美拉德反應(yīng)制備鮑魚臟器肽呈味基料及其抗氧化活性研究

喬 路, 周 大 勇, 李 秀 玲, 王 宏 海

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品教育部工程研究中心, 遼寧 大連 116034;2.大連工業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)貝類專業(yè)分中心, 遼寧 大連 116034;3.中科院 大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023;4.浙江工商大學(xué) 水產(chǎn)品加工研究所, 浙江 杭州 310035 )

0 引 言

肽具有復(fù)雜的呈味功能,是高檔復(fù)合調(diào)味品和香精香料的重要基料[1]。近年來研究者以低值魚[2]、低值貝類[3]及豆類加工副產(chǎn)品[4]為原料,通過生物酶解技術(shù)制備呈味肽,為這些蛋白資源的高值化利用提供了思路。美拉德反應(yīng)是非酶促褐變反應(yīng)之一,主要是指食品中的氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白質(zhì))與羰基化合物(糖類)發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)。研究表明,肽經(jīng)美拉德反應(yīng)后能夠明顯提升鮮味、醇厚感和后味,且雜味較少,口味純正[5]。同時,肽經(jīng)美拉德反應(yīng)后,表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化活性[6]。目前,采用美拉德反應(yīng)處理肽制備高抗氧化性呈味物質(zhì)的研究主要集中在植物來源的肽,而對海洋動物來源的肽相關(guān)研究較少。

作者所在課題組在前期研究中,以皺紋盤鮑廢棄物——鮑魚臟器為原料,通過生物酶解技術(shù)制備了呈味肽。在本研究中,通過美拉德反應(yīng)處理鮑魚臟器呈味肽,通過感官評定實驗和體外抗氧化實驗評價美拉德反應(yīng)對鮑魚臟器肽風(fēng)味及抗氧化活性的影響,為鮑魚臟器肽在食品中的應(yīng)用提供了新思路。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)臟器,大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供；木瓜蛋白酶,上海生工生物工程有限公司；胰蛋白酶,廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶,南寧龐博生物工程有限公司；集熱式磁力加熱攪拌器DF-101S型,江蘇金偉試驗儀器廠；LG-1.0型真空冷凍干燥機(jī),沈陽航天新陽速凍設(shè)備制造有限公司；8050超濾攪拌器,Millipore France。

1.2 鮑魚臟器肽的制備

新鮮鮑魚臟器經(jīng)清洗、勻漿、凍干、粉碎,過20目篩后得鮑魚臟器干粉。分別采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶以表1所示條件水解鮑魚臟器粉,酶解產(chǎn)物利用分子質(zhì)量10 ku的超濾膜進(jìn)行超濾分離,取分子質(zhì)量小于10 ku的組分冷凍干燥得鮑魚臟器肽。

1.3 美拉德反應(yīng)

1.3.1 優(yōu)化糖添加量

取中性蛋白酶制備的鮑魚臟器肽樣品4.5 g溶于250 mL去離子水,混勻后取4份樣品溶液(每份40 mL),各添加不同量的葡萄糖及木糖,使糖的終濃度分別為：A,木糖0.01 mol/L、葡萄糖0.04 mol/L；B,木糖0.02 mol/L、葡萄糖0.03 mol/L；C,木糖0.03 mol/L、葡萄糖0.02 mol/L；D,木糖0.04 mol/L、葡萄糖0.01 mol/L。各個樣品中再添加10 mL去離子水,置于115 ℃高壓鍋中熱反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后,樣品經(jīng)冷凍干燥得鮑魚臟器肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3.2 優(yōu)化反應(yīng)溫度

取中性蛋白酶制備的鮑魚臟器肽樣品4.5 g溶于250 mL去離子水中,混勻后取3份樣品溶液(每份40 mL),添加木糖和葡萄糖使其終濃度分別為0.02和0.03 mol/L。各個樣品中再添加10 mL去離子水,分別置于110、115、120 ℃高壓鍋中熱反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后,樣品經(jīng)冷凍干燥得鮑魚臟器肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3.3 制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物

取3種蛋白酶制備的鮑魚臟器肽各9 g,分別溶于500 mL去離子水中,混勻后添加木糖和葡萄糖使其終濃度分別為0.02和0.03 mol/L。各個樣品中再添加125 mL去離子水,置于115 ℃高壓鍋中熱反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后,樣品經(jīng)冷凍干燥得鮑魚臟器肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

1.4 感官評價實驗

1.4.1 排序檢驗法[7]

將待評定樣品溶于50 mL水中,使樣品終質(zhì)量濃度為2 mg/mL。每個待評價樣品都隨機(jī)3位數(shù)編號后,打亂順序分別交給6名感官評定員進(jìn)行風(fēng)味評定,同一個樣品每名品評員評價3次。品評員按風(fēng)味優(yōu)劣對樣品進(jìn)行排序,利用Friedman檢驗法分析處理感官評定數(shù)據(jù)。

1.4.2 風(fēng)味剖析實驗[8]

首先確定閾值范圍。以純水作參照物,閾值樣品及純水水溫控制在50 ℃左右,反復(fù)比較并取10名感官評定人員品嘗結(jié)果的平均值來確定鮮、咸、腥、苦4種味道的最低濃度即閾值,結(jié)果見表2。將待評定樣品溶于50 mL水中,使樣品終濃度為2 mg/mL。每個待評價樣品都隨機(jī)3位數(shù)編號后,打亂順序交給10名評價員進(jìn)行風(fēng)味評定,同一個樣品每名評價員評價3次。使用1～10點標(biāo)度對品評樣品進(jìn)行打分,1=閾值=參照物,10=強(qiáng)度最大值,滿分10分。

表2 感官評定閾值參照表

1.5 抗氧化活性

1.5.1 二苯代苦味酰自由基(DPPH自由基)清除作用[9]

取2 mL不同濃度的樣品溶液,加入2 mL 1×10-4mol/L的DPPH溶液,混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min,并在4 000 r/min下離心10 min,以95%的乙醇調(diào)零,在517 nm處測定上清液的吸光度As,同時測定2 mL 95%的乙醇與2 mL樣品溶液混合后的吸光度A0以及2 mL DPPH溶液與2 mL去離子水混合后的吸光度A。

按公式(1)計算清除率。以維生素C(VC)作為陽性對照。以半數(shù)清除濃度(IC50)值表示樣品對DPPH自由基的清除能力。IC50值是利用線性回歸方程計算出樣品對DPPH自由基清除率為50%時對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)。

清除率=[1-(As-A0)/A]×100%

(1)

1.5.2 清除羥自由基能力[10]

按順序分別取0.15 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.4)1.0 mL,520 μg/mL的番紅溶液0.2 mL,6 mmol/L的EDTANa2-Fe2+1.0 mL,不同濃度的樣品溶液7.0 mL,混勻,最后加入0.3%的H2O20.8 mL啟動反應(yīng),于40 ℃水浴保溫30 min,并在4 000 r/min下離心10 min,在波長520 nm處測上清吸光度值A(chǔ)s?？瞻讟悠?A0)以等體積的去離子水代替樣品溶液,對照樣品(A)以等體積的去離子水代替樣品溶液和H2O2溶液。

按公式(2)計算清除率。以VC作陽性對照。以IC50值表示樣品對羥自由基的清除能力。IC50值是利用線性回歸方程計算出樣品對羥自由基清除率為50%時對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)。

清除率=[1-(As-A0)/(A-A0)]×100%

(2)

1.5.3 還原活性測定[11]

取0.25 mL不同濃度的樣品,加入0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH 6.6)1.0 mL,1%鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]溶液1.0 mL,混勻,在50 ℃下保溫20 min。再加入10%三氯乙酸(TCA)溶液1.0 mL,振蕩混勻后在4 000 r/min下離心10 min。取上清液2.5 mL,再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵(FeCl3)溶液,靜置10 min后體系溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色,在700 nm下測吸光度值(A700)。吸光值越大,樣品的還原能力就越強(qiáng)。空白樣品以等體積去離子水代替樣品溶液,以VC作為陽性對照,以A700=0.7值表示樣品的還原能力,A700=0.7值是利用線性回歸方程計算出反應(yīng)體系在700 nm下測得吸光度值為0.7時對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.6 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析借助SPSS 15.0 分析軟件(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)實現(xiàn)。組間差異性檢驗采用單因素方差分析中的LSD法完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 美拉德反應(yīng)條件的確定

2.1.1 糖添加量

在美拉德反應(yīng)中,不同還原糖的反應(yīng)活性不同,相應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味也會出現(xiàn)差異[12]。本研究以中性蛋白酶制備的呈味肽為原料,組合使用了不同濃度的葡萄糖和木糖,制得了4個美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。6名感官評定人員對這4個樣品的風(fēng)味進(jìn)行了評價,并根據(jù)評價結(jié)果對其進(jìn)行排序,實驗結(jié)果如表3所示。對表3的感官評價數(shù)據(jù)進(jìn)行Friedman檢驗法分析,結(jié)果表明樣品之間存在顯著差異(P<0.05),說明采用不同糖配比組合制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官風(fēng)味強(qiáng)度具有顯著差異。當(dāng)木糖和葡萄糖添加量分別為0.02和0.03 mol/L時(組合B),鮑魚臟器肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味最好。張彩菊等[13]以鳙魚的酶解產(chǎn)物為基料,組合使用葡萄糖和木糖(葡萄糖與木糖的質(zhì)量比為1∶2.5)進(jìn)行美拉德反應(yīng)后,能產(chǎn)生最逼真魚香味的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

2.1.2 反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度是美拉德反應(yīng)的一個非常重要的條件參數(shù),對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味影響巨大[1]。在本研究中,使用3個不同的反應(yīng)溫度制得了相應(yīng)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。6名感官評定人員對這3個樣品的風(fēng)味進(jìn)行了評價,并根據(jù)評價結(jié)果對其進(jìn)行排序,實驗結(jié)果如表4所示。對表4的感官評價數(shù)據(jù)進(jìn)行Friedman檢驗法分析,結(jié)果表明樣品之間存在顯著差異(P<0.05),說明采用不同反應(yīng)溫度制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官風(fēng)味強(qiáng)度具有顯著差異。當(dāng)反應(yīng)溫度為115 ℃時,產(chǎn)物的風(fēng)味最好。張彩菊等[13]以鳙魚的酶解產(chǎn)物為基料,進(jìn)行美拉德反應(yīng)制備調(diào)味料時,最佳的反應(yīng)溫度也是115 ℃。

表4 不同反應(yīng)溫度制得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物品評員的評價結(jié)果

2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味剖析

課題組在前期研究中,采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解鮑魚臟器制備鮑魚臟器呈味肽。感官評價結(jié)果表明,中性蛋白酶制備的鮑魚臟器肽口味最好[14]。在本研究中,分別制備了上述3種鮑魚臟器肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,美拉德反應(yīng)條件如下：肽質(zhì)量濃度為14.4 g/L；添加木糖和葡萄糖使其終濃度分別為0.02和0.03 mol/L；反應(yīng)溫度為115 ℃；反應(yīng)時間1 h。將各個肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與中性蛋白酶制備的鮑魚臟器肽采用風(fēng)味剖析法進(jìn)行了感官評定,10名品評員的品評結(jié)果見表5。從表5可見,3種酶制備的鮑魚臟器肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的總體風(fēng)味都顯著好于中性蛋白酶制備的鮑魚臟器肽,這說明美拉德反應(yīng)能顯著提升蛋白水解肽的風(fēng)味。在3種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中,來源于中性蛋白酶的樣品風(fēng)味最好,其原因可能是由于其原料肽的呈味氨基酸含量最高、風(fēng)味最好[14]。進(jìn)一步品評各個樣品的鮮、咸、腥、苦4種主要風(fēng)味,發(fā)現(xiàn)肽經(jīng)美拉德反應(yīng)后味道更鮮,咸度適當(dāng),但腥、苦等不良味覺較弱。

Ogasawara等[15]的研究表明,大豆水解肽(1～5 ku)經(jīng)美拉德反應(yīng)后,其總體風(fēng)味得到明顯提升,將這種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物作為調(diào)味料加入到清湯中,湯的鮮味、口感延續(xù)性及口感厚度等方面都得到顯著改善。美拉德反應(yīng)提升水解肽風(fēng)味的原因是由于在美拉德反應(yīng)中會產(chǎn)生酚類、酯類、酮類、醛類、羧酸類及雜環(huán)類等多種風(fēng)味物質(zhì)[2]。

表5 風(fēng)味剖析實驗結(jié)果

2.3 抗氧化活性

研究表明,肽具有普遍的抗氧化活性[6,17]。肽經(jīng)美拉德反應(yīng)后,其抗氧化活性顯著增強(qiáng)[18]。本研究通過DPPH自由基清除實驗、羥自由基清除實驗以及還原活性實驗評價了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制備的鮑魚臟器肽以及這3種肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的體外抗氧化活性,實驗結(jié)果如表6所示。從表6可以看出,鮑魚臟器肽均具一定的DPPH自由基清除活性、羥自由基清除活性和還原能力,但活性強(qiáng)度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽性對照VC。鮑魚臟器肽經(jīng)美拉德反應(yīng)處理后,DPPH清除活性增強(qiáng)百倍以上,活性強(qiáng)度接近于VC,而羥自由基清除活性及還原能力也增強(qiáng)數(shù)十倍,活性強(qiáng)度強(qiáng)于或接近于VC。在美拉德反應(yīng)中,可生成類黑素(melanoidins)類物質(zhì),這是一類聚合度不等的高分子混合體,具有極強(qiáng)的抗氧化活性,是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性顯著增強(qiáng)的原因之一[18]。

表6 鮑魚臟器肽美拉德反應(yīng)前后的抗氧化活性

3 結(jié) 論

在14.4 g/L的鮑魚臟器肽溶液中添加木糖和葡萄糖使其終濃度分別為0.02和0.03 mol/L后,于115 ℃下反應(yīng)1 h制得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味最佳。與反應(yīng)前相比,鮑魚臟器肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的鮮味增強(qiáng),腥味及苦味減弱,總體風(fēng)味顯著提升,DPPH自由基清除活性、羥自由基清除活性及還原活性也增強(qiáng)數(shù)十倍甚至上百倍。

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