甲醛溶液固定對ICP-MS檢測電流損傷皮膚金屬化的影響

張建華，陳圓圓，2，馬棟，李立，3，陳憶九

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海200063；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州215123；3.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海200032）

甲醛溶液固定對ICP-MS檢測電流損傷皮膚金屬化的影響

張建華1，陳圓圓1，2，馬棟1，李立1，3，陳憶九1

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海200063；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州215123；3.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海200032）

目的探討應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry ICP-MS）技術(shù)檢測甲醛溶液固定后電流損傷皮膚中金屬元素。方法利用黃銅、鐵電極材料以220V交流電電擊兔子后肢，電損傷皮膚分別進(jìn)行甲醛溶液固定1周、6個月后，應(yīng)用ICP-MS對電流損傷皮膚中金屬元素進(jìn)行測定。結(jié)果與對照組皮膚比較，黃銅電擊組皮膚中檢測出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb含量升高（P＜0.05）；固定1周、6個月后仍可檢測出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb成分，其中Cr、Cu、Zn、Pb含量電擊組與固定組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，鐵電擊后皮膚中檢測出Fe、Cr、Mn、Ni元素含量升高（P＜0.05）；固定組（1周和6個月）后Fe、Cr、Ni元素含量與電擊組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論ICP-MS可作為檢測電流損傷皮膚中金屬元素的有效方法，甲醛溶液固定后觸電皮膚仍可進(jìn)行沉積的金屬元素檢測，且固定對皮膚金屬元素的含量影響較小，該方法仍可為電流損傷診斷提供依據(jù)。

法醫(yī)病理學(xué)；電擊傷；皮膚；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀；甲醛溶液；金屬化；兔

Abstract：Objective To detect metal elements in skin in electric injury by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICPMS）after fixed by formalin.Methods Brass and iron were used as electrodes to make electrical marks on rabbit hind limbs（220v AC），and the injured skin was fixed in formalin for 1 week or 6 months separately.ICP-MS was applied to detect metal elements in the injured skin.Results Compared with the control group，the levels of chromium，nickel，copper，zinc and lead were higher in the group of brass shock，and these elements were still detected in the injured skin fixed for 1 week or 6 months by formalin.Furthermore，the chromium，copper，zinc and lead concentrations showed no significant difference between the instant injured group and the fixed group.Compared with the control group，the levels of chromium，manganese and nickel were higher in the group of iron shock.Iron，chromium and nickel concentrations showed no significant difference between the instant injured group and the fixed group.Conclusion ICP-MS can be used as an effective tool to detect electric injury.After formalin fixation for as long as 6 months，deposited metal elements can still be detected in the injured skin and the fixation showed little effect on the levels of metal elements in the skin.Therefore，formalin fixed skin can provide evidence for electric injuries.

Key words：forensic pathology；electric injury；skin；inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）；formalin；metallization；rabbit

日常檢案中對電流損傷的診斷主要依靠組織學(xué)檢查，如皮膚電流斑；此外，皮膚金屬化對電流損傷的診斷有很高價值[1]，可作為電流損傷皮膚的特異性診斷指標(biāo)，而且檢測電流損傷皮膚中金屬元素的組成和含量可以推斷電極的來源[2]。然而，在實際檢案工作中，觸電皮膚多經(jīng)過甲醛溶液固定處理，這為電擊皮膚中金屬元素的檢測帶來問題。本研究應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）檢測甲醛溶液固定前、后皮膚金屬元素的含量變化，進(jìn)一步判斷甲醛溶液固定對電擊后皮膚中金屬元素的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

10%甲醛溶液固定液（0.01mmol/L PBS稀釋）。65%硝酸（優(yōu)級純，德國Merck公司），ICP-MS調(diào)諧溶液（6Li、89Y、205Tl，質(zhì)量濃度均為1μg/L，美國Agilent公司），內(nèi)標(biāo)儲備液（115In，質(zhì)量濃度10 mg/L，美國Agilent公司），混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（Al、Fe質(zhì)量濃度為1 000mg/L，Co、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Zn質(zhì)量濃度均為10 mg/L，美國Agilent公司），去離子水（18.2 MΩ.cm，由Millipore超純水處理系統(tǒng)制得）。脫毛劑（8%硫化鈉溶液）、麻醉劑（3%戊巴比妥鈉）。

1.2 儀器

7500Ce電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），MWS-3+微波消解儀（德國Berghof公司），Element A10超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司），DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。自制實驗電擊設(shè)備（可調(diào)節(jié)電壓和控制觸電時間），自制黃銅、鐵電極片（大小約0.8cm×0.8cm），電子天平（德國賽多利邦公司）。

1.3 實驗動物分組及動物模型制備

健康清潔級新西蘭大白兔32只，雌雄不分，體質(zhì)量（2±0.3）kg（復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心提供）。隨機(jī)分為黃銅電擊組、鐵電擊組，每組16只；每組各自隨機(jī)分兩亞組，一組甲醛溶液固定1周，一組甲醛溶液固定6個月，每個亞組8只。麻醉后將動物固定于實驗臺，先行剪去四肢體毛后，用脫毛劑脫凈兔毛，用去離子水反復(fù)沖洗3次，自然干燥。將自制電極片連接電極后固定于左后肢中部，另一極固定于左前肢。電擊條件：220V交流電，通電時間5s。部分兔子在通電后即死亡，部分未死亡兔子采取空氣栓塞致死。即刻沿電擊邊緣完整提取左后肢觸電部位皮膚，剔除多余的脂肪組織，并等分為兩份，一份直接用于檢測，一份于甲醛溶液固定后再檢測，一組在甲醛溶液固定1周后取出，一組在甲醛溶液固定6個月后取出；同時提取右后肢相應(yīng)部位正常皮膚作為對照組。所有檢材均先置于電熱恒溫培養(yǎng)箱（60℃）干燥2h后備檢。

1.4 檢測

1.4.1 工作溶液配制[3]

內(nèi)標(biāo)工作溶液：吸取適量的內(nèi)標(biāo)儲備液用5%硝酸溶液配制得質(zhì)量濃度為20 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液。置于冰箱冷藏保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液于樣品瓶中，加5%硝酸溶液逐級稀釋得混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各元素質(zhì)量濃度均為100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01和0.001 μg/L?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液置于冰箱冷藏保存。

1.4.2 樣品前處理

分別精確稱量樣本置于消解罐中，加入3 mL 65%硝酸溶液，將消解罐裝入消解裝置進(jìn)行消解，消解程序見表1[3]。消解完成后，取出消解罐，待其溫度降至室溫后將消解液轉(zhuǎn)移至ICP-MS專用樣品瓶，并用少量去離子水連續(xù)沖洗消解罐3次，合并倒入樣品瓶，繼續(xù)加入去離子水至40.0 g。同時精確稱量電擊材料，加入適量65%硝酸消解后，逐級稀釋至200倍待測。

表1 微波消解程序

1.4.3 ICP-MS分析條件

采用標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行檢測，儀器用調(diào)諧溶液調(diào)諧，在整個質(zhì)量范圍內(nèi)具有高靈敏度及低干擾水平（CeO+/ Ce+<1%和Ce2+/Ce+<3%）。ICP-MS相關(guān)參數(shù)為：RF功率1500 W，采樣深度8.1 mm，載氣流速0.86 L/min，補(bǔ)償氣流速0.22 L/min，同心霧化器，霧化室溫度2℃，采用屏蔽矩系統(tǒng)，蠕動泵轉(zhuǎn)速0.1 r/min。以115In元素作為內(nèi)標(biāo)，并采用在線內(nèi)標(biāo)加入法將內(nèi)標(biāo)工作液和樣品消解液一并通過蠕動泵導(dǎo)入ICP-MS系統(tǒng)。ICP-MS檢測器模式采用自動模式，元素的積分時間為23s，每種元素重復(fù)測定次數(shù)為3次。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS for windows 15.0軟件包，應(yīng)用區(qū)組設(shè)計多樣本均數(shù)比較的方差分析或非參數(shù)檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系和線性范圍

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)測定，各金屬元素響應(yīng)值（y）與質(zhì)量濃度（x）的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍見表2。

表2 工作溶液的線性相關(guān)系數(shù)、線性方程、線性范圍（μg/L）

2.2 電極材料中金屬元素組成及含量

黃銅、鐵電極材料中元素組成及含量詳見表3。

表3 黃銅及鐵電極元素組成及含量（μg/g）

2.3 黃銅電擊皮膚檢測結(jié)果

黃銅電擊后皮膚檢測出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb成分，與對照組存在明顯差別，皮膚固定1周、6個月后仍可檢測出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb成分，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中Cr、Cu、Zn、Pb含量固定前、后差異無統(tǒng)計學(xué)意義；雖然固定后Ni元素含量降低，但與對照組間仍存在差別，該實驗結(jié)果表明甲醛溶液固定后黃銅電擊皮膚中沉積的金屬元素測定仍具有價值。詳見表4、表5。

2.4 鐵電擊皮膚甲醛溶液固定后檢測結(jié)果

鐵電擊皮膚中檢測出Fe、Cr、Mn、Ni元素成分，與對照組存在差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，固定1周和6個月后Fe、Cr、Ni元素含量與固定前差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，且固定后Fe、Cr、Mn、Ni元素含量與對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；固定后Mn元素含量比固定前Mn元素含量降低，但與對照組比較固定前后Mn元素含量均無統(tǒng)計學(xué)意義；該實驗結(jié)果表明甲醛溶液固定后鐵電極電擊皮膚中沉積的金屬元素測定仍具有價值。詳見表6、表7。

表4 黃銅電擊后及甲醛溶液固定后1周后兔子皮膚中各種金屬元素含量變化

表4 黃銅電擊后及甲醛溶液固定后1周后兔子皮膚中各種金屬元素含量變化

1）與正常對照組比較，P＜0.05；2）與固定前比較，P>0.05

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表5 黃銅電擊后及甲醛溶液固定后6個月后兔子皮膚中各種金屬元素含量變化

表5 黃銅電擊后及甲醛溶液固定后6個月后兔子皮膚中各種金屬元素含量變化

1）與正常對照組比較，P＜0.05；2）與固定前比較，P>0.05

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表6 鐵電擊后及甲醛溶液固定1周后兔子皮膚中各種金屬元素含量變化

1）與正常對照組比較，P＜0.05；2）與固定前比較，P>0.05

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表7 鐵電擊后及甲醛溶液固定6個月后兔子皮膚中各種金屬元素含量變化

表7 鐵電擊后及甲醛溶液固定6個月后兔子皮膚中各種金屬元素含量變化

1）與正常對照組比較，P＜0.05；2）與固定前比較，P>0.05

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3 討論

目前對電流損傷的研究表明皮膚金屬化對電流斑的診斷有很高價值，可作為電流損傷皮膚的特異性診斷指標(biāo)，同時檢測這些可疑電流損傷的金屬元素就可以推斷其與金屬材料的接觸和確定電極的主要成分[1]。對皮膚金屬化研究多集中在電流損傷的直接檢測，對日常檢案中經(jīng)過甲醛溶液固定后的電擊皮膚國內(nèi)外很少有人研究。王曉峰[4]等人利用原子吸收分光光度計檢測10%甲醛溶液固定后皮膚上銅元素含量，得出甲醛溶液固定后進(jìn)行金屬元素的檢測仍有實際意義。ICPMS可以進(jìn)行多種元素同時檢測，分析速度快，檢測元素種類多，對電擊材料的來源的推測提供更可靠的證據(jù)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ICP-MS可作為電流損傷皮膚金屬化的有效檢測手段，通過定量分析亦可進(jìn)一步推斷觸電材料[1]。

本研究通過用黃銅、鐵電極材料對兔子進(jìn)行電擊，電擊后皮膚經(jīng)過甲醛溶液固定1周和6個月，研究甲醛溶液固定對皮膚金屬化檢測的影響。根據(jù)組織切片的制作和檢材銷毀處理的時間，本研究分別選取1周和6個月為甲醛溶液固定的時間點。對于電流斑不明顯，而組織學(xué)檢驗電流損傷不明顯的案例，需要利用皮膚金屬化檢測進(jìn)行輔助診斷，此時皮膚固定時間已經(jīng)達(dá)到1周；對于重復(fù)鑒定案例，此時皮膚固定已經(jīng)達(dá)到幾個月之久，此時對固定后皮膚金屬化檢測的可靠性、有效性仍然需要進(jìn)行探討。因此，本研究選取上述兩個時間點對皮膚進(jìn)行甲醛溶液固定后，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行檢測。

可以看出，黃銅電擊后皮膚檢測出Cr、Ni、Cu、Zn、 Pb成分，與對照組存在明顯差別，皮膚固定1周、6個月后仍可檢測出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb成分，其中Cr、Cu、Zn、Pb含量固定前后無明顯差別，Ni元素含量固定后減少，但與對照組間仍存在差別，分析Ni元素含量減少的原因，可能是本身電極中Ni的含量比較少，導(dǎo)致沉積于皮膚的量也比較少，或由于浸泡粘附于表面的Ni元素脫落。鐵電擊皮膚中檢測出Fe、Cr、Mn、Ni元素成分，與對照組存在明顯差別，固定1周和6個月后Fe、Cr、Ni元素含量與固定前無明顯差別，固定后Mn元素含量比固定前Mn元素含量降低，但與對照組比較固定前后Mn元素含量均無統(tǒng)計學(xué)意義；分析Mn元素含量減少的原因亦可能是本身鐵電極中Mn的含量就比較低，沉積于皮膚中的Mn元素也比較少，或由于浸泡使沉積于皮膚中的金屬元素減少。

4 結(jié)論

在甲醛溶液固定后雖然有部分金屬元素含量減少，但主要的金屬元素種類和含量變化不大，說明電擊后皮膚即使經(jīng)過長時間甲醛溶液固定，仍可應(yīng)用ICPMS進(jìn)行皮膚金屬化檢測，可作為皮膚電流損傷的診斷依據(jù)。同時通過主要元素的種類和含量比較，仍可進(jìn)行觸電材料的同一性推斷分析，比如黃銅電擊甲醛溶液固定后皮膚同時檢測出Cr、Ni、Cu、Zn等元素，鐵電擊皮膚甲醛溶液固定后同時檢測出Cr、Fe、Ni等元素，部分微量元素的檢出在電擊材料的同一性推斷中，起到重要作用。

[1]Marcinkowski T，Pankowski M.Significance of skin metallization in the diagnosis of electrocution[J].Forensic Sci Int，1980，16（1）：1-6.

[2]陳圓圓，張建華，馬棟，等.電感耦合等離子質(zhì)譜法檢測電流損傷皮膚中金屬元素[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（1）：6-9.

[3]馬棟，沈敏，卓先義，等.血液中Cr、Cd、As、Tl和Pb的電感耦合等離子體質(zhì)譜分析[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（1）：37-39.

[4]王曉峰，龔利麻，孫景文.電燒傷皮膚金屬元素的測定.中國法醫(yī)學(xué)雜志[J].1987，2（2）：101-103.

（本文編輯：劉寧國）

Influence of Formalin Fixation on ICP-MS Detection of Metal Elements in Skin in Electric Injury

ZHANG Jian-hua1，CHEN Yuan-yuan1，2，MA Dong2，LI Li1，3，CHEN Yi-jiu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，Shanghai 200063，China；2.Department of Forensic Medicine，Medical College of Soochow University，Suzhou 215123，China；3.Department of Forensic Medicine，Shanghai Medical College，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2011.01.006

1671-2072-（2011）01-0026-04

2010-07-22

中央級科研院所公益性項目（GY0707）

張建華（1976-），男，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。E-mail：zjh7693@163.com。

陳憶九（1962-），男，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。E-mail：yijiuchen@yahoo.com.cn。