白藜蘆醇對(duì)小鼠移植宮頸癌的抑制作用及機(jī)制研究

胡可可 譚琛 張琴 陳曉瓊 鄧赫男 肖斌梅

郴州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 郴州 423000

宮頸癌是危害婦女生命及降低婦女生活質(zhì)量的主要疾病之一，發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國(guó)家，農(nóng)村高于城市。在我國(guó)，宮頸癌發(fā)病率占婦女惡性腫瘤之首，約占女性生殖器惡性腫瘤的72.4 %～93.1%。影響中國(guó)已婚婦女宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素是：人類乳頭瘤病毒感染、人工流產(chǎn)次數(shù)、性伴侶、被動(dòng)吸煙及丈夫包皮過(guò)長(zhǎng)等［1］。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的非黃酮多酚類化合物，化學(xué)名稱為反式-3,4,5-三羥基-1,2-二苯乙烯，分子式C12H14O3，具有抗氧化、抗炎、 雌激素樣活性、生長(zhǎng)抑制、免疫調(diào)節(jié)、化學(xué)預(yù)防以及抗腫瘤等多種生物活性［2］。新近研究發(fā)現(xiàn)，Res在細(xì)胞水平可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響信號(hào)傳導(dǎo)通路等多途徑抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［3］，但體內(nèi)水平研究尚未見(jiàn)報(bào)道。615近交系小鼠宮頸癌U14在移植同系小鼠后具有淋巴和血道雙向轉(zhuǎn)移的特性，其生物學(xué)行為與臨床宮頸癌患者相似［4］。因此，本實(shí)驗(yàn)利用該小鼠宮頸癌動(dòng)物模型，研究Res對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，并初步探討其抗癌機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品與主要試劑

Res購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，順鉑注射液購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。TRIzol試劑、SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，PCR Marker購(gòu)于上海鼎國(guó)生物公司，引物由上海生工生物工程公司合成。BCA 蛋白定量測(cè)定試劑購(gòu)自Hyclone-Pierce公司。TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒以及SABC免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)兔抗鼠一抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。CD34兔抗鼠一抗、DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物工程公司。

1.2 動(dòng)物及腫瘤細(xì)胞株

615 近交系小鼠40只，6周齡，雌性，體重(20.0±2.0) g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并在SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。小鼠宮頸癌U14瘤細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供，經(jīng)常規(guī)復(fù)蘇后，接種于615近交系小鼠腹腔傳代。當(dāng)小鼠腹水呈乳白色時(shí)，采集腹水并用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成5×107/mL瘤細(xì)胞懸液備用。

1.3 模型制備與分組給藥

40只615 近交系小鼠均于右側(cè)背部皮下注射瘤細(xì)胞1×107個(gè)/只(0.2 mL)，每天觀察小鼠及局部成瘤情況，腫瘤直徑≥2.0 mm時(shí)為成瘤。皮下接種腫瘤后第6天，40只小鼠皮下移植處均成瘤，將小鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、Res低劑量組、Res高劑量組、順鉑組，每組10只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將Res低、高劑量組中每天每只小鼠Res的量定為2.5、10 mg/kg，并溶解于0.1 mL 0.9%的氯化鈉溶液中，每天灌胃1次；對(duì)照組每天用同體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃；順鉑組小鼠給予3 mg/kg順鉑注射液腹腔注射，連續(xù)給藥20 d。給藥期間觀察各組小鼠的精神、反應(yīng)、活動(dòng)、飲食及大小便等一般情況。第26天處死全部小鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)，并將腫瘤組織分為3部分，分別用于RT-PCR檢測(cè)、Western blot檢測(cè)和4%甲醛溶液固定后，石蠟包埋，切片，供免疫組織化學(xué)、病理學(xué)及凋亡檢查。

1.4 抑瘤率測(cè)定

接種前和接種后每?jī)商旆Q1次體重，按體重變化調(diào)整給藥。接種后每?jī)商鞙y(cè)量1次小鼠皮下腫瘤最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V= a×b2/2)。第26天頸椎脫臼處死小鼠，完整剝離腫瘤稱重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(1-治療組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量)×100%。

1.5 RT-PCR檢測(cè)MIF基因表達(dá)

采用TRIzol試劑抽提腫瘤組織總RNA，獲得的RNA按SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合cDNA，按PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。MIF引物序列為［5］：5’-GCAAGCCCGCACAGTACA-3’和5’-CGTTCGTGCCGCTAAAAGTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度468 bp；內(nèi)參照基因β-actin引物序列為：5’-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3’和5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度198 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃ 60 s、56 ℃ 30 s、72 ℃60 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸 7 min。在1.5%含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，以PCR Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照進(jìn)行產(chǎn)物鑒定。用Total lab分析軟件進(jìn)行條帶掃描分析，測(cè)量電泳條帶密度，計(jì)算MIF mRNA相對(duì)量。MIF mRNA相對(duì)量＝MIF產(chǎn)物電泳條帶密度/β-actin產(chǎn)物電泳條帶密度。

1.6 Western blot檢測(cè)MIF蛋白表達(dá)

將腫瘤組織放入液氮碾磨，三去污裂解液裂解。BCA 法測(cè)定蛋白濃度，50 μg蛋白與加樣緩沖液混合，在10%不連續(xù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠中電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，溫育一抗、二抗，以β-actin為內(nèi)參照，用ECL發(fā)光法顯色，曝光、顯影、定影。膠片條帶用薄層掃描儀進(jìn)行掃描后，運(yùn)用Imager2200軟件分析各產(chǎn)物積分光密度值，計(jì)算MIF 蛋白相對(duì)量。MIF蛋白相對(duì)量=MIF積分光密度值/β-actin積分光密度值。

1.7 HE及免疫組織化學(xué)染色

取腫瘤組織，10%中性甲醛固定、石蠟包理，5 μm連續(xù)切片，HE染色，光鏡觀察。采用免疫組化SABC法檢測(cè)腫瘤組織微血管密度(microvessel density，MVD)的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。MVD的判定標(biāo)準(zhǔn)，凡與鄰近的腫瘤細(xì)胞、微血管或結(jié)締組織分開(kāi)的，呈棕黃色CD34陽(yáng)性染色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞串計(jì)為一個(gè)血管，但肌層較厚，或管腔面積大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不計(jì)數(shù)。MVD計(jì)數(shù)參考Weidner［6］的方法，先在低倍鏡下掃視整個(gè)組織切片，在腫瘤浸潤(rùn)區(qū)選擇內(nèi)皮細(xì)胞染色清晰，背景良好，微血管最密集的4個(gè)視野，然后在高倍鏡視野范圍內(nèi)計(jì)數(shù)所有染色的微血管，取4個(gè)視野的計(jì)數(shù)結(jié)果均數(shù)為該切片的微血管數(shù)。

1.8 腫瘤細(xì)胞凋亡

用TUNEL原位凋亡法檢測(cè)，方法步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照。細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。凋亡細(xì)胞半定量分析：在400高倍視野下，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，分別計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞核數(shù)及凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)，取均值，計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)：AI(%)＝凋亡陽(yáng)性的細(xì)胞核數(shù)/總計(jì)數(shù)的細(xì)胞核×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 移植瘤組織病理學(xué)觀察

對(duì)照組癌細(xì)胞浸潤(rùn)周圍組織呈巢狀分布，細(xì)胞形狀不規(guī)則，大小不一，核大深染，核漿比例增大，核異形性明顯，可見(jiàn)病理性核分裂相。各組內(nèi)均可見(jiàn)組織壞死區(qū)，對(duì)照組相對(duì)較少。Res低、高劑量組癌細(xì)胞皺縮，核固縮或碎裂，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，順鉑組見(jiàn)片狀壞死的癌細(xì)胞。

2.2 Res對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

用藥期間，順鉑組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡不振，活動(dòng)減少，食欲下降，毛發(fā)干澀脫落，消瘦等表現(xiàn)。其余各組一般狀況良好，未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。接種瘤細(xì)胞后各組腫瘤體積均逐漸增大。治療初期，各組腫瘤生長(zhǎng)速度相似。治療5 d后，治療組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組。在治療終點(diǎn)，與對(duì)照組相比，Res高劑量組和順鉑組腫瘤體積縮小，腫瘤質(zhì)量明顯下降(P<0.01)，而Res低劑量組與對(duì)照組比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Res高劑量組和順鉑組抑瘤率顯著高于Res低劑量組(P<0.01)。Res高劑量組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、抑瘤率與順鉑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)

2.3 Res對(duì)腫瘤組織MIF表達(dá)的影響

條帶密度掃描及半定量分析顯示，Res高劑量組和順鉑組MIF mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，但低劑量Res對(duì)其表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)。順鉑組MIF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于Res各劑量組(P<0.05或0.01，圖1、2)。

表1 Res對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effect of Res on transplanted tumor growth

圖1 各組腫瘤組織MIF mRNA表達(dá)Fig.1 Expression of MIF mRNA in tumor tissues among groups

圖2 各組腫瘤組織MIF 蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of MIF protein in tumor tissues among groups

2.4 Res對(duì)腫瘤血管生長(zhǎng)的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示，腫瘤組織切片中，微血管密集區(qū)多位于腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的前緣部位，內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色(圖3)。Res高劑量組和順鉑組與對(duì)照組比較，MVD明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但Res低劑量組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Res低劑量組MVD顯著高于順鉑組(P<0.01)，然而Res高劑量組和順鉑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

2.5 Res對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色顯示，凋亡細(xì)胞明顯固縮，核致密，深染為棕黃色多葉狀或新月?tīng)铑w粒，常聚集在核周邊；未凋亡的細(xì)胞核呈藍(lán)綠色(圖4)。Res高劑量組和順鉑組AI顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但Res低劑量組AI與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Res低劑量組AI顯著低于順鉑組(P<0.01)，但Res高劑量組和順鉑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

圖3 各組腫瘤組織CD34表達(dá)情況Fig.3 Expression of CD34 in the tumor tissues among groups

圖4 各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of tumor cells among groups(TUNEL, ×400)

表2 各組MVD和凋亡指數(shù)比較Tab.2 Comparison of MVD and AI among groups

3 討 論

宮頸癌是較常見(jiàn)的婦科腫瘤，治療以手術(shù)為主術(shù)后多聯(lián)合化、放療。目前由于化療藥物多有較大不良反應(yīng)，限制了臨床應(yīng)用，影響了其療效，因而尋找抗瘤效果好而毒性低的藥物是一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。近年來(lái)，Res抗腫瘤的效能日益受到關(guān)注，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中均顯示抗腫瘤功效［7］。本研究表明，Res對(duì)宮頸癌移植瘤具有顯著的抑制作用，與Res抑制其它腫瘤生長(zhǎng)的報(bào)道一致。其機(jī)制可能與Res通過(guò)清除小蛋白 RNA 還原酶的酪氨?；鶃?lái)抑制 RNA 還原酶的活性有關(guān)。Res還能抑制DNA 聚合酶，對(duì)該酶的抑制可以從根本上降低DNA 的合成能力，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用［8］。此外，本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，Res各劑量組小鼠的一般情況較好，體質(zhì)量增加，而順鉑組小鼠的一般情況較差，體質(zhì)量減輕明顯，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)治療劑量的Res對(duì)小鼠的重要臟器無(wú)不良反應(yīng)，10 mg/kg Res的抑瘤作用與3 mg/kg順鉑相當(dāng)，但不良反應(yīng)更小。

MIF作為經(jīng)典炎癥細(xì)胞因子，不僅參與機(jī)體炎癥及免疫反應(yīng)，也成為獨(dú)特的促腫瘤發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞因子之一。近年來(lái)多項(xiàng)研究結(jié)果證明MIF直接影響正常細(xì)胞的分裂和癌基因誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化，或間接通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)、影響細(xì)胞抑癌基因p53的功能、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)血管生成等多個(gè)方面影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是患者預(yù)后不良的指征［9］。本研究的前期研究發(fā)現(xiàn)，MIF在宮頸癌組織中高表達(dá)，而且其表達(dá)水平與宮頸癌的臨床分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、瘤體大小密切相關(guān)［10］。本研究結(jié)果表明，Res高劑量組MIF mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低，但低劑量Res對(duì)其表達(dá)無(wú)明顯影響，提示適當(dāng)濃度的Res在體內(nèi)能明顯地下調(diào)MIF的表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

新生血管形成對(duì)實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移必不可少，MVD是反映腫瘤血管生成活性或強(qiáng)度的重要定量指標(biāo)之一，對(duì)于血管抑制藥物的療效評(píng)價(jià)十分有用，其所選取的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物中以CD34抗原特異性最高，重復(fù)性最好。CD34能清晰地選擇性地顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞，其它組織不著色。這就為免疫組織化學(xué)定量研究腫瘤內(nèi)血管生成提供了依據(jù)。符慧群等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Res通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)抑制小鼠Lewis肺癌血管生成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組MVD值最高，表明宮頸癌在生長(zhǎng)過(guò)程中形成了豐富的新生血管，從而促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，應(yīng)用Res治療后，高劑量組MVD顯著降低，而低劑量組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Res在體內(nèi)能明顯抑制腫瘤內(nèi)血管形成，從而抑制宮頸癌的增殖。

細(xì)胞凋亡是基因控制下的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，凋亡受阻是包括腫瘤在內(nèi)的多種人體疾病的重要發(fā)病機(jī)制，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為當(dāng)今腫瘤治療的熱點(diǎn)。目前已有大量的實(shí)驗(yàn)證明，Res對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用［12］。Bhat等［13］發(fā)現(xiàn)Res抑制子宮內(nèi)膜癌生長(zhǎng)的途徑主要通過(guò)激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-3，接著分解DNA修復(fù)酶中的poly-A聚合酶，最終誘導(dǎo)其凋亡。周學(xué)武等［3］的研究也表明，Res對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞有明顯的凋亡陽(yáng)性反應(yīng)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)凋亡率增加。本研究提示，適當(dāng)濃度的Res能明顯促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明，Res對(duì)小鼠宮頸癌的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，并且不良反應(yīng)較低，其機(jī)制主要與下調(diào)MIF表達(dá)、抑制腫瘤內(nèi)微血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。深入研究Res的抗癌作用，將為宮頸癌的治療帶來(lái)新的希望。

［1］ 周權(quán), 黃民主, 黃霜, 等.中國(guó)已婚婦女宮頸癌發(fā)病影響因素Meta分析［J］.中國(guó)癌癥雜志, 2011, 21(2)：125-129.

［2］ 胡凌云, 王海鈉, 裴俊俊, 等.白藜蘆醇防癌抗癌作用及其分子機(jī)制研究進(jìn)展 ［J］.山東醫(yī)藥, 2010, 50(5)：111-112.

［3］ 周學(xué)武, 陳建榮, 劉桂艷, 等.白藜蘆醇對(duì)人宮頸癌 HeLa細(xì)胞凋亡、增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 29(20): 2457-2459.

［4］ 陶光實(shí), 楊盛波, 胡錦躍, 等.轉(zhuǎn)染HPV的宮頸癌U14移植同系小鼠后生長(zhǎng)特性和轉(zhuǎn)移規(guī)律的研究［J］.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 26(6): 515-519.

［5］ WONG B L, ZHU S L, HUANG X R, et al.Essential role for macrophage migration inhibitory factor in gastritis induced by Helicobacter pylori ［J］.Am J Pathol, 2009, 174(4): 1319-1328.

［6］ WEIDNER N.Tumor angiogenesis: Review of current application in tumor prognosis ［J］.Semin Diagn Pathol,1999, 10(4): 302-313.

［7］ BISHAYEE A.Cancer prevention and treatment with resveratrol: from rodent studies to clinical trials ［J］.Cancer Prev Res, 2009, 2(5): 409-418.

［8］ SUN N J, WOO S H, CASSADY J M, et al.DNA polymerase and topoisomerase II inhibitors from psoralea corylifolia ［J］.J Nat Prod, 1998, 61(3): 362-366.

［9］ CONROY H, MAWHINNEY L, DONNELLY S C.Inflammation and cancer: macrophage migration inhibitory factor (MIF)-the potential missing link ［J］.QJM, 2010,103(11)：831-836.

［10］ 胡可可, 陳曉瓊, 鄧赫男, 等.巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在宮頸癌中的表達(dá)及意義 ［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2010, 26(7)：970-971.

［11］ 符慧群, 曹培國(guó), 羅紅, 等.白藜蘆醇對(duì)小鼠 Lewis肺癌生長(zhǎng)的影響及機(jī)制研究［J］.腫瘤, 2007, 27(7)：531-534.

［12］ KO Y C, CHANG C L, CHIEN H F, et al.Resveratrol enhances the expression of death receptor Fas/CD95 and induces differentiation and apoptosis in anaplastic large-cell lymphoma cells ［J］.Cancer Lett, 2011, 309(1): 46-53.

［13］ BHAT K P, PEZZUTO J M.Cancer chemopreventive activity of resveratrol ［J］.Ann NY Acad Sci, 2002, 57(3): 210-214.