牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對基因mRNA表達(dá)量的影響

林嘉鵬，王 靜，2，趙云程，陳 童，汪立芹，陳 博，2，黃俊成

(1.新疆畜牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)部家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)中心，烏魯木齊 830000;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對基因mRNA表達(dá)量的影響

林嘉鵬1，王 靜1，2，趙云程1，陳 童1，汪立芹1，陳 博1，2，黃俊成1

(1.新疆畜牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)部家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)中心，烏魯木齊 830000;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

目的 將處于生發(fā)泡期(GV期)和體外成熟期(IVM)的牛卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍-解凍，對其卵裂率和囊胚率以及一些與發(fā)育相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行評價(jià)。方法 玻璃化冷凍GV期(n=224)和IVM期(n=235)牛卵母細(xì)胞，解凍后對其進(jìn)行體外培養(yǎng)并采用quantitative real time-PCR技術(shù)對冷凍-解凍后的GV和IVM期卵母細(xì)胞中 Bax、Dnmt1、Hdac1、Cyclinb1、Cdc2和 Cu Zn SOD等基因的 mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果 GV期和IVM期卵母細(xì)胞經(jīng)過冷凍-解凍后，卵裂率(14.7% ～89.4%，34.5% ～89.4%，P＜0.001)及囊胚率(3.0% ～28.4%，12.3% ～28.4%，P＜0.001)均極顯著低于對照組(n=238)，且冷凍-解凍后的 GV期卵母細(xì)胞卵裂率(14.7% ～34.5%，P＜0.001)和囊胚率(3.0% ～12.3%，P＜0.001)極顯著低于冷凍-解凍后的 IVM期卵母細(xì)胞;GV期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后，Dnmt1和Cu Zn SOD基因的mRNA表達(dá)量顯著低于對照組 (P＜0.05)，其余基因mRNA表達(dá)量變化不顯著;對M期卵母細(xì)胞而言，Bax基因 mRNA表達(dá)量極顯著低于對照組 (P＜0.01)，Cyclinb1、Cdc2和Cu Zn SOD基因的mRNA表達(dá)量顯著低于對照組(P＜0.05)，其余基因表達(dá)量沒有發(fā)生顯著變化。結(jié)論 對牛GV期或IVM卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍可能會導(dǎo)致基因mRNA表達(dá)量降低，可能會對胚胎發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。

玻璃化冷凍;基因表達(dá);牛卵母細(xì)胞;發(fā)育能力

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的冷凍保存，可充分利用各種卵母細(xì)胞資源，為體外受精、核移植等胚胎工程技術(shù)提供豐富而方便的材料來源，為科研和生產(chǎn)服務(wù)，已逐漸被人們作為一項(xiàng)輔助生殖技術(shù)而廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)和畜牧獸醫(yī)行業(yè)。

但是，由于卵母細(xì)胞對低溫存在高靈敏性，所以卵母細(xì)胞超低溫冷藏技術(shù)仍不像精液冷凍技術(shù)那樣成功。盡管與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍能使卵母細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)急速降至低溫，從而減少冰晶的產(chǎn)生，對卵母細(xì)胞的保護(hù)具有一定優(yōu)勢，但解凍后的胚胎發(fā)育情況卻仍然不盡如人意［1］。近年來研究已表明卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后，在形態(tài)學(xué)和生物物理學(xué)方面會產(chǎn)生不同程度的變化甚至損壞［2］，如透明帶發(fā)生變化，減少細(xì)胞膜選擇透性，微絨毛減少或消失，各種細(xì)胞器及內(nèi)含物如線粒體、微管、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及囊泡的損傷［3］，改變微管和微絲［4］，破壞紡錘體構(gòu)造，出現(xiàn)非整倍體，并使細(xì)胞核破裂［5］。目前，僅小鼠成熟卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)趨為完善，家畜中雖然牛卵母細(xì)胞冷凍保存研究最多，但只獲得了極少數(shù)來自冷凍牛GV期和體外成熟卵母細(xì)胞的牛犢，其冷凍卵母細(xì)胞的成熟率、受精率和發(fā)育率與未冷凍卵母細(xì)胞相比都還很低，如此看來，冷凍對卵母細(xì)胞的損傷還是很大的。

大量研究表明，受精后早期胚胎細(xì)胞分裂的速度以及各種卵裂球所處的位置都是由貯存在卵內(nèi)的母源性mRNA和蛋白質(zhì)控制的［6］，受精作用介導(dǎo)卵母細(xì)胞中母源mRNA募集，受精后，蛋白質(zhì)合成急劇增長，儲存的mRNA被轉(zhuǎn)錄、翻譯，這些基因的發(fā)育能力包括對轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)、調(diào)整細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、合成組蛋白、胞間連絲傳遞信號、生長因子和胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)、新陳代謝等［7］。而關(guān)于玻璃化冷凍給卵母細(xì)胞，特別是給哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞所帶來的生物化學(xué)或分子生物學(xué)方面的影響的報(bào)道較少，目前國內(nèi)對卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的研究也主要集中在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞水平上。

因此，我們分別將處于GV期和M期的牛卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍以及解凍，采用quantitative real time-PCR技術(shù)對玻璃化冷凍-解凍牛卵母細(xì)胞中的 Bax、Dnmt1、Hdac1、cyclinb1、Cdc2 和 Cu Zn SOD等基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測，分析玻璃化冷凍-解凍對處于不同體外培養(yǎng)時(shí)期的牛卵母細(xì)胞中與發(fā)育相關(guān)的以上基因的表達(dá)量影響情況，以期為玻璃化冷凍后卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系的優(yōu)化、輔助生殖技術(shù)效率的提高提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 牛卵母細(xì)胞的收集和體外成熟

從屠宰廠收集成年牛的卵巢放入37℃的生理鹽水中，2 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。將卵巢在37℃生理鹽水中洗3遍后放入燒杯內(nèi)，選擇直徑為2～8 mm的卵泡用10 mL注射器吸取卵泡液，回收顆粒細(xì)胞緊密的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。

用M199(Gibco)+5 U/mL肝素鈉+10 U/mL PVA洗2遍，再用成熟液洗滌2遍(成熟培養(yǎng)液為M199(Gibco)+10%FBS(Gibco)+10 U/mL FSH(Sigma)+100 U/mL LH(Sigma)+1 mg/L estradiol(Sigma)+100 U/mL青霉素+100 mg/L鏈霉素)。事先將成熟液在培養(yǎng)皿中做成50 μL微滴，覆蓋礦物油(Sigma)，在38.5℃，5%CO2培養(yǎng)箱中平衡2 h以上，然后將50～60枚/孔的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體放入成熟液滴中培養(yǎng)成熟。

1.2 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍與解凍

將成熟 18 h的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體放入0.1%透明質(zhì)酸酶(Sigma)中消化2～3 min。再用玻璃吸管輕輕吹打卵母細(xì)胞，使卵丘與卵母細(xì)胞完全脫離后進(jìn)行玻璃化冷凍;GV期卵母細(xì)胞直接進(jìn)行玻璃化冷凍。

卵母細(xì)胞玻璃化冷凍：將卵母細(xì)胞放入冷凍基礎(chǔ)液 HM［M199(Gibco)+20%FBS(Gibco)］中平衡10 min，每次5枚卵母細(xì)胞先后放入冷凍液1［HM+10%EG(Sigma)+10%DMSO(Sigma)］中 2 min，冷凍液 2中［HM+20%EG(Sigma)+20%DMSO(Sigma)］+0.5 mol/L sucrose(Sigma)30 s，并迅速投入液氮表面，形成微滴。

解凍：將微滴依次放入0.25 mol/L sucrose(Sigma)中 2 min，0.15 mol/L sucrose(Sigma)中 2 min后，最后在HM中洗3遍。成熟卵母細(xì)胞再放入成熟液滴中恢復(fù)2 h后，進(jìn)行收集。

1.3 體外受精及體外培養(yǎng)

取西門塔爾牛細(xì)管凍精，38℃水浴中快速解凍30 s，酒精消毒細(xì)管外壁，將細(xì)管兩頭剪開后滴入1.5 mL離心管內(nèi)，用移液器分別加入3～4個(gè)裝有500 μL 精子洗滌液［BO 液 +肝素鈉(10 μg/mL，國產(chǎn))］+咖啡因(2.5 mmol/L，Sigma)+BSA(6 mg/mL，Sigma)的試管底部，置于 CO2培養(yǎng)箱中使精子上浮15～20 min，小心收集上層液體，1800 r/min，離心5 min，棄掉上清液，再加入1 mL的精子洗滌液離心洗滌，保留離心管底部的200 μL精子。

將解凍后的卵母細(xì)胞在受精液中洗滌3次，轉(zhuǎn)入受精微滴內(nèi)，微滴已提前做好，覆蓋石蠟油，并置于CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h以上。

然后將上述處理的精子濃度調(diào)至1.5×106后加入受精微滴內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中使精卵作用18～20 h后，將各組受精卵轉(zhuǎn)入已制備好的飼養(yǎng)單層上【mCR1aa+5%FBS(Gibco)】，受精后48 h檢查卵裂率，并把未卵裂的卵母細(xì)胞吸出，繼續(xù)培養(yǎng)6～7 d。每48 h半量更換培養(yǎng)液，直至將胚胎培養(yǎng)至囊胚階段，并進(jìn)行記錄。

1.4 卵母細(xì)胞總RNA提取與RT-PCR

將收集的卵母細(xì)胞用PBS(Gibco without Ca2+、Mg2+)洗3遍，放入DEPC水處理過的1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心1 min，小心吸去上清液，按照RNeasy Micro Kit(Qiagen)試劑盒介紹的方法提取卵母細(xì)胞總RNA。

RT-PCR 體系：將 1 μg總 RNA 與 1 μL隨機(jī)六聚物引物混合后，RNase free water補(bǔ)足至14.5 μL，70℃ 10 min，冰浴10 min，瞬時(shí)離心后加入 RNA inhibiter 0.5 μL，5 × buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，AMV 1 μL(TaKaRa)，42℃ 40 min。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別把牛 Bax、Dnmt1、Hdac1、cyclinb1、Cdc2、Cu Zn SOD基因和18S rRNA與pMD20-T載體進(jìn)行連接，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ將各個(gè)基因的質(zhì)粒線性化，并將各個(gè)基因線性化的質(zhì)粒進(jìn)行濃度稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別根據(jù) GenBank 中牛 Bax、Dnmt1、Hdac1、cyclinb1、Cdc2、Cu Zn SOD 和 18S rRNA 序列，用 Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)上述基因的PCR擴(kuò)增的上下游引物。

表1 Quantitative real time-PCR引物Tab.1 Primers for quantitative real-time PCR assay

1.6 Quantitative real-time PCR檢測

1.6.1 Quantitative real time-PCR 反應(yīng)體系：2 μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和樣品 cDNA，上下游引物各5 pM，2 ×FastStart DNA master SYBR green I 10 μL(Qiagen)，加 RNase free water 至 20 μL。

1.6.2 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，55個(gè)循環(huán)中包括95℃ 10 s，60℃ 20 s以及72℃ 20 s。熔解曲線從40～99℃，每秒增加2℃，并收集熒光信號。為減小誤差，將 Quantitative real time-PCR重復(fù)一次，以平均值參與分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SAS 9.0軟件，采用х2檢驗(yàn)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)期牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果分析

采用微滴法分別對GV期和M期牛卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍-解凍、體外受精、體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示(表2)：GV期和 M期牛卵母細(xì)胞冷凍-解凍后的卵裂率均極顯著低于對照組(P＜0.01)，囊胚率也極顯著低于對照組(P＜0.01)，這兩時(shí)期卵母細(xì)胞的體外受精及囊胚率相比，GV期均極顯著低于M期 (P＜0.01)。

2.2 玻璃化冷凍對牛卵母細(xì)胞中相關(guān)基因mRNA水平的影響

對GV期和M期體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍后，采用quantitative real-time PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1，GV期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后，Dnmt1和Cu Zn SOD基因的mRNA表達(dá)量顯著低于對照組(P＜0.05)，其余基因mRNA表達(dá)量變化不顯著;對M期卵母細(xì)胞而言，Bax基因 mRNA表達(dá)量極顯著低于對照組(P＜0.01)，cyclinb1、Cdc2和Cu Zn SOD基因的mRNA表達(dá)量顯著低于對照組(P＜0.05)，其余基因表達(dá)量沒有發(fā)生顯著變化。

表2 不同時(shí)期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對胚胎發(fā)育的影響Tab.2 Effect of different period vitrification on embryo development

3 討論

本研究的目的在于探索玻璃化冷凍對牛GV期及體外成熟(M期)期卵母細(xì)胞中一些與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA甲基化等發(fā)育因素相關(guān)基因(Bax、Dnmt1、Hdac1、cyclinb1、Cdc2、Cu Zn SOD)mRNA 表達(dá)量的變化，及玻璃化冷凍牛GV期及體外成熟(M期)期卵母細(xì)胞對其體外發(fā)育能力的影響。從結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，不論是GV期還是體外成熟(M期)期的卵母細(xì)胞，經(jīng)過玻璃化冷凍后，上述基因的mRNA表達(dá)量都會發(fā)生變化，并且這兩個(gè)時(shí)期的卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后的胚胎發(fā)育率都比對照組低，從一定角度說明玻璃化冷凍過程可能對卵母細(xì)胞內(nèi)部的一些轉(zhuǎn)錄因子的功能或發(fā)育能力產(chǎn)生了消極影響。

為了能夠克服玻璃化程序或操作帶來的不良影響，人們都在致力于改進(jìn)或開發(fā)新的冷凍系統(tǒng)，能夠有效地提高降溫和升溫速率，而這些研究路線都是以將玻璃化溶液體積縮減到最小為宗旨。圍繞這一根本目的，不同冷凍介質(zhì)或載體相繼出現(xiàn)，如電子顯微鏡銅網(wǎng)、OPS、冷凍環(huán)、微滴法及冷凍帽法［8-10］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室長年積累的一套玻璃化冷凍體系，采用微滴法進(jìn)行冷凍，其特點(diǎn)是操作簡便，卵母細(xì)胞在冷凍液中平衡一段時(shí)間后，將含有卵母細(xì)胞的冷凍液小滴(約6 μL)直接投入液氮中，使其快速冷凍，然后將這些冷凍后的顆粒裝入管中，可長期保存于液氮罐中。這種方法的缺點(diǎn)是小液滴剛滴入液氮時(shí)不是立即沉下去，而是漂在液氮上面，由于液滴體積較大(5～6 μL)，可能降低了冷凍速度;往液氮中滴入小液滴時(shí)可能丟失卵母細(xì)胞。

關(guān)于卵母細(xì)胞發(fā)育階段的選擇一直存在爭議，因?yàn)椴煌陌l(fā)育階段冷凍各有利弊：MⅡ期卵母細(xì)胞優(yōu)越性在于卵母細(xì)胞已處于成熟期，解凍后可直接授精，無需進(jìn)行體外成熟。其不足之處在于具有對溫度敏感性非常高的紡錘體，在降溫過程中極易解聚，使出現(xiàn)非整倍染色體的幾率增加，影響卵母細(xì)胞的發(fā)育［2］。冷凍保存GV期卵母細(xì)胞因?yàn)槿旧w有核膜包裹，可能避免其受到損傷。但是，新問題隨即出現(xiàn)，比如：GV期卵母細(xì)胞有卵丘細(xì)胞包裹，所以體積較大，并且卵母細(xì)胞膜對水和冷凍保護(hù)劑的滲透性(影響冷凍能力的關(guān)鍵因素)比MⅡ期低，解凍后會嚴(yán)重?fù)p傷其超微結(jié)構(gòu)，而最大的障礙就是GV期卵母細(xì)胞外層包裹著的卵丘細(xì)胞，冷凍過程中會影響冷凍滲透液的進(jìn)入、胞內(nèi)水分向外滲透以及快速冷卻的速率等，而且卵丘細(xì)胞的質(zhì)膜與卵母細(xì)胞之間是通過冠狀細(xì)胞進(jìn)行錨定連接的，在快速降溫之前、處于冷凍液中的卵母細(xì)胞是處在一個(gè)不等滲的環(huán)境，這勢必會引起卵母細(xì)胞收縮，而導(dǎo)致卵母細(xì)胞膜發(fā)生破裂或出現(xiàn)損傷，尤其是在急速降溫條件下［11-13］。Cetin［19］和 Tharasanit等［20］發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍的GV期卵母細(xì)胞對玻璃化冷凍的敏感性比MⅡ卵母細(xì)胞更高，他們認(rèn)為冷凍未成熟卵母細(xì)胞雖然沒有紡錘體微管存在所引起的冷凍問題，但隨后紡錘體形成以及極體釋放仍受影響，表明降溫可導(dǎo)致未成熟卵母細(xì)胞的主要調(diào)控因子，如細(xì)胞成熟促進(jìn)因子(MPF)，促細(xì)胞分裂激活蛋白(MAPK)以及其他微管組織影響因素的損傷，而且冷凍同時(shí)也可破壞轉(zhuǎn)錄激活、翻譯等生化過程從而對胞質(zhì)成熟產(chǎn)生不良反應(yīng)。

圖1 GV期及M期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后Bax、Dnmt1、Hdac1、Cyclinb1、Cdc2和Cu Zn SOD基因mRNA相對表達(dá)量Fig.1 Relative mRNA expression of Bax，Dnmt1，Hdac1，Cyclinb1，Cdc2 and Cu Zn SOD in vitrified-warmed oocytes in GV and IVM periods

而Chian等［14］報(bào)道沒有卵丘細(xì)胞包裹的成熟牛卵母細(xì)胞經(jīng)過玻璃化冷凍后，仍有較高的存活率;Ledda等［16］認(rèn)為，在玻璃化冷凍羊 GV期卵母細(xì)胞之前，將卵丘細(xì)胞去掉，有益于其解凍后的體外成熟;Baka 等［17］和 Van DerElst等［18］也證明不成熟卵母細(xì)胞經(jīng)過冷凍后，不會提高減數(shù)分裂紡錘體的異常率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，GV期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后的囊胚率(3.0%)極顯著低于對照組(P＜0.01)，與 Dong-Hoon KIM 和 Hyo-Sok PARK 等［15］用微滴法冷凍牛 GV期卵母細(xì)胞的結(jié)果(囊胚率為2.3%)較為一致;而冷凍M期卵母細(xì)胞后的囊胚率顯著高于GV期，又印證了成熟卵母細(xì)胞較GV期卵母細(xì)胞耐凍這一說法。

哺乳動(dòng)物胚胎能夠發(fā)生分裂，是靠在卵母細(xì)胞時(shí)期所積累的母源mRNA和蛋白質(zhì)所支持完成的，而卵母細(xì)胞的發(fā)育能力被認(rèn)為是依賴卵母細(xì)胞中那些特殊的轉(zhuǎn)錄因子和 mRNA的組成以及豐度［21］。因此，我們對玻璃化冷凍和對照組(不冷凍)卵母細(xì)胞中的一些與發(fā)育相關(guān)的重要基因進(jìn)行了mRNA定量分析，以此來衡量玻璃化冷凍對這些mRNA的影響。

總體來看，牛卵母細(xì)胞在 GV期時(shí)，這些基因mRNA表達(dá)量會有一定積累，可能是處于這一時(shí)期的卵母細(xì)胞為后期發(fā)育積蓄物質(zhì)基礎(chǔ);對這一時(shí)期的卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍后，除了Bax基因有所升高外，其他基因mRNA表達(dá)量均降低;當(dāng)牛卵母細(xì)胞處于M期時(shí)，除了Cu Zn SOD基因以外，其余基因mRNA表達(dá)量在M期均為最高，暗示卵母細(xì)胞在M期將會為緊接著發(fā)生的受精作用蓄積大量的mRNA，而將此時(shí)的卵母細(xì)胞采用微滴法進(jìn)行玻璃化冷凍，則會降低這些基因的mRNA表達(dá)量，尤其是 Cdc2(P＜0.05)、cyclin b1(P＜0.05)和 Bax(P＜0.01)基因較對照組 mRNA表達(dá)量下降較為明顯。說明不論卵母細(xì)胞處于GV期還是M期，玻璃化冷凍在改變或影響卵母細(xì)胞生理或形態(tài)的同時(shí)，也對其積累的這些基因的表達(dá)量起到了抑制作用，從基因的角度說明玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞后，一些基因的mRNA表達(dá)量會降低，可能會對其轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)生負(fù)面影響，從而導(dǎo)致其后期發(fā)育受到阻滯，但對其轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)翻譯會產(chǎn)生哪些具體影響，還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究和探索。

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Vitrification of bovine oocytes affects their gene mRNA abundance

LIN Jia-peng1，WANG Jing1，2，ZHAO Yun-cheng1，CHEN Tong1，WANG Li-qin1，CHEN Bo1，2，HUANG Jun-cheng1
(1.Xinjiang Academy of Animal Sciences，The Key Laboratory of Livestock Reproduction＆ Breed Biotechnology of Ministry of Agriculture，Xinjiang Academy of Biotechnological Center，Urumqi 830000，China;2.Xinjiang Agricultural University Agronomy College，Urumqi 830052)

Objective To evaluate the mRNA expression abundance of genes，which are related with embryonic development and ability to undergo successful fertilization，cleavage and blastocyst development，in the GV stage and in vitro matured(IVM)bovine oocytes.Methods The oocytes that vitrified-warmed at GV(n=224)and IVM(n=235)were in vitro fertilized and cultured up to blastocyst stage under standard conditions.In parallel，we analyzed the relative abundance of Bax，Dnmt1，Hdac1，cyclinb1，Cdc2 and Cu Zn SOD transcripts of the vitrified-warmed oocytes by quantitative real time-PCR.Result Vitrified oocytes in both GV and IVM stages showed a lower cleavage rate(14.7% ～89.4%，34.5% ～89.4%，P＜0.001)and development to blastocyst stage(3.0% ～28.4%，12.3% ～28.4%，P＜0.001)than that in the control group(n=238). In addition，vitrified oocytes in GV stage showed a lower cleavage rate(14.7% ～34.5%，P＜0.001)and development to blastocyst stage(3.0% ～12.3%，P＜0.001)than those of vitrified oocytes in IVM period.In the oocytes vitrified in GV period，the Dnmt1 and Cu Zn SOD expression abundance was significantly lower than that of controls(P ＜0.05).In the oocytes in M phase，the expression of Bax mRNA was very significantly lower thanthat in controls(P＜0.01)，and the mRNA expression of cyclinb1，Cdc2 and Cu Zn SOD was significantly lower than that of controls(P＜0.05).(P＜0.05).No other significant changes were found in the expression abundance of other genes.Conclusions Following vitrification the bovine oocytes in GV or IVM stage may lead to a lower transcript abundance，that may have negative effects on embryonic development.

Vitrification;Gene expression;Expression abundance;Bovine oocyte;Developmental competence

Q95-33，R-114

A

1005-4847(2011)02-0134-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.011

新疆自治區(qū)自然科學(xué)基金(200821182);新疆自治區(qū)科技攻關(guān)(200841122);新疆自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(200711104);國家支撐計(jì)劃(2008BADB2B05-10);國家“十一五”863計(jì)劃(2008aa101005)。

林嘉鵬(1983-)，男，助理研究員，碩士，研究方向：胚胎生物技術(shù)。E-mail：350083204@qq.com

黃俊成(1968-)，男，研究員，博士，研究方向：動(dòng)物生殖與發(fā)育研究。E-mail：h_jc@sina.com

2010-09-29