HPLC測定防鳳中色原酮的含量

陳桂玉1，郭洪麗2，項東宇1*

（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W校，山東 煙臺 26410 0；2.吉林省白山市食品藥品檢驗所，吉林 白山 13430 0）

HPLC測定防鳳中色原酮的含量

陳桂玉1，郭洪麗2，項東宇1*

（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W校，山東 煙臺 26410 0；2.吉林省白山市食品藥品檢驗所，吉林 白山 13430 0）

目的：建立高效液相法測定防風中4種色原酮的方法。方法：采用DiamonsilC18（4.6mm×200mm，5μm）色譜柱；流動相：甲醇－水梯度洗脫（甲醇：0～15min，20%～45%；15～25m i n，45%～70%）；流速1m L·min－1。柱溫30℃；波長254nm。結果：升麻素苷在0.15～3μ g、升麻素在0.0 2～0.4μ g、5-O-甲基維斯阿米醇苷在0.25～5μ g、亥茅酚苷在0.0 1～0.2μ g線性關系良好。結論該方法快速簡便，準確可靠，可用于防風中4種色原酮的測定。

防風；微波提??；色原酮

防風Saposhni kovia div aricata（Turcz.）Schischk.為傘形科防風屬多年生草本植物，現(xiàn)收載于 《中國藥典》2010年版一部，以未抽薹的干燥根入藥，是我國重要的藥用植物。具有祛風解表，勝濕止痛，止痙的功能［1］。現(xiàn)代藥理研究其主要的活性成分有升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷等色原酮類以及多糖、揮發(fā)油等，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集等多種功效［2-3］。目前，評價防風藥材以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷4種色原酮為主要藥效物質(zhì)和質(zhì)量控制評價指標［4］。本文以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷4種色原酮為指標，建立了高效液相色譜法測定防風中4種色原酮的方法，為防風藥材色原酮的測定提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CEM-MAR S5微波萃取儀（美國CEM公司）；Agilent1100高效液相色譜儀（在線脫氣機、四元泵、DAD檢測器、手動進樣器和Agilent化學工作站）；AUY220電子天平；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 材料

防風采于吉林農(nóng)業(yè)大學藥用植物園 （批號：20101012，20101013，20101014），經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學楊利民教授鑒定為防風Saposhni kovia divaricata（Turcz.）Schischk.。升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷對照品 （中國藥品生物制品檢定所，批號分別為：111522，111710，111523，111714）。

2 方法與結果

2.1 色譜分析條件

DiamonsilC18（4.6mm×20 0mm，5μm）色譜柱，柱溫：30℃；波長：254nm；甲醇－水梯度洗脫（甲醇：0～15min，20%～45%；15～25m in，45%～70%），流速：1m L·min－1。

2.2 供試品溶液的制備

防風根經(jīng)45℃烘干，粉碎過30目篩。精密稱取0.5g樣品，加入70%乙醇，稱定重量，90℃微波提取4min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，定容于25m L容量瓶中，進樣前過0.45μm濾膜。

2.3 混合對照品溶液的配制

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥后的升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷適量，配成濃度為：升麻素苷0.3m g·m L－1、升麻素0.0 4m g·m L－1、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.5m g·mL－1和亥茅酚苷0.02m g·m L－1的混合對照品溶液。分別精密量取0.25，1，2，3，4，5m L，定容于10m L容量瓶中。

2.4 標準曲線的制備

分別吸取上述對照品溶液20μ L，按色譜條件進樣，測定峰面積。以色譜峰面積為縱坐標 （Y），進樣量為橫坐標 （X），繪制標準曲線，計算回歸方程。升麻素苷Y＝3.29×103X＋68.77，r＝0.9998，線性范圍：0.15～3μ g；升麻素：Y＝2.58×103X＋7.52，r＝0.9997，線性范圍：0.0 2～0.4μ g；5-O-甲基維斯阿米醇苷：Y＝2.0 1×103X＋68.75，r＝0.9996，線性范圍：0.25～5μ g；亥茅酚苷：Y＝4.13×103X＋5.31，r＝0.9997，線性范圍：0.0 1～0.2μ g?；旌蠈φ掌泛凸┰嚻返纳V圖見圖1。

圖1 混合對照品和供試品的HPLC圖

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液20μ L，按上述色譜條件，每隔4h進樣1次，共測定7次。計算4種色原酮峰面積。結果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的R S D值分別為1.41%，2.0 9%，2.13%，1.74%，表明24h內(nèi)4個對照品穩(wěn)定性良好。

2.6 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液20μ L，按上述色譜條件進行分析，連續(xù)5次，計算4種色原酮峰面積積分的RSD值分別為0.91%，1.54%，1.76%，1.95%。

2.7 重復性試驗

精密稱取防風樣品（2010 10 12）5份，按上述操作方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液20μL，按照上述色譜條件測定峰面積，結果4種色原酮峰面積積分的R S D分別為1.74%，2.68%，2.30%，2.16%。

2.8 回收率試驗

取已知含量供試品（2010 10 12）5份，各0.5g，經(jīng)2.2方法制備后分別加入定量升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及亥茅酚苷對照品，按上述色譜條件測定，計算4種色原酮的回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取防風樣品3份，按照上述方法進行含量測定，結果見表2。

表1 色原酮加樣回收率測定 /%

表2 防風樣品中4種色原酮含量測定結果 /%

3 討論

實驗曾采用 《中國藥典》2010年版防風藥材測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的方法，即甲醇－水（40∶60）作流動相，流速1m L·min－1時，亥茅酚苷出峰時間延后，峰形變寬；實驗還考察了甲醇－水 （50∶50）、甲醇－水梯度洗脫 （甲醇：0～30m i n，15%～70%；0～15m i n，20%～45%，15～25m i n，45%～70%等）作為流動相，最后確定甲醇：0～15min，20%～45%，15～25min，45%～70%梯度洗脫作為流動相，4種色原酮峰的對稱性好，與其他物質(zhì)峰達到完全分離，且保留時間適中，故選為本文的色譜條件。在選定的色譜條件下，該方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率試驗均符合要求，因此可作為防風藥材4中色原酮含量的測定方法。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：140.

［2］張貴君，李影.我國生藥防風近10年的研究概況［J］.時珍國藥研究，1997，8（1）：73-75.

［3］薛寶云，李文，李麗，等.防風色原酮甙類成分的藥理活性研究［J］.中國中藥雜志，2000，25（5）：297-299.

［4］孫暉，曹玲，王喜軍.防風藥效物質(zhì)基礎季節(jié)積累規(guī)律的研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，20 0 3，10（6）：355-356.

Determination of the Chromones Contents of Saposhnikovia divaricata by HPLC

CHEN Gui-yu1，GUO Hong-li2，XIANG Dong-yu1
（1．Shangdong College of Traditional Chinese medicine，Yantai 264100，China；2.Baishan Institute for Food＆Drug Control，Jilin Provence，Baishan134300，China）

Objective：A HPLC method was established for determination of the chromones contents ofSaposhni-kovia divaricata.Methods：A Diamonsil C18（4.6mm×20 0mm，5μm）was used with gradient elution of methanol and water that methanol increased from20% to45%in 15minute，and then increased from 45% to 70% until 25 minute as mobile phase；the flow rate was1.0m L·min－1at30℃and the detector wave length was254nm.Results：The re-lationships between the concentration and the peak area of 4 chromones were good linear relation.The calibration curve of prim-O-glucosylcimifugin，cimifugin，5-O-methylvisammioside and sec-O-glucosylhamaudol were at the range of 0.15～3μg，0.02～0.4μg，0.25～5μg and 0.01～0.2μg.Conclusion：The method was rapid，sensitive and accu-rate，and could be used for the determination of chromones of S．divaricata．

Saposhnikovia divaricata；Microwave extraction；Chromones

*項東宇，E-mail：chengy1978＠126.com

2011-0 5-30）