適應性跑臺練習后,野生鼠、AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠和 AMPKα2基因敲除鼠,分別按體重隨機分為安靜對照(control,C)、低強度跑臺運動組(low intensity,L)、高強度跑臺運動組(high intensity,H)3 組 ,共 9組 ,每組 10只(表1)。

圖1 本研究不同基因狀態(tài)鼠AMPKα2蛋白表達圖譜Figure 1. Representative Immunoblots of AMPKα2 Protein in Various G enetypes

表1 本研究實驗分組一覽表Table 1 Experiment G roups

1.2 運動方案和取材

運動組運動前禁食12 h,安靜對照組取材前禁食12 h。運動組小鼠采用坡度為0°的1 h跑臺運動。低強度跑臺運動組跑臺速度為12 m/min,高強度跑臺運動組跑臺速度為20 m/min[1]。運動后 3 h乙醚麻醉,取股四頭肌[2],冰水中除去可見血液、脂肪和筋膜,錫紙包裹,標記,迅速置于液氮中,隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.3 儀器、試劑與指標測定方法

1.3.1 mRNA表達

骨骼肌 GLUT4 mRNA表達量采用實時熒光定量(Real Time-PCR)兩步法。小鼠股四頭肌50～100 mg,Trizol試劑(Invitrogen)依據(jù)說明書提取總 RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜確定 RNA完整性(圖2),并用紫外分光光度儀檢測RNA的濃度和純度后,進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)部分。杭州朗基科學儀器有限公司生產(chǎn)的 PCR擴增儀,型號 MG96+/Y,RT-PCR試劑盒由 Promega公司合成。具體反應條件是:70℃5 min;42℃1 h;70℃15 min。合成的cDNA于-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩Ｓ捎?mRNA的不穩(wěn)定性,以上步驟在取材后2天內(nèi)完成。

作者單位:北京體育大學,北京100084

圖2 本研究 RNA電泳圖Figure 2. Representative G els of RNA

7300熒光定量PCR儀和熒光燃料反應體系(SYBRRGreen PCR Master MIX)均購自美國應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems),引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司,根據(jù)參考文獻及基因文庫設計,并經(jīng)BLAST驗證PCR產(chǎn)物的惟一性,具體上下游引物序列為:Actina,5’CAC AGC CTG GAT GGC TACGT3’;Actins,5’AGG CAA ACC GTG AAA AGA TG3’;GLUTa,5’CTA CCC AGC CAC GTT GCA TT3’;GLUTs,5’CTT GGC TCC CTT CAG TTT GG3’。反應體系為 20μl,分別為:SYBR Green PCR Master Mix(2×)10μL;PCR Forward Primer(上游引物 ,5μM)1μl;PCR Reverse Primer(下游引物 ,5μM)1μl;cDNA 模板 2μl;ddH2O 6μl。實時熒光量數(shù)值由實時定量PCR儀(Step One實時熒光定量 PCR系統(tǒng),Applied Biosystems)讀取,結(jié)果數(shù)值由儀器自帶軟件分析(Step One Software v2.0,Applied Biosystems)。目標基因表達結(jié)果以比較CT法相對定量。目標基因=2-△△CT[19]。

1.3.2 蛋白表達

AMPK(THr72)磷酸化水平、GLUT4蛋白含量采用免疫印跡(Western Blot)法?？偟鞍滋崛》椒?股四頭肌約40 mg置于 400μl蛋白裂解液中(50 mM Tris-Cl p H7.4～8.0,150 mM NaCl,5 mM EDTA,1%Triton-x-100,4μl 100×蛋白酶抑制混合物),4℃下電動勻漿機充分勻漿,4℃14 000 rpm 50 min取上清液至-80℃冰箱保存。蛋白酶抑制劑混合物購于 Pierce公司。核蛋白提取采用pierce核蛋白提取試劑盒,股四頭肌約40 mg置于400μl CER1溶液中,4℃下電動勻漿機充分勻漿,靜置10 min加入預冷的11μl CER2溶液,振蕩器最高速震蕩5 s,冰上 10 min,4℃16 000 rpm 10 min,棄上清液,200μl NER溶液溶解沉淀,置于冰上靜置10 min并混勻3～4次,4℃18 000 rpm 10 min,上清部分為核蛋白,于-80℃冰箱保存。

表2 本研究蛋白測定試劑配置一覽表Table 2 Preparation of Diluted Albumin(BSA)Standards

蛋白含量測定采用pierce公司的BCA蛋白定量試劑盒。制作標準曲線的不同濃度的牛血清蛋白的反應試劑配制方法見表2,待測樣品5倍稀釋(5μl待測樣品+20 μl PBS),BCA工作液按 50體積BCA試劑 A加1體積BCA試劑B(50∶1)配制。樣品孔為200μl BCA工作液+25μl稀釋過待測樣品,標準孔為200μl BSA工作液+25μl不同梯度的牛血清蛋白反應試劑。各孔OD值由酶標儀讀取,并由自帶分析軟件繪制標準曲線(圖3)和濃度分析。

圖3 本研究蛋白濃度測定標準曲線圖Figure 3. Standard Curve for Determine the Protein Concentration

依據(jù)蛋白含量調(diào)整蛋白上樣量后,10%聚丙烯酰胺凝膠分離,再轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(47 mm 0.45u)上,5%的牛清白蛋白封閉 30 min,一抗過夜 (P-AMPKα1/2(THr72)rabbit polyclonal IgG、GLUT4 rabbit polyclonal IgG:Santa Cruz Biotechnology);二抗 (Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody:Cell Signaling Technology)和內(nèi)參(β-actin rabbit polyclonal IgG,Santa Cruz Biotechnology)1 h,曝光前加入發(fā)光液(ECL Western Blotting Substrate,Pierce)反應1 min,暗室曝光至 X光片(Kodak)。生物電泳圖像分析軟件(FR-980 Smart View,復日科技)拍照,Image J軟件讀取條帶積分灰度值,結(jié)果用目的蛋白積分灰度值與內(nèi)參積分灰度值的比值表示。

1.3.3 MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性

轉(zhuǎn)錄因子MEF2與 GLUT4 DNA結(jié)合活性采用染色質(zhì)免疫沉淀法(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)。股四頭肌約40mg,液氮研磨后1%甲醛室溫交聯(lián)目的蛋白和相應的基因組,1.25M甘氨酸終止交聯(lián)反應,預冷PBS洗 3次 ,預冷 cell lysis buffer[10 mM HEPES-KOH(p H 7.9),10 mM KCl,1 mM EDTA(p H 8.0),protease inhibitors.]冰上孵育 10 min,4℃5 000 rpm 5 min,棄上清液,沉淀用預冷 nuclei lysis buffer[50 mM Tris-HCl(p H 8.0),10 mM EDTA,1%SDS,protease inhibitors]溶解,冰上靜置 10 min,超聲處理(power 30%,10×10s),以剪切基因組DNA,剪切效果通過DNA瓊脂糖電泳檢測(圖4)。4℃14 000 rpm 10 min取上清液(約200 μl)分裝3管,分別為 IP樣品80μl,Igg陰性對照樣品80 μl,input樣品 40μl。

圖4 本研究DNA剪切效果圖Fig 4 Representative G els of Sonication Products

通過蛋白含量(方法同上)調(diào)整 IP量并由 IP buffer(20 mM Tris-HCl p H 7.2,100 mM NaCl,10%glycerol,0.1%NP-40,1 mM EDTA.protease inhibitors)補足至1.5 ml,每管加入 MEF2A抗體1μg(Rabbit polyclonal to MEF2A:Santa Cruz Biotechnology),4℃緩慢擺動混勻過夜。同樣有1管加入無關的抗體(IgG)作為陰性對照。60μl Protein A/G PLUS-Agarose(Santa Cruz Biotechnology),4℃緩慢混勻90 min,沉淀一抗識別的蛋白或相應的復合物,4℃2 500 rpm 1 min棄上清液,沉淀用 IP buffer洗滌 3次,IP washing buffer(20 mM Tris-HCl p H 7.2,100 mM NaCl,0.2%NP-40,1 mM EDTA)洗滌(室溫搖床孵育3～5 min,14 000 rpm 3 min,棄上清液)4次后 ,150μl elution buffer(50 mM NaHCO3,1%SDS)洗脫3～5 min,4℃14 000 rpm 3 min,取上清液(含抗體/蛋白/DNA復合物),重復1次,合并上清液(共300μl)。300μl上清加入12μl 5M NaCl,65℃加熱4 h,去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。作為Input的10μl樣品,加入1μl 5M NaCl,65℃加熱4 h,同樣用于去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。2.5倍體積無水乙醇,-20℃沉淀過夜。

4℃14 000 rpm 10 min,棄上清液,1 ml 70%乙醇洗滌沉淀,4℃14 000 rpm 10 min,棄上清,風干(5～10 min)。100μl TE buffer(10 mM Tris,8.1,1 mM EDTA)重懸DNA沉淀,加入 11μl 10×Proteinase K buffer(50 mM Tris-Cl p H 7.5,10 mM EDTA,0.3%SDS),1μl 19 mg/ml蛋白酶 K,55℃孵育 60 min。加入 290μl TE混勻后,等體積 Tris平衡苯酚,4℃12 000 rpm 5 min,取上清液,等體積氯仿,4℃12 000 rpm 5 min,取上清液,并加入 40μl 3M NaAc,5μg tRNA,5μg glycogen,2.5倍體積無水乙醇,-20℃沉淀過夜。4℃12 000～14 000 rpm 20 min,棄上清液,1 ml 70%乙醇洗滌沉淀,4℃14 000 rpm 5 min,棄上清液 ,風干 (15～20 min)。100μl TE buffer重懸DNA沉淀,用于 PCR檢測。

表3 本研究引物序列一覽表Table 1 G ene Primer Sequences for PCR

根據(jù)文獻設計引物以擴增包含(+primer MEF2A)和未包含(-primer MEF2A)轉(zhuǎn)錄因子 MEF2A與GLUT4啟動子結(jié)位點(CTAAAATAG)的片段,具體序列見表3。PCR分別擴增 IP樣品,IgG對照樣品及input樣品包含(擴增效果見圖5)和未包含(擴增效果見圖6)目標轉(zhuǎn)錄因子MEF2A與 GLUT4啟動子結(jié)位點的基因片段,并 2%瓊脂糖凝膠分別檢測擴增效果。實時定量PCR測定樣品DNA含量,步驟同上。目標基因表達結(jié)果以比較CT法相對定量。

圖5 本研究PCR擴增效果圖(+primer MEF2A)Figure 5. Representative gels of PCR products(+primer MEF2A)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

圖6 本研究PCR擴增效果圖(-primer MEF2A)Fig 6 Representative gels of PCR products(-primer MEF2A)

圖7 本研究P-AMPK蛋白表達圖譜Figure 7. Representative Immunoblots of P-AMPK in Various G roups

2 實驗結(jié)果

2.1 AMPKα(THR172)磷酸化水平

由圖8看出,無論是野生鼠,AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠,還是AMPKα2基因敲除鼠,1 h不同強度跑臺運動后,骨骼肌AMPKα(THr172)磷酸化水平與常氧對照組相比均顯著升高,野生鼠和 AMPKα2基因敲除鼠高強度跑臺運動組 AMPKα(THR172)磷酸化水平與低強度跑臺運動組無顯著差異,而 AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠高強度跑臺運動組骨骼肌AMPKα(THr172)磷酸化水平顯著高于低強度跑臺運動組。AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠安靜對照組骨骼肌AMPKα(THr172)磷酸化水平與野生鼠安靜對照組相比均無顯著差異,而低強度跑臺運動組和高強度跑臺運動組均顯著高于野生鼠。AMPKα2基因敲除鼠與野生鼠相比,無論是安靜對照組,低強度跑臺運動組,還是高強度跑臺運動組,AMPKα(THr172)磷酸化水平均顯著低于野生鼠。

2.2 MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性

由圖9看出,無論是野生鼠,AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠,還是AMPKα2基因敲除鼠,1 h不同強度跑臺運動后,MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性與安靜對照組相比均顯著升高,野生鼠和 AMPKα2基因敲除鼠高強度跑臺運動組骨骼肌MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性與低強度跑臺運動組無顯著差異,AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠高強度跑臺運動組骨骼肌MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性顯著高于低強度跑臺運動組。AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比,安靜對照組無顯著差異,而無論是低強度跑臺運動組,還是高強度跑臺運動組骨骼肌 GLUT4基因表達量均顯著高于野生鼠。AMPKα2基因敲除鼠與野生鼠相比,安靜對照組無顯著差異,而無論是低強度跑臺運動組,還是高強度跑臺運動組骨骼肌 GLUT4基因表達量均顯著低于野生鼠。

圖8 本研究各組小鼠AMPKα(THR172)磷酸化水平圖Fig 8 AMPKα-Thr172 Phosphorylation(P)Activity in Various G roups

圖9 本研究各組小鼠骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2/GTUT4 DNA結(jié)合活性圖Fig 9 Amount of MEF2A that w as Bound to the G lut4 Promoter in Various G roups

2.3 GLUT4基因表達

由圖10看出,無論是野生鼠,AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠,還是AMPKα2基因敲除鼠,1 h不同強度跑臺運動后,骨骼肌 GLUT4基因表達量與安靜對照組相比均顯著升高,野生鼠和AMPKα2基因敲除鼠高強度跑臺運動組骨骼肌 GLUT4基因表達量與低強度跑臺運動組無顯著差異,AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠高強度跑臺運動組骨骼肌GLUT4基因表達量顯著高于低強度跑臺運動組。AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比,安靜對照組無顯著差異,而無論是低強度跑臺運動組,還是高強度跑臺運動組,骨骼肌 GLUT4基因表達量均顯著高于野生鼠。AMPKα2基因敲除鼠與野生鼠相比,無論是安靜對照組,低強度跑臺運動組,還是高強度跑臺運動組,均無顯著差異。

圖10 本研究各組小鼠 G LUT4基因相對表達量圖Figure 10. G LUT4 mRNA content in various groups

3 分析討論

3.1 不同強度跑臺運動對野生鼠骨骼肌MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達的影響

早在1994年,Liu ML等利用 GLUT4螢火素酶報告基因轉(zhuǎn)染肌細胞,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染位于 GLUT4啟動子區(qū)域,長度為103對(-522/-420)堿基片段,熒光素酶活性增加6倍,說明其片段對于 GLUT4的表達有著重要作用。通過進一步對此片段分析,發(fā)現(xiàn)-466/-457堿基(GCTAAAAATAG)和 MEF2 DNA結(jié)合位點相似,而突變這一位點的3個堿基(GCTAAGGCTAG),伴隨著熒光素酶活性的消失[18]。這一發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因鼠模型中得到了支持,Thai MV等的研究發(fā)現(xiàn)突變 GLUT4 DNA上MEF2結(jié)合位點(GCTGGGCCCAG),伴隨著 GLUT4 mRNA表達的降低。通過電泳遷移法(EMSA),他們的研究進一步發(fā)現(xiàn),鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠,由于骨骼肌 MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性降低,GLUT4 mRNA含量下降。而用胰島素刺激鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠骨骼肌細胞后,發(fā)現(xiàn) MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性恢復,而 GLUT4 mRNA含量恢復[33],提示了 MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性的變化是影響 GLUT4基因轉(zhuǎn)錄的重要環(huán)節(jié)。

運動能夠提高 GLUT4基因和蛋白的表達[1,9,16],那么運動對MEF2-GLUT4 DNA結(jié)合活性產(chǎn)生什么樣的影響呢?同樣利用 EMSA法,McGee SL等[21]的研究發(fā)現(xiàn),7名受試者用(75±2)%˙VO2,自行車運動60 min后,MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性增加了2倍,并伴隨著GLUT4蛋白表達的增多,提示了運動可能通過提高MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性而提高 GLUT4基因和蛋白表達。

值得注意的是,EMSA實驗方法獲得的結(jié)果是體外的目標蛋白和預期基因組DNA片段的結(jié)合結(jié)果,其不一定能真實地反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA結(jié)合的狀況。EMSA實驗中,轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點(順式作用元件)可以和轉(zhuǎn)錄因子(反式作用因子)自由結(jié)合,而在體情況下,DNA是和組蛋白依靠靜電力結(jié)合在一起,DNA和組蛋白的結(jié)合限制了轉(zhuǎn)錄因子和DNA結(jié)合位點的結(jié)合。事實上,在體情況下,轉(zhuǎn)錄因子和DNA結(jié)合位點的結(jié)合通常發(fā)生在輔因子修飾組蛋白(磷酸化,甲基化,乙?；?染色質(zhì)結(jié)構改變并暴露DNA結(jié)合位點之后[4]。本研究通過染色質(zhì)免疫沉淀ChIP法(CHIP檢測可以獲得在體的目標蛋白和預期基因組DNA片段的結(jié)合結(jié)果)發(fā)現(xiàn),野生鼠1 h不同強度跑臺運動后 GLUT4基因表達量顯著增加的同時伴隨著MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性的顯著增加,為運動通過提高 MEF2 DNA結(jié)合活性而提高GLUT4表達提供了進一步的證據(jù)。

3.2 不同強度跑臺運動對AMPK高表達轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達的影響

AMPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,能感知細胞能量代謝狀態(tài)的改變,并通過影響細胞物質(zhì)代謝的多個環(huán)節(jié)維持細胞能量供求平衡。它是一個異源三聚體蛋白,由α、β和γ3個亞單位組成,每個亞基都有不同的亞型,分別為α1、α2、β1、β2、γ1、γ2 和γ3。α亞單位是激酶的主要催化部位,負責將ATP的磷酸傳遞至目標蛋白,α亞單位中的數(shù)個位點(蘇氨酸172、蘇氨酸258、絲氨酸485等)均可被磷酸化。其中蘇氨酸172位點是AMPK上游激酶(AMPKK)磷酸化的重要位點,它是 AMPK活性的關鍵[5],而β和γ亞單位則是該酶的調(diào)節(jié)成分。

作為細胞能量代謝變化的感受器,近年來離體實驗發(fā)現(xiàn),采用 AMPK的藥理激活劑 AICAR激活 AMPK可以提高骨骼肌 GLUT4基因和蛋白[12,14,27,36]的表達,且AMPKα2基因敲除或AMPK亞基失火均能阻斷 AICAR孵育誘導的 GLUT4含量增加[10,15]。Holmes BF等[11]的最新研究結(jié)果顯示,通過 AICAR激活 AMPK可以提高MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性,而提高骨骼肌 GLUT4基因和蛋白的表達。由于AMPK能夠被運動中ATP/AMP比值變化所激活[7,32],提示了AMPK可能參與調(diào)節(jié)了運動誘導的MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性和 GLUT4表達的增加。同樣值得注意的是,這只是在離體實驗中檢測到的結(jié)果,其不一定能真實地反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA結(jié)合的狀況[4],而且,AICAR是介導嘌呤生物合成的物質(zhì),并非AMPK的特異激活劑[35],提示了這些結(jié)果可能具有一定的局限性。

本實驗中,野生鼠1 h不同強度跑臺運動后,骨骼肌AMPKα(THr172)磷酸化水平與安靜對照組相比均顯著升高,AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比,雖然安靜對照組無顯著差異,而無論是低強度跑臺運動組還是高強度跑臺運動組,骨骼肌 AMPKα(THr172)磷酸化水平均顯著高于野生鼠,證明了本實驗所設計的2種不同強度的運動方式,均成功激活了 AMPK,同時也說明了,在本實驗設計的2種不同運動強度下,AMPKα2基因的高表達影響了AMPKα(THr172)磷酸化水平。而采用此2種不同強度運動方式,實驗發(fā)現(xiàn),AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠1 h不同強度跑臺運動后,其骨骼肌細胞核內(nèi) MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達量,均比野生鼠增加更為顯著,提示了 AMPKα2參與調(diào)節(jié)了運動誘導的MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達量的升高。而本實驗中 AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠高強度跑臺運動組 AMPKα(THr172)磷酸化水平,細胞核內(nèi)MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達量均顯著高于低強度跑臺運動組,可能為此推測提供了進一步證據(jù)。

3.3 不同強度跑臺運動對 AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌MEF2/G LUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達的影響

本實驗中,雖然 AMPKα2基因敲除鼠1 h不同強度跑臺運動后,骨骼肌 AMPKα(THr172)磷酸化水平與安靜對照組相比均顯著升高,但無論是安靜對照組,低強度跑臺運動組,還是高強度跑臺運動組,AMPKα2基因敲除鼠,AMPKα(THr172)磷酸化水平均顯著低于野生鼠,說明了在本實驗設計的2種不同運動強度下,AMPKα2基因的敲除影響了 AMPKα(THr172)磷酸化水平。同樣,采用此2種不同強度運動方式,實驗發(fā)現(xiàn),AMPKα2基因敲除鼠運動組骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性,顯著低于野生鼠,進一步證明 AMPKα2參與調(diào)節(jié)了運動誘導的MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性的增加。

另外實驗發(fā)現(xiàn),雖然 1 h不同強度跑臺運動后AMPKα2基因敲除小鼠 MEF2/GTUT4 DNA結(jié)合活性均顯著低于野生鼠,但與安靜對照組相比,仍顯著增加。近年來研究發(fā)現(xiàn),組蛋白翻譯后修飾可以通過改變真核細胞染色質(zhì)基本結(jié)構單位核小體的結(jié)構影響基因轉(zhuǎn)錄[6,8]。調(diào)節(jié)組蛋白乙?；潭鹊氖且粚┠芟嗷マ卓沟墓惨种菩院凸布せ钚越Y(jié)合蛋白:組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)和組蛋白乙?；?histone acetyl transferases,HATs)[23],其中 HDACs與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,通過組蛋白 N端賴氨酰的去乙?；?使組蛋白帶正電荷,被吸引到帶負電荷的DNA中,產(chǎn)生一種緊密的染色質(zhì)結(jié)構,抑制轉(zhuǎn)錄因子所靶向的目標基因的轉(zhuǎn)錄[3]。相反,HATs和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,使賴氨酰乙酸化移走它們的正電荷,從而導致開放的染色質(zhì)結(jié)構,加速轉(zhuǎn)錄因子所靶向的目標基因的轉(zhuǎn)錄[34]。研究者發(fā)現(xiàn),利用細胞鈣離子調(diào)節(jié)子 Caffeine孵育骨骼肌細胞能提高鈣離子的濃度、激活鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(calcium-calmodulin depen-dent protein kinase,CAMK),分離 HDACs與轉(zhuǎn)錄因子MEF2(分離結(jié)果是失去 HDACs對組蛋白N端賴氨酰的去乙?；饔?并出核[2,20],提高MEF2 DNA結(jié)合活性[25,30],而這些變化在含有丹曲林(抑制細胞質(zhì)鈣離子濃度的增加)或 KN93(一種 CAMK活性的抑制劑)培養(yǎng)基中骨骼肌細胞中受到抑制[25,30,31],而運動同樣引起細胞鈣離子濃度增加并能夠激活CAMK[29,30],推測CAMK也可能參與調(diào)節(jié)了運動誘導的 MEF2/GTUT4 DNA結(jié)合活性提高,但具體機制還有待進一步研究。

值得注意的是,雖然 1 h不同強度跑臺運動后AMPKα2基因敲除小鼠 AMPKα活性均顯著低于野生鼠,1 h不同強度跑臺運動后 AMPKα2基因敲除小鼠MEF2/GTUT4 DNA結(jié)合活性顯著低于野生鼠,但AMPKα2基因的缺失并不影響運動誘導的 GLUT4基因含量變化。Burton等的研究也發(fā)現(xiàn),雖然AMPKα2基因敲除能阻斷 AICAR孵育誘導的 GLUT4 mRNA含量增加,但野生型小鼠和 AMPKα2亞基失活小鼠(AMPKDN)經(jīng)過6 h跑臺運動(一次 3 h,間隔 1 h)后骨骼肌GLUT4 mRNA含量無顯著性差異[13]。這些可能提示了,雖然AMPKα2對 MEF2/GTUT4 DNA結(jié)合活性有調(diào)節(jié)作用,但其并不是運動誘導 GLUT4基因和蛋白含量變化的唯一通路,運動還可以募集其他的信號通路調(diào)節(jié)GLUT4基因和蛋白含量變化。

有研究者發(fā)現(xiàn),利用 Caffeine孵育激活骨骼肌細胞CAMK,上調(diào) GLUT4基因和蛋白的表達,且這些變化在含有丹曲林或 KN93培養(yǎng)基中骨骼肌細胞中受到抑制[26],且用 AICAR和 Caffeine共同孵育骨骼肌細胞GLUT4 mRNA表達水平與使用單一的AICAR或 Caffeine孵育時的水平無顯著性差異[17],提示 AMPK和CAMK介導的信號通路在調(diào)節(jié)骨骼肌 GLUT4表達過程中可能相互聯(lián)系[24],由于運動能夠激活 CAMK[29,30],推測 CAMK也可能參與調(diào)節(jié)了運動誘導 GLUT4表達的提高。但最新的研究結(jié)果顯示,CAMK調(diào)節(jié) GLUT4基因表達,同樣是通過提高 MEF2/GLUT4結(jié)合活性[25,30,31]。雖然本實驗并沒有測小鼠骨骼肌CAMK的活性,而本實驗中1 h不同強度運動后 AMPKα2基因敲除鼠 MEF2/GLUT4結(jié)合活性顯著低于野生鼠,可能提示了本實驗中1 h不同強度運動后 AMPKα2基因敲除鼠 GLUT4基因表達的增加并不是由CAMK調(diào)節(jié),具體機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

1.野生鼠1 h不同強度跑臺運動后 GLUT4基因表達量顯著增加的同時,伴隨著 MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性的顯著增加,為運動通過提高MEF2 DNA結(jié)合活性而提高 GLUT4表達提供了進一步的證據(jù)。

2.AMPKα2高表達鼠 1 h不同強度跑臺運動后,AMPKα(THr172)磷酸化水平顯著高于野生鼠,MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性,GLUT4基因和蛋白表達量均顯著高于野生鼠,提示了“運動-AMPK激活-核內(nèi) MEF2表達增多-MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性增加-GLUT4基因表達增多”這樣一條通路的存在。

3.AMPKα2基因敲除小鼠和野生鼠相比,雖然 1 h不同強度跑臺運動后 AMPKα(THr172)磷酸化水平及MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性均顯著低于野生鼠,但AMPKα2基因的缺失,并沒有影響運動誘導的 GLUT4基因含量變化,提示了在 AMPKα2基因缺失情況下,運動還可以募集其他的信號通路 GLUT4基因和蛋白含量的調(diào)節(jié)作用。

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Effects of Exercise with Different Intensity on the Content of MEF2A Bounding to the G LUT4 Promoter in Skeletal Muscle of AMPKα2-WT/KO/OE Mice

GONG Hao-jie,XIE Jin,ZHANG Nan,YAO Lu,ZHANG Ying

目的:研究不同強度跑臺運動對 AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠 MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達的影響,以探討運動提高骨骼肌MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達可能機制。方法:野生小鼠和AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因小鼠,AMPKα2基因敲除小鼠各30只,分別隨機分為安靜對照組、低強度(12m/min)跑臺運動組和高強度(20/min)跑臺運動組。運動時間均為1 h。運動后3 h取材。Western blot法測定AMPK(THr72)磷酸化水平。CHIP法測定 MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性。Real-Time PCR法測定 GLUT4 mRNA含量。結(jié)果:1)野生鼠1 h不同強度跑臺運動后,GLUT4基因表達量顯著增加的同時,伴隨著骨骼肌核內(nèi)MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性的顯著增加;2)AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因鼠1 h不同強度跑臺運動后,其骨骼肌細胞核內(nèi)MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達量,均比野生鼠增加更為顯著;3)AMPKα2敲除鼠1 h不同強度跑臺運動后,骨骼肌核內(nèi) MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性顯著低于野生鼠,但 GLUT4基因表達量與野生鼠相比沒有顯著差異。結(jié)論:1)運動通過提高MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性而提高 GLUT4表達;2)AMPKα2參與調(diào)解了運動誘導的MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性及 GLUT4基因表達量的升高;3)雖然 AMPKα2參與調(diào)節(jié)了運動誘導的MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性的提高,但機體還可以募集其他的信號通路代償AMPKα2對 GLUT4表達的調(diào)節(jié)作用。

AMPKα2高表達轉(zhuǎn)基因小鼠;AMPKα2基因敲除小鼠;MEF2;GLUT4;動物實驗

Purpose:The role of AMPK in regulating the exercise induced MEF2A binding to the GLUT4 promoter,andGLUT4 mRNA expression was investigated.Methods:Wild-type(WT;n=30),AMPKα2 over-expression(OE;n=30),and AMPKα2 knockout(KO;n=30)C57/BL mice were randomly divided into three groups:control group,low-intensity(12m/min)group and high-intensity(20m/min)group.Mice were killed after 3h of treadmill running completed by 60 min of continuous running on the experimental day.1)AMPKα-Thr172 phosphorylation by western blot.2)Total and nuclear MEF2A by western bolt.3)Bound MEF2A at the GLUT4 MEF2 cis-e,m lement by CHIP.4)GLUT4 expression by Real Time-PCR and Western blot.Results:Over-expression of AMPKα2,which was associated with higher AMPKα-P in exercise muscles,heightens the exercise-induced increase in MEF2A binding to the GLUT4 promoter and GLUT4 mRNA expression.Exercise-induced increases of GLUT4 mRNA expression,were normal inα2-KO muscles despite the reduced AMPK signaling and GLUT4 promoter-bound MEF2A.Conclusion:1)Exercise increases Glut4 expression by increase the binding of MEF2A to the Glut4 promoter.2)Exercise increases the binding of MEF2A to their binding sites on the Glut4 gene by an AMPK-dependent mechanism.3)AMPK activity during exercise is not indispensable for expression of GLUT4.

A M P Kα2over-ex pression mouse;A M P Kα2knockout mouse;M EF2;GLU T4

G804.7

A

1000-677X(2011)02-0055-09

2010-10-31;

2011-01-10

北京市自然科學基金(5102024);國家自然科學基金(30971412)資助。

龔豪杰(1986-),男,河南漯河人,在讀碩士研究生,主要研究方向為運動和骨骼肌代謝,E-mail:haojie1013101310@163.com;張纓 (1961-),女 ,北京人 ,教授,博士,主要研究方向為運動和骨骼肌代謝;E-mail:zhyi9256@126.com。

Beijing Sport University,Beijing 100084,China.