生物傳感器法測定蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率常數(shù)*
——經(jīng)典動力學實驗的綜合性設(shè)計示例

楊海朋 柳文軍 蘇軼坤 肖飛 戈早川 湯皎寧

(深圳大學材料學院深圳市特種功能材料重點實驗室 廣東深圳 518060)

測定化學反應(yīng)的速率常數(shù)是物理化學實驗中動力學部分的重要內(nèi)容。根據(jù)不同化學反應(yīng)的特點，實驗教材常常采用不同方法測定反應(yīng)的速率常數(shù)，如電導法、旋光法、分光光度法等[1]。這些實驗方法由于有助于開闊學生的眼界，訓練基本實驗技能，已為眾多高校物理化學實驗教學所采用。此外，為了完善創(chuàng)新人才培養(yǎng)機制，提高本科生培養(yǎng)水平，還需要在教學中設(shè)置一些綜合性實驗[2]。本文介紹將“旋光法測定蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率常數(shù)”這一經(jīng)典動力學實驗改造為綜合性實驗的探索。

生物傳感器通常由生物識別元件(bioreceptor)和信號轉(zhuǎn)換器件(transducer)兩個部分組成，其中生物識別元件由生物活性物質(zhì)(酶、抗原、抗體、激素等)或生物體本身(細胞、細胞器、組織等)構(gòu)成，而信號轉(zhuǎn)換器通常是一個獨立的化學或物理敏感元件，可采用電化學、光學、熱學、壓電等多種不同原理工作。把生物識別元件同信號轉(zhuǎn)換器件相結(jié)合，就可以構(gòu)成多種多樣的生物傳感器[3-6]。納米電化學生物傳感器是將納米材料作為一種新型的生物傳感介質(zhì)，與特異性分子識別物質(zhì)如酶、抗原/抗體、DNA等相結(jié)合，并以電化學信號為檢測信號的分析器件。由于生物傳感器的生物識別單元選擇性專一，可以獲得很好的抗干擾能力和極高的靈敏度。包括電化學生物傳感器在內(nèi)的生物傳感器自誕生以來就一直是科學工作者關(guān)注的熱點[6-7]。

本實驗設(shè)計根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的特點，引入作者課題組最新制備的碳納米管-聚環(huán)糊精葡萄糖生物傳感器[5]，通過對反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖濃度的原位測定，計算出蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率常數(shù)。把這一經(jīng)典動力學實驗與當前的科研熱點內(nèi)容相結(jié)合，使其成為一個綜合性探索實驗項目。

1 實驗設(shè)計原理

在催化劑(H+離子或者蔗糖酶)存在的條件下，蔗糖在水中可以水解為葡萄糖和果糖，反應(yīng)如下：

蔗糖水解反應(yīng)是一個二級反應(yīng)。但由于水是大量存在的，在反應(yīng)過程中可以認為濃度不變；反應(yīng)過程中的氫離子是催化劑，可以認為濃度不變。因此，蔗糖水解反應(yīng)可作為一級反應(yīng)來處理，又稱為“假一級反應(yīng)”。如果以c表示t時刻的反應(yīng)物濃度，k表示反應(yīng)速率常數(shù)，則反應(yīng)的速率方程為：-dc/dt=kc。對此式積分可得：

lnc=-kt+b

(1)

式中b為積分常數(shù)。 在不同時間測定反應(yīng)過程中的反應(yīng)物濃度，以lnc對t作圖，可以求出反應(yīng)的速率常數(shù)k。

由于反應(yīng)是不斷進行的，因此需要即時分析出反應(yīng)物蔗糖的濃度。在實驗教材中是根據(jù)反應(yīng)物蔗糖和產(chǎn)物葡萄糖及果糖旋光能力的不同，利用體系在反應(yīng)進程中旋光度的變化來分析蔗糖濃度的變化[1]。

由于蔗糖分解產(chǎn)物是穩(wěn)定存在的葡萄糖和果糖，蔗糖濃度降低速率等于葡萄糖或果糖濃度增加速率。因而傳感器只要能夠測定這3種物質(zhì)中任意一種物質(zhì)的濃度變化就可以了。本文采用納米電化學葡萄糖生物傳感器，通過檢測葡萄糖濃度的變化計算反應(yīng)速率常數(shù)。

設(shè)葡萄糖的濃度為cg，蔗糖初始濃度為c0，則蔗糖濃度c=c0-cg。葡萄糖濃度cg正比于傳感器響應(yīng)電流的大小，設(shè)比例系數(shù)為a，則cg=aI，c0=aI∞，I∞是反應(yīng)終了時的電流強度(此時可認為蔗糖已全部轉(zhuǎn)化為葡萄糖及果糖)。代入公式(1)，得到：

ln(I∞-I)=-kt+b′

(2)

實驗中測得I-t曲線和I∞，以-ln(I∞-I)對t作圖，所得直線的斜率就是蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率常數(shù)k。

2 實驗示例

2.1 傳感器制備

把一定量的碳納米管(CNT)放入環(huán)糊精(CD)和預聚環(huán)糊精的混合液中超聲混合，用微量進樣器吸取混合液20μL,置于干凈的玻璃片上，加入20μL 2.5%戊二醛和0.2mol/L鹽酸的等比例混合液，攪拌均勻。再用微量進量器吸取20μL上述溶液滴到Pt電極上，在室溫下自然晾干后，得到聚環(huán)糊精-碳納米管(CDP-CNT)復合膜修飾電極。在CDP-CNT膜上滴加3μL 葡萄糖氧化酶(Gox)溶液和3μL 2.5%戊二醛溶液，待其在室溫下干燥后即得到CDP-CNT復合膜修飾的納米電化學葡萄糖生物傳感器。

2.2 葡萄糖濃度測定

圖1 連續(xù)加入葡萄糖溶液時傳感器的電流響應(yīng)曲線

以飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，利用CHI660C電化學工作站測定體系的電流-時間信號[5]。電流測量過程為：在不含底物的緩沖溶液中施加一定電壓，當背景電流趨于穩(wěn)定后，加入一定量的底物溶液。隨著底物溶液的注入，電極產(chǎn)生響應(yīng)電流。圖1顯示在10mL緩沖溶液(pH 5.5)中連續(xù)加入50μL 0.1mol/L的葡萄糖溶液時，傳感器對葡萄糖的電流響應(yīng)曲線，所加電壓為0.6V?？梢钥吹诫娏鲝囊粋€穩(wěn)態(tài)到達另一個穩(wěn)態(tài)的平衡時間小于2s，也就是說傳感器對葡萄糖的響應(yīng)時間小于2s，可以實現(xiàn)對反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖濃度的原位測定。圖1中插圖是葡萄糖濃度c(mmol/L)與電流I(μA)的關(guān)系曲線，其線性擬合方程為I=0.055+0.60c(n=5,R=0.9998)。由此可見傳感器響應(yīng)電流的大小與葡萄糖濃度有很好的線性關(guān)系。

2.3 蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率常數(shù)測定

用pH 5.5 的緩沖溶液配制質(zhì)量分數(shù)為33.3%的蔗糖溶液和0.1%的蔗糖酶溶液。在測試裝置中加入8.0mL蔗糖溶液，在0.6V電壓下測定電流-時間曲線，待背景電流穩(wěn)定后，加入2.0mL蔗糖酶溶液，開始蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)。隨著反應(yīng)進行，反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖的濃度不斷增大，測得的電流也相應(yīng)增大，一直測到電流趨于飽和時實驗結(jié)束，飽和電流值即可認為是I∞。測量結(jié)果示于圖2。以-ln(I∞-I)對t作圖，所得曲線示于圖3。圖3中擬合線的斜率即蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率常數(shù)k。數(shù)據(jù)擬合的線性方程為：y=9.9114+0.0162x(n=151,R=0.97)，由此得到本實驗條件下蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率常數(shù)為k=0.0162s-1。

圖2 蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中傳感器的電流響應(yīng)曲線

圖3 利用葡萄糖響應(yīng)電流值計算得到的-ln(I∞-I)-t關(guān)系曲線

3 結(jié)語

本文根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)的特點，引入當前科學研究的熱點課題，把經(jīng)典動力學實驗改造成為一個綜合性探索實驗。在實際教學中，可根據(jù)課時的多少靈活安排。如傳感器的制備和測試部分，可以要求學生自己查閱專業(yè)文獻,寫出詳細的實驗步驟，也可以由實驗講義直接提供實驗步驟。綜合性、探索性實驗的設(shè)置，能夠調(diào)動學生學習的主動性和創(chuàng)造性，有助于學生創(chuàng)新思維能力和綜合素質(zhì)的培養(yǎng)，是教學改革實踐中的重要環(huán)節(jié)，也是提高教學質(zhì)量的重要措施[2,8]。本文為綜合性實驗的一個實例，希望能夠起到拋磚引玉的作用，以便在實驗教學改革中設(shè)計出更多的綜合性實驗，提高本科生培養(yǎng)水平。

[1] 莊繼華.物理化學實驗.第3版.北京:高等教育出版社,2006

[2] 孟慶繁,逯家輝,王貞佐,等.實驗室研究與探索,2004,23:85

[3] 董紹俊,車廣禮,謝遠武.化學修飾電極.修訂版.北京:科學出版社,2003

[4] 麥智彬,譚學才,鄒小勇.分析測試學報,2006,25:120

[5] Yang H P,Zhu Y F,Chen D C,etal.BiosensorandBioelectronics,2010,26(1):295

[6] Wang J,Musameh M,Lin Y.JAmChemSoc,2003,125:2408

[7] 楊海朋,陳仕國,戈早川,等.化學進展,2009,21:210

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