銀杏葉片對衰老大鼠海馬CREB表達影響的實驗研究

王懷穎， 郝巖君， 張 悅， 辛海濤

自然衰老過程中人和嚙齒類動物出現(xiàn)認知功能下降，老年大鼠表現(xiàn)許多與海馬相關的空間記憶障礙。海馬神經(jīng)元信號轉導分子水平變化可影響學習記憶。核轉錄因子 cAMP反應元件結合蛋白(CREB)連結多條信號轉導途徑，參與多種生理功能調節(jié)，是小鼠學習記憶形成的必須分子［1］，衰老及多種神經(jīng)退行性疾病中可觀察到CREB信號通路異常［2］。研究發(fā)現(xiàn)小鼠增齡過程中空間記憶功能改變與海馬CREB磷酸化水平有關［3］。銀杏葉片是從銀杏科植物銀杏樹葉中提取的天然植物藥，臨床常用于腦血管病治療，另外對衰老、癡呆、腦功能障礙也有一定改善作用，但確切機制尚不明確。本實驗以自然衰老大鼠為研究對象，通過補充外源銀杏葉片，觀察其對老年大鼠空間記憶及海馬CREB、pCREB表達影響，探討可能的藥理機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑

清潔級雄性Wistar大鼠由河北省實驗動物中心提供(合格證號804066)。試劑:CREB、p-CREB一抗、二抗，北京博奧森生物技術工程公司;β-actin一抗，Santa Cruz公司;化學發(fā)光試劑，河北博海生物工程公司。銀杏葉片，廣西金嗓子藥業(yè)股份有限公司。蛋白測定試劑盒，碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 雄性Wistar大鼠分為青年對照組(3月齡)、老年對照組(13月齡)和銀杏葉組(13月齡)。銀杏葉組大鼠每日灌胃銀杏葉片250mg/kg，其余兩組動物每日灌胃等量蒸餾水，共8w。

1.2.2 Morris水迷宮實驗 BI-2000水迷宮跟蹤分析系統(tǒng)，由不銹鋼圓形水池、一個可移動平臺和攝像系統(tǒng)組成，成都泰盟科技有限公司提供。

(1)定向航行試驗:測試大鼠學習能力。隨機選擇一個入水點，將大鼠背對平臺放入水中，攝像機記錄大鼠120s內(nèi)找到平臺時間，即逃避潛伏期。若大鼠找到平臺，平臺上停留15s。如果大鼠未在規(guī)定時間內(nèi)找到平臺，將其引導到平臺，并停留15s，逃避潛伏期記為120s。每天上、下午各訓練1次，共4d。

(2)空間搜索實驗:考察大鼠記憶能力。第4天下午定向航行試驗結束后，撤去平臺，任選一個入水點將大鼠面朝池壁放入水中，記錄120s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)及平臺象限停留時間。

1.2.3 海馬蛋白提取 行為學實驗結束后腹腔注射10%水合氯醛麻醉動物，斷頭取腦，冰臺上剝離海馬，-70℃低溫冰箱保存。取出低溫冰箱保存的海馬，加入適量組織裂解液于冰上研磨，4℃裂解30min，12000r/min離心 15min，取上清測定。BCA法測定組織勻漿液蛋白濃度。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品蛋白(每孔上樣量30μg)，將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入 CREB、p-CREB、β-actin 一抗，4℃過夜，加入二抗室溫孵育2h，加入ECL試劑反應，暗室發(fā)光，顯影定影。Quantity one圖像分析軟件分析數(shù)據(jù)，以目的條帶與β-actin吸光度比值進行半定量分析。

2 結果

2.1 定位航行試驗

見圖1。與青年對照組比較，老年對照組大鼠逃避潛伏期延長，具有顯著性差異(P＜0.05)。銀杏葉組大鼠逃避潛伏期比老年對照組縮短，差異顯著(P＜0.05)。第1天與其余3d比較，逃避潛伏期最長(P＜0.05)。與第2天比較，第3天、第4天逃避潛伏期變短，有顯著差異(P＜0.05)。第3天與第4天比較無顯著性差異。

圖1 不同組別大鼠逃避潛伏期

2.2 空間搜索試驗

見表1。與青年對照組比較，老年對照組大鼠經(jīng)過平臺次數(shù)減少(P＜0.05)，平臺象限停留時間縮短(P＜0.05)。銀杏葉組大鼠經(jīng)過平臺次數(shù)多于老年對照組大鼠，平臺象限停留時間比老年對照組大鼠延長，有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 大鼠空間搜索實驗結果(±s)

表1 大鼠空間搜索實驗結果(±s)

與年輕對照組比較*P＜0.05;△與老齡對照組比較P＜0.05

組別 動物只數(shù) 穿越平臺次數(shù) 平臺象限停留時間(s)年輕對照組老齡對照組銀杏葉組10 10 10 9.6 ±2.875 6.8 ±2.486*9.4 ±2.633△41.554 ±6.296 34.919 ±4.557*40.996 ±6.683△

2.3 不同組別大鼠海馬CREB、p-CREB表達

見圖2。與青年對照組大鼠比較，老年對照組大鼠海馬CREB表達明顯下降(P＜0.05);銀杏葉組大鼠海馬CREB表達水平升高，與老年對照組相比差異顯著(P＜0.05)。老年對照組大鼠海馬p-CREB表達水平明顯低于青年對照組(P＜0.05);與老年對照組比較，銀杏葉片組大鼠海馬p-CREB表達水平升高，有顯著性差異(P＜0.05)。

圖2 銀杏葉片對衰老大鼠海馬CREB、pCREB表達的影響

3 討論

空間學習記憶功能是大鼠腦功能重要組成部分，老齡大鼠可表現(xiàn)與海馬相關的空間記憶障礙。王蓉等以SD大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)6月齡大鼠空間學習記憶能力最強，之后緩慢下降［4］。本實驗利用Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶功能，發(fā)現(xiàn)老年Wistar大鼠逃避潛伏期延長，平臺象限停留時間縮短，穿越平臺次數(shù)減少，與年輕對照組相比差異顯著，說明老齡大鼠空間記憶功能降低。

CREB是一種組成型核轉錄因子，在各種激酶作用下，第133位Ser殘基磷酸化而活化，與DNA序列cAMP反應元件CRE結合，促進下游基因轉錄。多種基因啟動區(qū)包括CRE，如bcl-2、bdnf等，所以CREB信號轉導途徑下游表達產(chǎn)物參與調節(jié)細胞增殖與凋亡。當CREB作用被抑制后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，LTP受損，基因表達改變［5］。p-CREB被認為是大鼠海馬空間記憶加工的分子標志物，大鼠空間學習過程中，cAMP-PKA-CERB信號傳遞途徑被激活，海馬p-CREB水平升高，促進空間記憶形成。增齡過程中，p-CREB水平降低導致小鼠空間記憶受損［3］。實驗結果顯示老年對照組大鼠海馬CREB、p-CREB水平均低于年輕對照組大鼠，可能影響空間記憶功能。

增齡過程中細胞氧化防御系統(tǒng)功能下降，造成氧化應激，導致衰老和多種神經(jīng)退行性疾病發(fā)生［6］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制轉基因小鼠CREB信號傳遞途徑，造成死亡神經(jīng)元增多，氧化應激產(chǎn)物增多，說明CREB信號傳遞途徑可對抗氧化應激［7］。Ozqen等發(fā)現(xiàn)長期低水平H202刺激，造成心肌細胞CREB表達水平下降，影響該信號途徑［8］。

銀杏葉提取物主要成分是黃酮總甙和銀杏萜內(nèi)酯，能清除自由基，抑制細胞老化，對心、腦血管系統(tǒng)具有保護作用。小鼠補充EGb761后，可改善MPTP引起的神經(jīng)退行癥狀［9］。實驗中，服用銀杏葉提取物后，老齡大鼠穿越平臺次數(shù)和平臺象限停留時間均延長，空間記憶改善。而且銀杏葉組大鼠海馬CREB表達和活性升高，說明銀杏葉片可能通過上調大鼠海馬CREB表達及活性，促進長時程增強改善老齡大鼠空間記憶功能。

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