降解木素白腐菌產(chǎn)漆酶的研究進(jìn)展

傅 愷 付時(shí)雨 詹懷宇

(華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510640)

降解木素白腐菌產(chǎn)漆酶的研究進(jìn)展

傅 愷 付時(shí)雨 詹懷宇

(華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510640)

綜述了近年來國內(nèi)外對(duì)于白腐菌產(chǎn)漆酶的研究進(jìn)展，對(duì)液體和固體發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的技術(shù)和方法進(jìn)行了討論和評(píng)述，并對(duì)今后的研究工作提出了展望。

白腐菌;漆酶;液體發(fā)酵;固體發(fā)酵;有機(jī)廢料;發(fā)酵罐

隨著環(huán)境保護(hù)要求的日益嚴(yán)格，制漿造紙清潔生產(chǎn)成為研究熱點(diǎn)。在紙漿的漂白過程中引入生物酶，不僅可以減少化學(xué)藥品用量，還能降低廢水的污染負(fù)荷，如COD、BOD和AOX等。因此，紙漿生物漂白越來越受到國內(nèi)外造紙界的關(guān)注和重視，其中紙漿的半纖維素酶輔助漂白已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，但是半纖維素酶不能直接降解紙漿中的殘余木素，難以從根本上解決殘余木素的脫除問題［1］。于是開發(fā)了新型木素降解酶，利用其直接作用和降解紙漿中的殘余木素成為生物漂白領(lǐng)域的迫切需求。

白腐菌分泌的木素降解酶系主要包括木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶，其中漆酶在紙漿漂白工業(yè)中最具應(yīng)用前景。近幾年，隨著研究的不斷深入，白腐菌漆酶對(duì)木素和與木素結(jié)構(gòu)相似的許多環(huán)境污染物的降解作用也越來越受到科研工作者的關(guān)注，特別是在紙漿生物漂白［2］、工業(yè)廢水處理［3］、有機(jī)染料脫色［4］和高分子催化合成［5］等方面，表現(xiàn)出了很大的研究價(jià)值和應(yīng)用潛力。

但是白腐菌漆酶在上述領(lǐng)域中的成功應(yīng)用，目前需要解決的一個(gè)關(guān)鍵性問題是如何在控制成本的前提下提高漆酶的產(chǎn)量。優(yōu)化發(fā)酵條件以提高白腐菌產(chǎn)酶能力并降低生產(chǎn)和應(yīng)用成本是一種最基本也是最常用的研究思路。Borras等［6］學(xué)者研究了白腐菌Trametes versicolor在麥芽汁半合成培養(yǎng)基中，對(duì)酸性染料蘭納灑脫灰脫色過程中的成本控制問題，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基原料的費(fèi)用占脫色總成本的比例高達(dá)95%，而通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，選用低價(jià)的無麥芽汁合成培養(yǎng)基，能夠?qū)⒚撋杀窘档?6%，并且脫色效果不變。白腐菌漆酶高效生產(chǎn)的另一種思路是尋找合適的載體進(jìn)行漆酶基因的異源表達(dá)［7］，但是由于白腐菌漆酶中糖基的存在能夠促使漆酶蛋白的水解，因此相對(duì)于其他一些已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的氧化還原酶來說——如通過絲狀真菌的基因重組生產(chǎn)葡萄糖氧化酶——白腐菌漆酶在活性宿主上的異源高效表達(dá)還較為困難［8］，總體上還處于探索階段，難以滿足漆酶工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的要求。因此目前關(guān)于漆酶生產(chǎn)的研究主要還是集中于優(yōu)化白腐菌的發(fā)酵條件上。本文重點(diǎn)介紹了近年來國內(nèi)外對(duì)于白腐菌產(chǎn)漆酶的研究進(jìn)展，對(duì)提高漆酶產(chǎn)量的技術(shù)和方法進(jìn)行了討論和評(píng)述。

1 白腐菌產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)方法

微生物產(chǎn)酶的發(fā)酵過程與菌體周圍的環(huán)境因素關(guān)系密切，不同的發(fā)酵方法對(duì)白腐菌分泌漆酶有很大影響，見表1［3-4，9-36］，按照培養(yǎng)方式的不同可將其分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩大類。

1.1 液體培養(yǎng)

液體培養(yǎng)是指菌絲體在含有一定營養(yǎng)成分的液體培養(yǎng)基中生長和產(chǎn)酶的過程，由于這種方式便于工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，因此，目前對(duì)于液體培養(yǎng)白腐菌產(chǎn)漆酶的研究報(bào)道較多。其中大部分研究都表明，在液體培養(yǎng)基中添加適量的誘導(dǎo)劑或Cu2+，對(duì)白腐菌分泌漆酶具有較為顯著的促進(jìn)作用。

表1 不同菌種、培養(yǎng)方法和測(cè)定底物對(duì)漆酶活力的影響

誘導(dǎo)劑的作用機(jī)理是它能夠與某些阻遏酶蛋白合成的物質(zhì)結(jié)合，使其發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)，降低這些物質(zhì)對(duì)酶蛋白合成的阻遏作用，啟動(dòng)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯以生成相應(yīng)的酶蛋白［37］。白腐菌漆酶的誘導(dǎo)劑大多為一些與木素結(jié)構(gòu)類似的低分子芳香化合物或木素降解后的碎片化合物，通常也是漆酶的作用底物，如黎蘆醇、愈創(chuàng)木酚、2，2-連氮-二 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、二甲苯胺、阿魏酸、丁香醛、單寧酸、香草酸、香豆酸等。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上的共同特征是芳環(huán)上通常連有—OH或—NH2基團(tuán)。吳香波等［31］報(bào)道白腐菌Coriolus versicolor在液體培養(yǎng)時(shí)，添加0．5～1 mmol/L ABTS可將漆酶產(chǎn)量提高5倍，漆酶活力高達(dá)230 IU/mL。Madhavi等學(xué)者［18］的研究也發(fā)現(xiàn)，多種芳香族誘導(dǎo)劑對(duì)一株野生型白腐菌WR-1分泌漆酶都具有促進(jìn)作用，其中0．8 mmol/L二甲苯胺的誘導(dǎo)效果最為明顯，發(fā)酵液中漆酶最高活力可達(dá)692 IU/mL。一般來講，不同的誘導(dǎo)劑對(duì)同一株白腐菌產(chǎn)酶的影響往往不同，而不同的菌株通常具有不同的最適宜誘導(dǎo)劑。

此外，金屬元素，如銅、錳、鐵、鋅等，往往或是酶蛋白活性基團(tuán)的組成部分，或是酶的激活劑，對(duì)酶活力的影響也不容忽視。許多研究都證實(shí)［15，19，23，32，35］，在培養(yǎng)基中添加一定量的 Cu2+離子，對(duì)多種白腐菌分泌漆酶都具有顯著的促進(jìn)作用。Kurtz等［38］對(duì)此提出的解釋為：白腐菌漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，每個(gè)酶蛋白分子中一般都含有4個(gè)Cu2+，可能是由于相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄合成漆酶時(shí)需要元素銅，因此在限銅或缺銅的培養(yǎng)條件下，漆酶的合成會(huì)受影響。

1.2 固體培養(yǎng)

固體培養(yǎng)就是利用固體培養(yǎng)基，在沒有或者含有少量液體的環(huán)境中，使菌絲體貼附在固體培養(yǎng)基質(zhì)表面上生長和產(chǎn)酶的過程。隨著研究的不斷發(fā)展和深入，真菌固體培養(yǎng)產(chǎn)酶越來越受到國內(nèi)外學(xué)者們的關(guān)注，研究和實(shí)踐表明，白腐菌固體發(fā)酵也能夠得到較高的漆酶產(chǎn)量，相比于液體發(fā)酵方式，固體培養(yǎng)的氧氣循環(huán)流通較好，有利于白腐菌等好氧真菌的生長代謝，而且由于是靜態(tài)處理過程，因此可以省去機(jī)械動(dòng)力所消耗的能量，后續(xù)處理過程也較為簡(jiǎn)便，并且這種培養(yǎng)方式與大部分真菌在野生狀態(tài)時(shí)的生長環(huán)境更為接近，因此特別適合于絲狀真菌的發(fā)酵產(chǎn)酶［39］。

1.3 白腐菌產(chǎn)漆酶研究的新趨勢(shì)

最近幾年，對(duì)于白腐菌產(chǎn)漆酶的研究，無論是液體培養(yǎng)還是固體培養(yǎng)都出現(xiàn)了一個(gè)新的特點(diǎn)，就是大量利用天然物質(zhì)，特別是利用工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素有機(jī)副產(chǎn)品和廢棄物，作為白腐菌生長和產(chǎn)酶的培養(yǎng)底物。這些有機(jī)物主要包括麥麩、蔗渣、稻草、麥草、木屑、秸皮、酒糟、豆粕、玉米芯、脫墨污泥、葡萄藤和橄欖油廠廢水等，它們通常都富含糖類物質(zhì)，能夠?yàn)榫w的生長代謝提供養(yǎng)料，并且還含有一定量的木素、纖維素和半纖維素 (表2)［16，39-40］，可作為刺激白腐菌分泌漆酶的誘導(dǎo)物。有報(bào)道指出［41］，小麥麩中還含有一種天然漆酶誘導(dǎo)物質(zhì)——阿魏酸 (約0．4% ～1．0%)，對(duì)白腐菌分泌漆酶具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用［4，18］。雖然到目前為止還未見有報(bào)道證實(shí)其他天然底物是否也含有某些特殊誘導(dǎo)物質(zhì)，但是將這些天然有機(jī)物作為白腐菌發(fā)酵底物的可行性已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)同。

表2 幾種用于白腐菌漆酶發(fā)酵的有機(jī)副產(chǎn)物的木質(zhì)纖維素含量

例如Membrillo等［27］采用不同顆粒尺寸的蔗渣作為培養(yǎng)底物，進(jìn)行白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶的固體發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)蔗渣顆粒大小和外加氮源對(duì)漆酶產(chǎn)量有很大影響，最佳發(fā)酵條件為蔗渣濕度80%，顆粒直徑1．68 mm，纖維長徑比 8．7 ±1．1，外加氮源硫酸銨，碳氮比20，每克絕干底物發(fā)酵漆酶活力最高可達(dá)0．04 IU。Stajic等［16］利用桔皮和葡萄藤粉作為碳源，對(duì)多株白腐菌進(jìn)行液體和固體培養(yǎng)，結(jié)果表明，在液體培養(yǎng)基中添加4%桔皮和20 mmol/L硫酸銨最適宜白腐菌Pleurotus eryngii分泌漆酶，培養(yǎng)基中酶活最高可達(dá)246．4 IU/L;而白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶產(chǎn)量最高為445 IU/L，其最佳培養(yǎng)方式為固體培養(yǎng)，培養(yǎng)基含4 g葡萄藤粉，12 mL液體合成培養(yǎng)基(氮源為 30 mmol/L 硫酸銨)。Winquist等［25］將燕麥殼、纖維殘?jiān)兔撃勰嗟?種工農(nóng)業(yè)廢棄物作為白腐菌的固體發(fā)酵底物，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的成分對(duì)白腐菌產(chǎn)酶影響較大，在燕麥殼中加入20%的脫墨污泥能顯著提高白腐菌Cerrena unicolor的漆酶分泌能力，最高酶活達(dá)到178nkat/g(絕干質(zhì)量)。

這些副產(chǎn)品和廢棄物來源十分廣泛，而且產(chǎn)量巨大，但是由于長期以來缺乏規(guī)模化地深加工和利用，大量寶貴的資源被作為初級(jí)產(chǎn)物而浪費(fèi)，經(jīng)濟(jì)附加值很低。而利用這些有機(jī)物作為白腐菌發(fā)酵漆酶的培養(yǎng)底物，不僅可以促進(jìn)白腐菌生長，提高漆酶的產(chǎn)量，而且能夠充分利用低價(jià)值的工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品和廢棄物，降低生產(chǎn)成本，減少對(duì)環(huán)境的污染負(fù)荷。

2 白腐菌漆酶的發(fā)酵方式

提高白腐菌漆酶的產(chǎn)量，并降低生產(chǎn)成本，使其在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，還要依賴于成熟的工業(yè)化發(fā)酵技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)室研究時(shí)，搖瓶發(fā)酵雖然最為常用，但是由于其發(fā)酵規(guī)模相對(duì)較小并且缺乏對(duì)工程控制的選擇 (如pH值、通氣量、外加營養(yǎng)物質(zhì)等)，具有一定的局限性，因此采用有適當(dāng)控制和檢測(cè)儀器的小型發(fā)酵罐 (約1～10 L) 是較為合適的選擇［42］。但是在工業(yè)化生產(chǎn)中，缺乏高效的大規(guī)模發(fā)酵罐系統(tǒng)仍然是目前制約白腐菌漆酶生產(chǎn)和應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵性因素，為了解決這一問題，近年來國內(nèi)外的科研工作者們?cè)O(shè)計(jì)了多種用于發(fā)酵罐生產(chǎn)漆酶的工藝和策略。按照培養(yǎng)方式的不同也可將它們概括為液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩大類。

2.1 液體深層發(fā)酵

發(fā)酵罐規(guī)模的微生物液體培養(yǎng)通常稱為深層發(fā)酵(Submerged fermentation，SmF)。機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐(Stirred tank reactor，STR)是目前最常用的深層發(fā)酵設(shè)備，是已經(jīng)形成標(biāo)準(zhǔn)化的通用設(shè)備，適合于大多數(shù)微生物的培養(yǎng)發(fā)酵過程。它結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，利用機(jī)械攪拌器的作用，使菌體、發(fā)酵液、空氣和熱量等充分混合，促進(jìn)物料的均勻分布和氧氣的溶解，以保證供給微生物生長繁殖和代謝所需的營養(yǎng)、溫度和溶解氧等。但是這種發(fā)酵罐用于白腐菌的培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)，還存在一些不利因素，主要表現(xiàn)在罐體中白腐菌菌體的生長不易控制，菌絲的無序擴(kuò)張會(huì)提高發(fā)酵液的黏稠度，并且纏繞在攪拌葉輪上，堵塞管路，嚴(yán)重影響物料、熱量和氧氣的均勻傳遞。雖然可以通過提高攪拌轉(zhuǎn)速改善上述問題，但是過高的轉(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致菌絲受到的剪切力增大，抑制細(xì)胞繁殖代謝和漆酶的分泌，甚至導(dǎo)致細(xì)胞破裂［7］。

針對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵工藝培養(yǎng)白腐菌的缺陷，很多研究者利用白腐菌的菌絲體具有向物體表面黏附的自然屬性，采用細(xì)胞固定化技術(shù)來控制白腐菌的自由生長，其最大的優(yōu)勢(shì)是能夠使菌絲在發(fā)酵液中均勻分布，有利于簡(jiǎn)化補(bǔ)料和后續(xù)進(jìn)程的操作，以實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵。細(xì)胞固定化技術(shù)還能夠降低發(fā)酵液的黏稠度，改善氧氣的供給和物料的傳遞，保護(hù)菌絲細(xì)胞免受剪切力的作用，提高細(xì)胞對(duì)pH值、溫度、有毒物質(zhì)等外界環(huán)境的抗干擾能力［7］，從而加快細(xì)胞的繁殖代謝，促進(jìn)漆酶的分泌。常用的細(xì)胞固定載體主要有海藻酸鈉、殼聚糖、幾丁質(zhì)、纖維素衍生物等天然聚合物和聚氨酯泡沫、尼龍海綿、不銹鋼海綿等惰性物質(zhì)。Prasad等［44］報(bào)道采用聚氨酯泡沫固定化培養(yǎng)白腐菌Pleurotus ostreatus，能顯著提高漆酶產(chǎn)量，并將發(fā)酵體系擴(kuò)大到280 mL填充床反應(yīng)器 (Packed-bed bioreactor) 中，漆酶產(chǎn)量可達(dá) 1．4 IU/mL。Couto等［44］研究了多種載體在固定床反應(yīng)器 (Fixed-bed bioreactor)分批發(fā)酵時(shí)對(duì)白腐菌漆酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，不銹鋼海綿最適合白腐菌Trametes hirsuta產(chǎn)漆酶，最高活力可達(dá)2．2 IU/mL。而 Shin等［45］指出，采用海藻酸鈉、殼聚糖等材料固定化培養(yǎng)白腐菌成本較高，不利于漆酶的大規(guī)模生產(chǎn)，因此他們選用麥麩、黃麻、大麻和楓木片等多種低價(jià)天然材料作為固定化載體，其中黃麻是最適合于白腐菌Trametes versicolor固定化發(fā)酵漆酶的天然載體。

此外，發(fā)酵罐規(guī)模的分批補(bǔ)料策略也是一種提高白腐菌漆酶產(chǎn)量的有效手段。補(bǔ)料培養(yǎng)是指根據(jù)菌株生長和初始培養(yǎng)基的性質(zhì)，在培養(yǎng)發(fā)酵的某些階段適當(dāng)補(bǔ)加培養(yǎng)基或營養(yǎng)物質(zhì)，使菌體生長和代謝產(chǎn)物合成的時(shí)間相對(duì)延長。這種方法用于白腐菌產(chǎn)酶的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在能夠通過調(diào)節(jié)底物濃度來控制菌體的生長速度，降低代謝產(chǎn)物對(duì)菌體生長代謝的抑制作用，特別是避免某些使漆酶失活的蛋白水解酶的合成［7，37］。Galhaup等［46］的研究表明，在20 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中采用多次補(bǔ)料策略，機(jī)械攪拌只需要一個(gè)較低的轉(zhuǎn)速 (100 r/min)，白腐菌 Trametes pubescens的漆酶產(chǎn)量就可提高約2倍，達(dá)到相對(duì)較高的水平(740 IU/mL)。

2.2 固態(tài)發(fā)酵

白腐菌固態(tài)發(fā)酵 (Solid-state fermentation，SSF)的規(guī)模擴(kuò)大化也越來越受到研究者的關(guān)注，Coute等［23，47］的課題組比較了3種采用不同傳質(zhì)機(jī)理的發(fā)酵罐，分別是機(jī)械作用的浸入式反應(yīng)器、氣動(dòng)式的膨脹床反應(yīng)器和靜置的盤式反應(yīng)器，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵罐傳質(zhì)系統(tǒng)的不同對(duì)白腐菌漆酶產(chǎn)量影響較大，當(dāng)采用大麥麩為非惰性底物時(shí)，盤式反應(yīng)器更適合于白腐菌Trametes versicolor漆酶的生產(chǎn)，最高漆酶活力達(dá)到3．5 IU/mL，是其他兩種發(fā)酵罐中最高酶活的6倍。之后他們又采用桔皮作為固態(tài)發(fā)酵底物，結(jié)果表明，盤式反應(yīng)器同樣適用于白腐菌Trametes hirsuta漆酶的生產(chǎn)，其最高酶活可達(dá)12 IU/mL。盤式反應(yīng)器之所以優(yōu)于其他兩種固態(tài)發(fā)酵罐，這些學(xué)者認(rèn)為主要是由于浸入式和膨脹床反應(yīng)器的傳質(zhì)動(dòng)作會(huì)對(duì)菌絲體產(chǎn)生一定的剪切力，影響了菌體的生長和代謝產(chǎn)酶，由此提出對(duì)于固態(tài)發(fā)酵罐，傳質(zhì)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)是影響產(chǎn)酶效率的關(guān)鍵因素。

目前國內(nèi)外對(duì)于高效的固態(tài)發(fā)酵罐規(guī)模的白腐菌產(chǎn)漆酶報(bào)道仍比較少，這主要是由于固態(tài)發(fā)酵罐還面臨著一些難以克服的問題，除了傳質(zhì)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)外，發(fā)酵過程中pH值、溫度、通氣和氧氣傳遞、濕度、攪動(dòng)等參數(shù)不易控制也是相當(dāng)重要的原因。因此，當(dāng)前的研究主要集中于改良已有固態(tài)發(fā)酵罐系統(tǒng)或設(shè)計(jì)開發(fā)新型發(fā)酵設(shè)備和工藝，例如Boehmer等［48］研究者采用新型 RITA(Recipient Immersion Temporaire Automatique)間歇浸入式系統(tǒng)，將在固體底物上生長的菌絲體間歇浸入含染料的液體培養(yǎng)基中，以提高白腐菌發(fā)酵產(chǎn)酶的效率并同時(shí)對(duì)染料進(jìn)行脫色，其優(yōu)勢(shì)是既避免了對(duì)菌體的機(jī)械剪切作用，又能夠克服代謝產(chǎn)物及有機(jī)染料對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的抑制作用。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，白腐菌漆酶的液體和固體發(fā)酵分別具有各自的特點(diǎn)，目前關(guān)于哪種方法更具優(yōu)勢(shì)尚無明確定論，因此它們?nèi)匀粫?huì)是今后一段時(shí)間內(nèi)漆酶生產(chǎn)研究的兩個(gè)主要方向。同時(shí)，采用工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的木質(zhì)纖維素有機(jī)副產(chǎn)品和廢棄物，作為白腐菌菌體生長和分泌漆酶的培養(yǎng)底物，也已經(jīng)得到了廣大研究者們的認(rèn)同，成為漆酶研究領(lǐng)域的一個(gè)新趨勢(shì)。

但是，目前白腐菌產(chǎn)漆酶的研究總體上還處于由實(shí)驗(yàn)室研究向工業(yè)化生產(chǎn)的過渡階段，生產(chǎn)成本較高和缺乏高效的大規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)仍然是限制漆酶工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的關(guān)鍵因素，因此，今后的科研工作除了繼續(xù)設(shè)計(jì)、改良和優(yōu)化各種類型的發(fā)酵體系，深入系統(tǒng)地研究其發(fā)酵參數(shù)的控制及動(dòng)力學(xué)模型，以使之更加完善高效外，還應(yīng)該通過應(yīng)用各種最新的生物科學(xué)技術(shù)，特別是基因克隆和重組技術(shù)來開拓白腐菌漆酶研究的新方法和新思路，從根本上提高白腐菌生長和產(chǎn)酶能力。

［1］ 林 鹿，詹懷宇．制漿漂白生物技術(shù)［M］．北京：中國輕工業(yè)出版社，2001．

［2］ 閔江馬，付時(shí)雨，劉夢(mèng)茹，等．硫酸鹽竹漿LMS生物漂白的研究［J］．中國造紙，2005，24(10)：74．

［3］ Fenice M，Sermanni G G，F(xiàn)ederici F，et al．Submerged and solidstate production of laccase and Mn-peroxidase by Panus tigrinus on olive mill wastewater-based media［J］．Journal of Biotechnology，2003，100：77．

［4］ Hongman Hou，Jiti Zhou，Jing Wang，et al．Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye［J］．Process Biochemistry，2004，39：1415．

［5］ 周攀登，付時(shí)雨．漆酶催化對(duì)苯基苯酚的聚合［J］．高分子學(xué)報(bào)，2004，8(4)：614．

［6］ Borras E，Blanquez P，Sarra M，et al．Trametes versicolor pellets production：low-cost medium and scale-up［J］．Biochemical Engineering Journal，2008，42：61．

［7］ Couto S R，Jose L T．Laccase production at reactor scale by filamentous fungi［J］．Biotechnology Advances，2007，25：558．

［8］ Jonsson L J，Saloheimo M，Penttila M．Laccase from the white-rot fungus Trametes versicolor：cDNA cloning of lcc1 and expression in Pichia pastoris［J］．Curr Genet，1997，32：425．

［9］ Hatvani N，Mecs I．Production of laccase and manganese peroxidase by Lentinus edodes on malt-containing by-production of the brewing process［J］．Process Biochemistry，2001，37：491．

［10］ Kahraman S S，Gurdal I H．Effect of synthetic and natural culture media on laccase production by white rot fungi［J］．Bioresource Technology，2002，82：215．

［11］ Moon Yup Jang，Won Ryul Ryu，Moo Hwan Cho．Laccase production from repeated batch cultures using free mycelia of Trametes sp．［J］．Enzyme and Microbial Technology，2002，30：741．

［12］ Couto S R，Gundin M，Lorenzo M，et al．Screening of supports and inducers for laccase production by Trametes versicolor in semi-solidstate conditions［J］．Process Biochemistry，2002，38：249．

［13］ Dhawan S，Lal R，Hanspal M，et al．Effect of antibiotics on growth and laccase production from Cyathus bulleri and Pycnoporus cinnabarinus［J］．Bioresource Technology，2005，96：1415．

［14］ Meza J C，Lonascolo A，Casalot L，et al．Laccase production by Pycnoporus cinnabarinus grown on sugar-cane bagasse：Influence of ethanol vapours as inducer［J］． Process Biochemistry， 2005，40：3365．

［15］ Lorenzo M，Moldes D，Sanroman MA．Effect of heavy metals on the production of several laccase isoenzymes by Trametes versicolor and on their ability to decolourise dyes［J］．Chemosphere，2006，63：912．

［16］ Stajic M，Persky L，F(xiàn)riesem D，et al．Effect of different carbon and nitrogen sources on laccase and peroxidases production by selected Pleurotus species［J］．Enzyme and Microbial Technology，2006，38：65．

［17］ 黃乾明，謝 君，張寒飛，等．漆酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及其產(chǎn)酶條件［J］．菌物學(xué)報(bào)，2006，25(2)：263．

［18］ Madhavi S Revankar，Lele S S．Enhanced production of laccase using a new isolate of white rot fungus WR-1［J］．Process Biochemistry，2006，41：581．

［19］ Emre Birhanli，Ozfer Yesilada．Increased production of laccase by pellets of Funalia trogii ATCC 200800 and Trametes versicolor ATCC 200801 in repeated-batch mode［J］．Enzyme and Microbial Technology，2006，39：1286．

［20］ Vikineswary S，Abdullah N，Renuvathani M，et al．Productivity of laccase in solid substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus［J］． Bioresource Technology， 2006，97：171．

［21］ Elisashvili V，Penninckx M，Kachlishvili E，et al．Use of Pleurotus dryinus for lignocellulolytic enzymes production in submerged fermentation of mandarin peels and tree leaves［J］．Enzyme and Microbial Technology，2006，38：998．

［22］ 莫佳琳，付時(shí)雨，詹懷宇．貝殼狀革耳菌誘變提高產(chǎn)漆酶能力及其生物漂白的研究［J］．中國造紙學(xué)報(bào)，2007，21(4)：29．

［23］ Rosales E，Couto S R，Sanroman MA．Increased laccase production by Trametes hirsuta grown on ground orange peelings［J］．Enzyme and Microbial Technology，2007，40：1286．

［24］ Papinutti V L，F(xiàn)orchiassin F．Lignocellulolytic enzymes from Fomes sclerodermeus growing in solid-state fermentation［J］．Journal of Food Engineering，2007，81：54．

［25］ Winquist E，Moilanen U，Mettala A，et al．Production of lignin modifying enzymes on industrial waste material by solid-state cultivation of fungi［J］．Biochemical Engineering Journal，2008，42：128．

［26］ Beristain S T，Sanchez C，Loera O，et al．Laccases of Pleurotus ostreatus observed at different phases of its growth in submerged fermentation production of a novel laccase isoform［J］．Mycological Research，2008，112：1080．

［27］ Membrillo I，Sanchez C，Meneses M，et al．Effect of substrate particle size and additional nitrogen source on production of lignocellulolytic enzymes by Pleurotus ostreatus strains［J］．Bioresource Technology，2008，99：7842．

［28］ Levin L，Herrmann C，Papinutti V L．Optimization of lignocellulolytic enzyme production by the white-rot fungus Trametes trogii in solid-state fermentation using response surface methodology［J］．Biochemical Engineering Journa，2008，39：207．

［29］ 方 華，黃 俊，丁莉蕓，等．白腐菌分泌漆酶的培養(yǎng)條件研究［J］．化學(xué)與生物工程，2008，25(8)：30．

［30］ Wang Hailei，Yu Guangli，Li Ping，et al．Overproduction of Trametes versicolor laccase by making glucose starvation using yeast［J］．Enzyme and Microbial Technology，2009，45：146．

［31］ 吳香波，謝益民，馮曉靜．白腐菌Coriolus versicolor的培養(yǎng)及產(chǎn)漆酶條件的研究［J］．纖維素科學(xué)與技術(shù)，2009，17(2)：12．

［32］ Fonseca MI，Shimizu E，Zapata P D，et al．Copper inducing effect on laccase production of white rot fungi native from Misiones(Argentina)［J］．Enzyme and Microbial Technology，2010，46(6)：534．

［33］ Levin L，Melignani E，Ramos A M．Effect of nitrogen sources and vitamins on ligninolytic enzyme production by some white-rot fungi．Dye decolorization by selected culture filtrates［J］．Bioresource Technology，2010，101：4554．

［34］ Zeng Guangming，Yu Man，Chen Yaoning，et al．Effects of inoculation with Phanerochaete chrysosporium at various time points on enzyme activities during agricultural waste composting［J］．Bioresource Technology，2010，101：222．

［35］ Gassara F，Brar S K，Tyagi R D，et al．Screening of agro-industrial wastes to produce ligninolytic enzymes by Phanerochaete chrysosporium［J］．Biochemical Engineering Journal，2010，49：388．

［36］ Bhattacharya S S，Garlapati V K，Banerjee R．Optimization of laccase production using response surface methodology coupled with differential evolution［J］．New Biotechnology，2010．

［37］ 岑沛霖，蔡 謹(jǐn)．工業(yè)微生物學(xué)［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000．

［38］ Kurtz MB，Champe S P．Purification and characterization of the conidial laccase of Aspergillus nidulans［J］．J Bacteriol，1982，15：1138．

［39］ Couto S R，Sanroman MA．Application of solid-state fermentation to ligninolytic enzyme production［J］．Biochemical Engineering Journal，2005，22：211．

［40］ 燕 紅，楊 謙．地衣芽孢桿菌對(duì)麥麩降解作用的研究［J］．林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2007，27(4)，97．

［41］ 周利茗，張志清．麥麩中阿魏酸檢測(cè)方法及其提取工藝研究進(jìn)展［J］．糧油加工，2009，11：110．

［42］ 埃 拉．工業(yè)酶：制備與應(yīng)用［M］．第二版．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005．

［43］ Prasad K K，Mohan S V，Bhaskar Y V，et al．Laccase production using Pleurotus ostreatus 1804 immobilized on PUF cubes in batch and packed bed reactors：influence of culture conditions［J］．J Microbiol，2005，43：301．

［44］ Couto S R，Sanroman MA，Hofer D．Stainless steel sponge：a novel carrier for the immobilization of the white-rot fungus Trametes hirsuta for decolourisation of textile dyes［J］．Bioresour Technol，2004，95：67．

［45］ Shin M，Nguyen T，Ramsay J．Evaluation of support materials for the surface immobilization and decoloration of amaranth by Trametes versicolor［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2002，60：218．

［46］ Galhaup C，Wagner H，Hinterstoisser B，et al．Increased production of laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens［J］．Enzyme Microb Technol，2002，30：529．

［47］ Couto S R，Moldes D，Liebanas A，et al．Investigation of several bioreactor configuration for laccase production by Trametes versicolor operating in solid-state conditions［J］．Biochemical Engineering Journal，2003，15：21．

［48］ Boehmer U，Suhardi S H，Bley T．Decolorizing reactive textile dyes with white-rot fungi by temporary immersion cultivation［J］．Engineering in Life Sciences，2006，6：417．

(責(zé)任編輯：馬 忻)

Research Progress of Laccase Production by Lignin-degrading White Rot Fungi

FU KaiFU Shi-yu*ZHAN Huai-yu
(State Key Lab of Pulp＆ Paper Engineering，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong Province，510640)
(*E-mail：shyfu@scut．edu．cn)

Laccase is one of the ligninolytic enzymes secreted by white rot fungus which is the most important microorganism involved in degrading lignin in nature．Application of laccase to pulp bleaching is an attractive alternative to decrease chemicals demand and wastewater pollution．Therefore，the production of laccase in high yield has

much attention from researchers in past decades．The research progress of laccase production from white rot fungi in recent years is overviewed in this paper．Several effective methods to improve laccase yield in submerged and solid-state fermentation are mainly discussed，and the prospect of such research field in the future is also presented．

white-rot fungi;laccase;submerged fermentation;solid-state fermentation;organic waste;fermentor

Q55

A

0254-508X(2011)03-0065-06

傅 愷先生，在讀博士研究生;主要研究方向：制漿造紙生物技術(shù)。

2010-12-01(修改稿)

國家自然科學(xué)基金 (30771689);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007B031600002)。