蝦夷扇貝生殖腺多肽的制備及分離

金 文 剛， 吳 海 濤， 朱 蓓 薇,， 劉 冰， 許 景 光

( 1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 楊凌 712100;2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

扇貝柱產(chǎn)品在生產(chǎn)和加工過程中，會產(chǎn)生大量的低值副產(chǎn)物，占扇貝濕重的70%左右，包括貝殼(52%)、裙邊(9%)、中腸腺(5%)、性腺(卵巢和精巢，3%～9%)[1]。研究表明，扇貝加工副產(chǎn)物中含有大量蛋白質(zhì)[2]、多糖[3]及脂類[4]等成分，對扇貝加工副產(chǎn)物進行開發(fā)利用，不僅能減少生物資源的浪費，還可避免由此引起的環(huán)境污染。

利用生物酶制備生物活性肽，是當(dāng)前海產(chǎn)品副產(chǎn)物蛋白質(zhì)回收利用的有效途徑之一，具有安全性高、條件溫和、易于控制、對設(shè)備要求低等優(yōu)點。有關(guān)利用扇貝加工副產(chǎn)物中蛋白資源的研究，主要是以扇貝裙邊或內(nèi)臟團為原料通過外源酶水解，制備調(diào)味料[5]或活性肽[6]。扇貝生殖腺是扇貝內(nèi)臟團的重要組成部分，也是鮮食扇貝的可食用部分，具有較高的安全性，國外對扇貝生殖腺中的酶[7]、脂肪酸[8]和類胡蘿卜素[9]等進行了相關(guān)研究，然而，采用外源酶對扇貝生殖腺進行酶解，制備多肽的研究還鮮見報道。為此，本研究分別以雌、雄蝦夷扇貝生殖腺為原料，結(jié)合變性預(yù)處理，選用中性蛋白酶制備蝦夷扇貝生殖腺多肽，比較雌性和雄性蝦夷扇貝生殖腺的酶解效果及水解液的組成，并對雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液中多肽進行了初步分離，考察其還原能力及分子質(zhì)量分布情況，為蝦夷扇貝生殖腺的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：鮮活蝦夷扇貝，購于大連長興水產(chǎn)品批發(fā)市場，低溫運至實驗室后，立即從雌性和雄性扇貝內(nèi)臟團中摘下生殖腺，其中雌性生殖腺呈橘紅色，雄性生殖腺呈乳白色，將其沖洗后分裝，-20 ℃冷凍保藏備用。

主要試劑：中性蛋白酶，南寧龐博生物制藥有限公司；Sephadex G-25葡聚糖凝膠，Pharmacia公司；Cytochrome C(12.5 ku)，Aprotinin(6.512 ku)，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；18肽(2.342 ku)，西安聯(lián)美生物科技有限公司；Vitamin B12(1.355 ku)，N-Hippuryl-His-Leu(0.43 ku)，Sigma公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠；UV2100型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；BSE-100型自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠；P230p型高效液相色譜，大連依利特分析儀器有限公司；SuperdexTM Peptide 10/300GL凝膠柱，GE Healthcare公司。

1.3 方 法

1.3.1 蝦夷扇貝生殖腺主要化學(xué)組成分析

水分的質(zhì)量分數(shù)采用常壓干燥法測定；粗蛋白的質(zhì)量分數(shù)采用微量凱氏定氮法測定；粗脂肪的質(zhì)量分數(shù)采用索氏抽提法測定；總糖的質(zhì)量分數(shù)采用苯酚硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.012 6x-0.018 2(R2=0.992 8)；還原糖的質(zhì)量分數(shù)采用DNS法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.001x+0.001(R2=0.999 4)。

1.3.2 酶解方案

1.3.2.1 變性預(yù)處理

雌、雄蝦夷扇貝生殖腺分別經(jīng)勻漿后，加水至底物質(zhì)量分數(shù)達到4%，沸水浴10 min進行變性預(yù)處理(變性處理組)，并在加熱過程中保鮮膜封口，防止水分流失，試驗中以未經(jīng)變性預(yù)處理的樣品為對照(未變性處理組)。

1.3.2.2 酶解條件

選用中性蛋白酶(試驗前測定的酶活為64 812 U/g)，以4%蛋白質(zhì)量分數(shù)的生殖腺勻漿為底物，酶加量為3 000 U/g蛋白，pH為7.0，溫度為50 ℃，酶解時間為3 h。

1.3.2.3 酶解工藝

準(zhǔn)確稱取雌、雄蝦夷扇貝生殖腺勻漿→分別補水至100 mL(底物質(zhì)量分數(shù)達到4%)→分組(變性處理和未變性處理)→調(diào)pH至7.0→加酶→50 ℃恒溫酶解3 h→滅酶(100 ℃，10 min)→離心(4 000 r/min，15 min)→上清液分裝后冷凍保藏。

1.3.3 水解度測定

采用pH-stat法，以滴定所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積計算水解度。

1.3.4 水解液中可溶蛋白、TCA可溶性寡肽質(zhì)量濃度和肽得率的測定

將經(jīng)變性處理和未變性處理的雌、雄蝦夷扇貝生殖腺水解液稀釋一定倍數(shù)后，分別測定水解液中可溶蛋白、TCA可溶性寡肽質(zhì)量濃度以及肽得率。可溶蛋白質(zhì)量濃度采用考馬斯亮藍 G-250法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.009 9x(R2=0.991 8)；TCA可溶性寡肽的質(zhì)量濃度以及肽得率采用三氯乙酸(TCA)沉淀結(jié)合Folin-酚的方法，分別取水解液2 mL于5 mL離心管中，加入20%的TCA溶液2 mL，靜置20 min，4 000 r/min離心15 min，取1 mL稀釋一定倍數(shù)的上清液，采用Folin-酚法測定樣品中可溶性寡肽質(zhì)量濃度。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.003 5x+0.001 28(R2=0.997 7)。根據(jù)式(1)計算肽得率：

肽得率=m1/m0

(1)

式中,m1為水解液中TCA可溶性寡肽質(zhì)量，mg；m0為水解液中總蛋白質(zhì)量，即水解液中底物蛋白量。

1.3.5 雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液Sephadex G-25 凝膠層析分離及還原能力測定

Sephadex G-25凝膠層析柱(1.6 cm×50 cm)，去離子水平衡12 h，雌生殖腺水解液上樣量為0.5 mL，以去離子水為洗脫液，采用部分收集器收集，體積流量為每20 min 5 mL，每次收集40管，分別測定OD280及還原能力。

還原能力測定參照文獻[10]并作修正。取樣品溶液1 mL，依次加入1 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.0 mL 1%鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]溶液，混勻，在50 ℃下保溫20 min。再加入10%的三氯乙酸溶液1 mL，振蕩混勻后，4 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.3 mL 0.1%的三氯化鐵(FeCl3)溶液，靜置10 min，測定OD700，空白組以等體積去離子水代替樣品溶液。

1.3.6 變性處理雌生殖腺水解液的分子質(zhì)量分布

變性處理雌生殖腺水解液稀釋一定倍數(shù)，過0.45 μm微孔膜后，分子質(zhì)量分布采用依利特P230高效液相色譜結(jié)合Superdex Peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm)凝膠色譜柱測定。進樣量：50 μL；檢測波長：220 nm；流動相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.15 mol/L NaCl，pH 7.0)；洗脫流量：0.5 mL/min。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用Cytochrome C(12. 5 ku)，Aprotinin(6.512 ku)，18肽(2.342 ku)，Vitamin B12(1.355 ku)、N-Hippuryl-His-Leu(0.43 ku)和gly-gly (0.132 ku)。對凝膠過濾色譜而言，分子質(zhì)量的對數(shù)(y)與保留時間(x)呈線性關(guān)系，經(jīng)過計算所得分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.083 4x+5.755 4(R2=0.994 4)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦夷扇貝生殖腺的主要化學(xué)組成

經(jīng)測定，雌、雄蝦夷扇貝生殖腺原料的水分質(zhì)量分數(shù)分別為(82.63±0.05)%和(79.70±0.02)%，生殖腺中粗蛋白、粗脂肪、總糖、還原糖的質(zhì)量分數(shù)見表1。由表1可見，蝦夷扇貝生殖腺的主要成分為蛋白質(zhì)，與雌生殖腺相比，雄生殖腺的蛋白質(zhì)量分數(shù)相對較大，而雌生殖腺脂肪的質(zhì)量分數(shù)大于雄生殖腺。Palacios等[11]指出雌生殖腺在配子形成期易于富集脂肪，本研究采用的蝦夷扇貝生殖腺在4月份生殖腺指數(shù)較高，這可能是雌、雄生殖腺脂肪質(zhì)量分數(shù)差異較大的原因；雌、雄生殖腺中總糖、還原糖的質(zhì)量分數(shù)無顯著差異，Ruiz等[12]發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)的生殖腺，蛋白、脂肪和碳水化合物含量存在差異，他們用Bradford法測定的歐洲大扇貝生殖腺中蛋白質(zhì)量分數(shù)在61.2～187.3 mg/g，脂肪和碳水化合物質(zhì)量分數(shù)在6.7～20.6 mg/g和14.1～33.2 mg/g，與本研究測定的蝦夷扇貝生殖腺的化學(xué)組成結(jié)果基本一致。

表1 蝦夷扇貝生殖腺化學(xué)成分的質(zhì)量分數(shù)(4月)

2.2 蝦夷扇貝生殖腺酶解過程中的水解度變化

對蝦夷扇貝生殖腺進行變性預(yù)處理，以未變性組為對照，雌、雄蝦夷扇貝生殖腺經(jīng)中性蛋白酶酶解，水解度隨水解時間變化曲線見圖1。由圖1可見，隨著水解時間的延長，雌、雄生殖腺變性處理組和未變性處理組的水解度在30 min前顯著上升，之后水解度逐漸趨于平緩，至3 h達到平 臺期，雌生殖腺未變性和變性處理組的水解度分別達到25.08%和34.15%；雄生殖腺未變性和變性處理組的水解度分別達到18.37%和28.21%?？梢?，中性蛋白酶水解雌性生殖腺效果優(yōu)于雄性生殖腺，并且底物經(jīng)變性處理后，雌、雄生殖腺的水解度分別提高了36.16%和53.57%。究其原因可能是由于蝦夷扇貝生殖腺蛋白質(zhì)經(jīng)變性處理后，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，即二、三、四級結(jié)構(gòu)被破壞，中性蛋白酶與蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的酶切位點更容易發(fā)生作用，從而促進了酶解，這與于志鵬等[13]發(fā)現(xiàn)蛋清酶解前熱變性處理得到水解度增大的結(jié)果類似。

圖1 蝦夷扇貝生殖腺酶解過程中的水解度曲線

2.3 蝦夷扇貝生殖腺水解液中可溶蛋白、TCA可溶性寡肽質(zhì)量濃度及肽得率

經(jīng)測定，雌、雄生殖腺變性處理組和未變性處理組的水解液中，可溶蛋白、TCA可溶性寡肽質(zhì)量濃度及肽得率結(jié)果見表2。由表2可知，與雄生殖腺相比，雌生殖腺水解液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度較低，并且變性處理組的可溶蛋白的質(zhì)量濃度也低于未變性處理組，而雄生殖腺變性處理和未變性組水解液中，可溶性蛋白的質(zhì)量濃度差異不大；雌、雄生殖腺變性處理組的水解液，TCA可溶性寡肽質(zhì)量濃度以及肽得率均高于未變性處理組，其中雌、雄生殖腺變性處理組水解液中，TCA可溶性寡肽質(zhì)量濃度分別為未變性處理組的2.32和1.05倍，而雌、雄生殖腺變性處理組水解液中，肽得率分別為未變性處理組的1.95和1.27倍。以上結(jié)果表明，以雌性蝦夷扇貝生殖腺為底物，利用中性蛋白酶結(jié)合變性處理工序，能獲得較高多肽得率的水解液，酶解效果較好。

表2 蝦夷扇貝生殖腺水解液中可溶性蛋白、TCA可溶性寡肽質(zhì)量濃度及肽得率

2.4 雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液的Sephadex G-25凝膠層析分離及還原能力

以中性蛋白酶為外源酶，對雌性蝦夷扇貝生殖腺進行酶解，可獲得較高肽得率的水解液。進一步將雌生殖腺變性處理和未變性處理組的水解液，經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析分離，并監(jiān)測其還原能力，結(jié)果見圖2。 由圖2可見，未變性處理的雌生殖腺水解液經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析分離后，獲得4個主要蛋白峰，洗脫液在280 nm的吸光值分別在第10、16、24及30管出現(xiàn)峰值，其中第1、2、4峰都具有一定的還原能力，表明組分可能有一定的抗氧化活性[10]；經(jīng)變性處理的雌生殖腺水解液經(jīng)Sephadex G-25凝膠分離后，僅獲得2個主要蛋白組分，洗脫液在280 nm的吸光值分別在第9及16管出現(xiàn)峰值，二者均有一定的還原能力，表明變性處理后雌生殖腺水解液比未變性處理的水解液的分子質(zhì)量分布更為均一。

圖2 雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液的Sephadex G-25凝膠層析分離及還原能力

2.5 經(jīng)變性處理后雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液的分子質(zhì)量分布

對雌性生殖腺變性處理組水解液的分子質(zhì)量分布進行考察，結(jié)果見圖3。根據(jù)保留時間并結(jié)合峰面積，對照標(biāo)準(zhǔn)品的分子質(zhì)量和保留時間，發(fā)現(xiàn)雌生殖腺變性處理組水解液的分子質(zhì)量分布范圍主要集中于0.25～5 ku，占水解液的74.78%，符合已報道的活性多肽的分子質(zhì)量范圍。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，雄性蝦夷扇貝生殖腺經(jīng)中性蛋白酶水解后，保水效果較好，在今后的研究中將對其理化性質(zhì)進行研究。

圖3 雌性蝦夷扇貝生殖腺變性處理組水解液中肽的分子質(zhì)量分布

3 結(jié) 論

蝦夷扇貝生殖腺中粗蛋白的質(zhì)量分數(shù)分別達到干重的(62.89±0.87)%(雌性)和(81.66±0.03)%(雄性)，是制備活性肽的良好來源。利用中性蛋白酶對蝦夷扇貝生殖腺進行酶解，雌性生殖腺水解效果優(yōu)于雄性生殖腺。蝦夷扇貝生殖腺經(jīng)煮沸變性處理后，可顯著提高水解液的水解度和肽得率。結(jié)合變性預(yù)處理工序，采用中性蛋白酶對雌性蝦夷扇貝生殖腺進行酶解，可獲得低分子質(zhì)量的多肽，分子質(zhì)量分布范圍主要集中于0.25～5 ku，占水解液的74.78%。Sephadex G-25凝膠層析可以對雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液進行分離，可獲得具有還原能力的多肽組分。

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