大鼠腦彌漫性軸索損傷后早期病理學(xué)的研究

陳仁輝

(福建警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系,福建福州 350007)

大鼠腦彌漫性軸索損傷后早期病理學(xué)的研究

陳仁輝

(福建警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系,福建福州 350007)

目的:探討大鼠腦彌漫性軸索損傷(DAI)后早期軸索病理學(xué)改變及c-Fos蛋白的變化,為DAI的早期法醫(yī)病理學(xué)鑒定尋找新的依據(jù)1方法:參照Marmarou的打擊負荷傷模型,建立大鼠DAI動物模型1運用神經(jīng)纖維特殊染色法觀察軸索的病理學(xué)改變,并運用免疫組化SABC法觀察c-Fos的變化1結(jié)果:嗜銀染色于打擊后1 h即可觀察到部分神經(jīng)纖維不規(guī)則增粗、腫脹、少數(shù)斷裂,6 h觀察到軸突斷端球形改變,24 h可見典型軸索收縮球1打擊后15 min時,即可觀察到c-Fos的表達,3 h達到高峰,24 h后仍可見一定量表達,表達呈彌漫性,以胼胝體、腦干最為明顯1對照組未見陽性反應(yīng)1結(jié)論:嗜銀染色可以很好的觀察DAI后軸索的病理學(xué)改變1c-Fos是腦彌漫性軸索損傷的靈敏指標,對于早期DAI的診斷具有一定的應(yīng)用價值.

彌漫性軸索損傷; 嗜銀染色; c-Fos; 免疫組織化學(xué)

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury1DAI)是顱腦損傷的一種重要形式,它在重型閉合性顱腦損傷中占20%1DAI可以導(dǎo)致顱腦損傷患者死亡(死亡率高達42%～62%[1])、植物生存或嚴重的神經(jīng)功能障礙,是外傷性腦損傷中最嚴重的損傷之一1DAI由于缺乏特異性的神經(jīng)定位體征以及影象學(xué)改變,其最終診斷需要通過組織病理學(xué),但是早期的DAI往往沒有典型的病理學(xué)改變,所以如何鑒定早期的DAI是法醫(yī)病理學(xué)工作者面臨的一大難題.

本研究擬通過建立大鼠DAI動物模型,運用神經(jīng)纖維特殊染色法觀察不同時間、不同部位軸突的病理學(xué)改變1并對其不同時間、不同部位腦損傷后c-Fos表達的變化進行觀察,期望能為DAI早期法醫(yī)學(xué)鑒定提供客觀的病理形態(tài)學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康雄性SD大鼠48只(南京青龍山實驗動物中心提供),體重300～350 g,隨機分成DAI 15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h組及對照組,共8組1每組6只大鼠.

1.2 DAI動物模型制作 采用Marmarou腦損傷模型[2],用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(30 mg/kg),麻醉成功后,大鼠頭部做中線切口,暴露顱骨,將直徑10 mm、厚3 mm的打擊墊片用高分子聚脂固定于顱頂?shù)墓跔羁p與人字縫之間的中央部,然后將大鼠俯臥固定

已知厚度及彈性系數(shù)的海綿床上,待動物開始蘇醒,有肢體活動時,移至有機塑料管下端,墊片正對管中央1450 g鐵棒從2 m高度自管內(nèi)自由墜落至打擊墊片上,立即移開海綿床以免二次損傷1在設(shè)定的時間內(nèi)將動物過量麻醉后,斷頭取腦.

1.3 組織及切片處理 打開顱骨后迅速用4%多聚甲醛液預(yù)固定,取出大鼠全腦于4%多聚甲醛液后固定12 h,沿大腦正中裂矢狀切開大腦、小腦、腦干,于正中切面左右外側(cè)3 mm處切取左右大腦皮質(zhì)、胼胝體、丘腦以及腦干組織各一塊,分別做常規(guī)石蠟包埋1切片厚5 um,分別作HE染色、嗜銀染色及c-Fos免疫組織化學(xué)染色.

1.4 試劑及方法 硝酸銀、氯化金、硫代硫酸鈉、飽和氨水,按G lees-Marslands染色法[3]進行1Rabbit Anti -C-FOS(北京金山公司);DAB顯色試劑盒及SABC試劑盒(武漢博士德公司),按說明書進行操作1用PBS取代一抗、二抗作陰性對照,以細胞核/漿出現(xiàn)黃色產(chǎn)物為陽性結(jié)果.

2 結(jié)果

2.1 動物觀察

動物受到打擊后,出現(xiàn)即刻的呼吸暫停數(shù)秒,隨即進入持續(xù)昏迷狀態(tài),有的動物在昏迷期間偶伴抽搐1所有的動物表現(xiàn)為豎毛,少數(shù)動物出現(xiàn)尿失禁、全身痙攣、四肢強直15只動物(約10%)于打擊后數(shù)分鐘

呼吸停止,死亡1動物清醒后表現(xiàn)為活動減少,部分出現(xiàn)肢體活動受限1對照組動物無明顯變化.

2.2 HE染色

實驗組可見蛛網(wǎng)膜下腔出血,少數(shù)動物可見腦干有淤斑性出血、側(cè)腦室出血1未見腦組織局灶性病灶1神經(jīng)元胞體明顯腫脹,結(jié)構(gòu)不清,核固縮,胞漿紅染加深,神經(jīng)元損害主要分布于兩側(cè)大腦皮質(zhì)1膠質(zhì)細胞腫脹明顯1細胞周圍間質(zhì)水腫.

2.3 嗜銀染色

打擊后1 h即可觀察到部分神經(jīng)纖維不規(guī)則增粗、腫脹、少數(shù)斷裂(圖1),6 h神經(jīng)纖維明顯增粗、腫脹并呈串珠狀、波浪狀或螺旋狀改變,斷端膨大呈球形(圖2),12 h收縮球較為明顯,24 h可見典型軸索收縮球,且數(shù)量增多(圖3).

圖1 腦損傷后1 h,少數(shù)神經(jīng)纖維不規(guī)則增粗 嗜銀染色×400

圖2 腦損傷后6 h,神經(jīng)纖維明顯增粗,呈波浪狀改變 嗜銀染色×400

圖3 腦損傷后24 h,神經(jīng)纖維斷端球形改變 嗜銀染色×400

圖4 腦損傷后15 min,c-Fos陽性反應(yīng)細胞,散在少量分布 SABC×200

2.4 c-Fos免疫組織化學(xué)染色

打擊后15 min,即可觀察到c-Fos陽性反應(yīng)細胞,呈散在少量分布(圖4).陽性產(chǎn)物呈棕黃色,主要位于胞核內(nèi),胞漿內(nèi)以及大的突起根部也有表達(圖5). 1 h后表達明顯增加,并于3 h達到高峰(圖6).隨著時間延長,c-Fos陽性反應(yīng)細胞逐漸減少,24 h可見少量表達.表達以皮層、腦干最為明顯,陽性反應(yīng)細胞包括神經(jīng)元及各類膠質(zhì)細胞.正常對照組未見c-Fos陽性反應(yīng)細胞.

圖5 腦損傷后,c-Fos陽性反應(yīng)產(chǎn)物在胞核、胞漿以及大的突起根部表達 SABC×200

圖6 腦損傷后3 h,c-Fos陽性反應(yīng)細胞明顯增加 SABC×200

3 討論

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury1DAI)是一種特殊類型的腦損傷,它是從病理學(xué)角度提出的概念,其發(fā)現(xiàn)至今已有數(shù)十年的時間.嗜銀染色是顯示神經(jīng)軸突的傳統(tǒng)方法,可用于觀察軸突在損傷后的病理改變,如彎曲、腫脹、斷裂及回縮球形成等.有研究發(fā)現(xiàn)[4],神經(jīng)軸突在傷后1～2 h,軸索變粗,進而腫脹呈串珠狀、波浪狀或螺旋狀改變,傷后12 h以上,出現(xiàn)典型軸索收縮球.本研究發(fā)現(xiàn)DAI后1 h即可觀察到部分神經(jīng)纖維不規(guī)則增粗、腫脹、少數(shù)斷裂,6 h斷端膨大呈球形,12 h收縮球較為明顯,24 h可見典型軸索收縮球1這與文獻報道基本一致.嗜銀染色可以較早、較好的觀察軸索的病理學(xué)改變.

近年來,隨著對DAI研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)外力除引起原發(fā)性軸索損傷(primary axonal injury)外,更多的是導(dǎo)致非中斷性軸索損傷(nondisruptive axonal injury)[5],即軸索在受傷當時并不出現(xiàn)斷裂,而是隨病程發(fā)展,軸索逐漸出現(xiàn)繼發(fā)性病理改變,最終于傷后數(shù)小時才發(fā)生軸索中斷,即繼發(fā)性軸索斷裂(secondary axonal injury)1非中斷性軸索損傷后至延遲性軸索斷裂及軸縮球的形成,這期間是一個復(fù)雜的病理生理學(xué)過程1c-Fos是c-fos基因激活后轉(zhuǎn)錄生成的mRNA編碼的核蛋白1當神經(jīng)組織受到病理性刺激如腦缺血、癲癇和外傷等作用時,c-fos基因快速表達[6,7],因此被稱為快速反應(yīng)原癌基因(pro-oncogene),屬于即早基因家族(immediate early gene,IEGS).c-fos基因被激活后通過fos/jun二聚體,構(gòu)成活化蛋白-1(AP-1)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的表達[8],所以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)對創(chuàng)傷的初始應(yīng)答與繼發(fā)性病理生理改變之間c-fos基因的激活可能成為重要的中介.本研究發(fā)現(xiàn)打擊后15 min,即可觀察到c-Fos陽性反應(yīng)細胞,1 h后表達明顯增加,并于3 h達到高峰,24 h后可見少量表達.c -fos基因的早期表達是對外界損傷性刺激直接而快速的反應(yīng),它的中介作用可能啟動了繼發(fā)性軸索斷裂.

Smeyne等[9]學(xué)者認為c-fos過度表達似乎是細胞終末分化的標志及死亡先兆,且先于細胞出現(xiàn)生化和死亡形態(tài)學(xué)改變數(shù)小時至數(shù)天.c-fos基因表達是神經(jīng)組織受傷害的早期指標.本研究發(fā)現(xiàn)在嗜銀染色尚未檢見DAI病理改變時,c-Fos就有表達,c-Fos是DAI的靈敏指標,當然由于神經(jīng)組織受到其他病理性刺激如腦缺血、癲癇等作用時也有表達,所以c-Fos用于DAI的早期診斷時需要結(jié)合大體及病史1我們認為c-Fos對于早期DAI的診斷具有一定的應(yīng)用價值1參考文獻:

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[3]孔慶雷譯.組織病理學(xué)與組織化學(xué)技術(shù)手冊(第1版) [M].北京:科學(xué)出版社,1982,445-446.

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[9]Smeyne RJ,Vendrell M,Hayward M et al.Continous c-fos expression precedes programmed celldeath in vivo[J]. Nature,1993,363(1):166-174.

Abstract:Objective:T o explore the changes of c-Fos in early stage of diffuse axonal injury(DAI)in rats so as to find a new evidence for early forensic pathologic diagnosis of DAI.Methods:Based on Marmarou's impact/compression trauma model, the rat model of DAIwas established.ImmunohistochemicalSABC method was used to observe the expressionof c-Fos,combining special stainingof neurol fibers to observe the changesof axons.Results:It wasfound that swollen and ruptured axon in brain stem at 1h,marked swelling of the axonal severe end at 6 h,axonal retraction ball at 24 h by silver staining after DAI.The expression of c-Fos could be detected at 15 min after injury,peaked at 3 h.The expression of c-Fos was found in wide range but significant in callus and brain stem.The control group showed negative staining.Conclusion:Silver staining is a good way to observe the changes of axons.c-Fos is a sensitive index to DAI and is helpful to diagnose early DAI.

Key words:diffuse axonal injury; silver staining; c-Fos; immunohistochemistry

A Study on Pathologic Changes in Early Stage of Diffuse Axonal Injury in Rats

CHEN Ren-hui
(Department of Criminal Sciences and Technology,Fujian Police Institute,Fuzhou,Fujian 350007)

Q956

A

1671-9743(2011)02-0048-05

2010-12-01

福建省教育廳資助,課題編號:JA071901

陳仁輝(1979-),男,安徽寧國人,福建警察學(xué)院講師,碩士,主要從事閉合性顱腦損傷的分子病理學(xué)研究.