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    豬偽狂犬病病毒的分離鑒定

    2011-09-19 09:05:08楊慶芳寧官保李俊達(dá)
    山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011年8期
    關(guān)鍵詞:病料狂犬病引物

    楊慶芳,寧官保,李俊達(dá)

    (1.晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山西晉中030600;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué),山西太谷030801;3.武鄉(xiāng)縣畜牧獸醫(yī)中心,山西武鄉(xiāng)046300)

    2008年2月以來,山西多個規(guī)?;i場出現(xiàn)妊娠母豬流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎和產(chǎn)弱仔,初生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,給生產(chǎn)造成巨大損失。為查明引起該疫病發(fā)生的根本原因,我們采集了病死豬的腦、肺、肝、脾、腎等組織病料,對其進(jìn)行了研磨與過濾處理,并對其病原菌進(jìn)行了分離。最終從病死仔豬的腦、肺、肝組織病料中分離出1株疑似偽狂犬病病毒(PRV)的毒株,并對其進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 細(xì)胞 倉鼠腎傳代細(xì)胞(BHK-21),購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

    1.1.2 血清 豬偽狂犬病中和試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;陰性豬血清,采自規(guī)模豬場非免疫健康豬,經(jīng)gE鑒別ELISA診斷試劑盒檢測均為陰性。

    1.1.3 病料 無菌采集病死仔豬、流產(chǎn)胎兒的腦、肺、肝、脾、腎等組織置-70℃保存,供分離病毒用。用前將上述組織混合在一起于滅菌過的研缽內(nèi)剪碎,用組織研磨器研磨,加入含青霉素、鏈霉素(終濃度各1 000單位/mL)的Hank’s液制成1∶5乳劑,置15 mL的離心管中反復(fù)凍融3次,3 000 r/min離心30 min,取病料上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,-70℃保存作為接種材料。

    1.1.4 試劑 (1)DMEM培養(yǎng)基,Gibco12100-046,購自華美生物工程公司;(2)新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;(3)青霉素160萬單位,鏈霉素100萬單位,山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品;(4)Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL),4 dNTP 混合液(各 2.5 mmol/L),DL2 000 DNA Marker,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;(5)胰酶,蛋白酶 K,EDTA,Tris液,SDS,瓊脂糖,生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    1.2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮中取出裝有BHK-21細(xì)胞的凍存管,迅速放入37~40℃溫水中,同時不斷晃動,使凍存細(xì)胞盡快融化,在超凈工作臺中無菌打開凍存管,用吸管把凍存液緩慢加入放有10 mL無血清的DMEM離心管中,800 r/min離心10 min,吸去上清,用含10%血清DMEM懸浮細(xì)胞,加入細(xì)胞瓶中再加7 mL生長液,復(fù)蘇。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并檢測細(xì)胞活力。置于37℃,5%CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng),待生長正常后進(jìn)行試驗(yàn)(一般在48 h左右長成單層)[1]。

    1.2.1.2 細(xì)胞凍存 選取生長良好的細(xì)胞瓶,棄去培養(yǎng)液,加入1 mL左右的消化液(25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶),靜置,待細(xì)胞之間出現(xiàn)小裂隙時,棄去消化液,加入3 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基,用吸管吹打使細(xì)胞散開,吸15 mL到離心管中,800 r/min離心10 min,棄上清,用3 mL凍存液輕輕吹開細(xì)胞,移入凍存管中,緩慢凍存于4℃0.5 h,-20℃2 h,-80℃過夜,第2天放入液氮中凍存。

    1.2.2 病毒的增殖 當(dāng)BHK-21細(xì)胞鋪滿單層時,按10%的量接種處理好的病料,每份接種2瓶,并設(shè)2瓶正常為對照。37℃溫箱中吸附2 h,期間每隔30 min晃動接種的培養(yǎng)瓶,使接種液和細(xì)胞充分接觸。孵育2 h后,傾去接種液,加入8 mL含2%血清的維持液。置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),逐日觀察細(xì)胞病變(2~3次/d),待細(xì)胞病變達(dá)80%時,收獲病毒,-20℃保存?zhèn)溆?。若?次接種不出現(xiàn)細(xì)胞病變,則將細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后,4℃,1 000 r/min離心10 min,取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,盲傳3代,有細(xì)胞病變者繼續(xù)傳代,直至第4代,收取細(xì)胞瓶,反復(fù)凍融3次,經(jīng)3000r/min離心10min,收獲上清液作為種毒于-70℃保存。

    1.2.3 病毒的毒價測定 取種毒100 μL用維持液900 μL連續(xù)做10倍稀釋,從10-4稀釋到10-11,接種于長成單層的96孔培養(yǎng)板,每稀釋度8孔,每孔100 μL,同時設(shè)2組細(xì)胞對照,37℃,5%CO2培養(yǎng)。連續(xù)觀察5 d,記錄結(jié)果,按Karber法計算毒株的TCID50。

    1.2.4 病毒的鑒定

    1.2.4.1 病毒的中和試驗(yàn) 采用固定病毒稀釋血清法,將偽狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用50 μL無血清的DMEM作倍比稀釋,從20到29,分別與50 μL含200個TCID50的分離病毒液混勻,置37℃作用1.5 h,接種于長成單層的96孔培養(yǎng)板,每個稀釋度8孔,每孔100 μL,并設(shè)陽性血清和正常細(xì)胞作為對照。5%CO2,37℃培養(yǎng),連續(xù)觀察5 d,按Reed-Muench法計算血清中和效價[2]。

    1.2.4.2 病毒PCR鑒定

    (1)引物的設(shè)計與合成。運(yùn)用Primer premier 5.0軟件,參考Genbank上已發(fā)表的PRV序列,針對PRV的保守序列設(shè)計1對引物,擴(kuò)增片段為237 bp。上游引物:5′-CACGGAGGACGAGC TGGGGCT-3′,下游引物:5′-GTCCACGCCCC GCTTGAAGCT-3′。

    引物由南京金思特科技有限公司合成。使用前,用高壓滅菌超凈水溶解,濃度20 pmol/μL,置于-20℃保存?zhèn)溆肹3]。

    (2)病毒核酸的提取。取病毒液SX09及陰性對照各500 μL,加入10%SDS、蛋白酶K至終濃度分別為0.5%和50 μg/mL,水浴2 h。用等體積的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提1次,取上清。向上清液中加入1/10體積的3 mol/L NaAc(pH值為5.2)和等體積的異丙醇,室溫放置30 min,4 ℃ 13 000 r/min 離心 15 min,棄上清,用75%乙醇洗滌沉淀,待干燥后,用30 μL滅菌水溶解DNA沉淀,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    (3)PCR 鑒定。反應(yīng)體系:10×PCR buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL,上下游引物各 10 pmoL,DNA模版 2.0 μL,Taq DNA聚合酶0.3 μL,加 ddH2O至 25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性 30 s,55 ℃退火 45 s,72℃延伸45 s,35個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物鑒定:取7 μL PCR產(chǎn)物,加2 μL 6×Loding buffer混勻后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)胞病變觀察

    病料SX09接種BHK-21細(xì)胞,盲傳4代。36 h后,細(xì)胞開始收縮、變圓,聚攏(圖1-A)。細(xì)胞層形成空洞狀病變,至70 h可見成片脫落(圖1-B);對照細(xì)胞沒有變化,正常(CK)(圖 1-C)。

    2.2 分離病毒的TCID50

    對分離的PRV SX09毒株接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行毒價測定,進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

    表1 PRV病毒滴度的測定

    將試驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)代入Karber法計算公式lgTCID50=L+d(S-0.5)(其中,L 為最低稀釋度的對數(shù),為-4;d為稀釋系數(shù),10倍遞進(jìn)稀釋時,d為-1;S為死亡比值之和,即各組感染數(shù)/試驗(yàn)數(shù)的相加)。根據(jù)此公式計算該病毒的TCID50分別為 10-8.0/0.1 mL,10-8.125/0.1 mL,10-8.0/0.1 mL,得平均值為10-8.042/0.1 mL。

    2.3 中和試驗(yàn)

    PRVSX09與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。根據(jù)Reed-Muench法計算,病毒分離株的200個TCID50能被標(biāo)準(zhǔn)陽性血清10-1.93所中和,表明病毒分離株具有PRV的抗原性。

    表2 PRV SX09與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和試驗(yàn)

    2.4 PCR鑒定產(chǎn)物電泳結(jié)果

    用從SX09病毒液中提取的基因組DNA作為模板,進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,以DL2 000 DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn),擴(kuò)增出的特異性片段,與預(yù)期的大小一致,模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小近似237 bp(圖2)。

    3 討論

    據(jù)文獻(xiàn)報道[4],PRV可在多種動物細(xì)胞中生長繁殖,如在豬腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞、牛睪丸細(xì)胞等原代細(xì)胞以及PK-15,Vero,BHK-21等傳代細(xì)胞中都能很好地增殖。本試驗(yàn)充分驗(yàn)證了PRV可在BHK-21細(xì)胞上增殖,并出現(xiàn)典型的皰疹病毒的細(xì)胞病變,毒價(TCID50)為 10-8.042/0.1 mL;病毒能被PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和;用PCR方法鑒定分離的病毒液為PRV陽性;以上結(jié)果表明所分離的病毒株為偽狂犬病病毒。并命名為SX09株。

    查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),偽狂犬病病毒株間毒力存在差異[5]。在本試驗(yàn)中,以微量法測得分離病毒株在BHK-21細(xì)胞上的TCID50為10-8.042/0.1 mL,與國內(nèi)其他分離毒株相比,病毒毒力較強(qiáng)。另外,分離病毒株能被PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和,這與目前各國學(xué)者認(rèn)為的PRV僅有一個血清型相吻合[6]。

    在對SX09株進(jìn)行TCID50測定時發(fā)現(xiàn),病毒液在最大稀釋倍數(shù)時,沒有任何一孔發(fā)生細(xì)胞病變,而在最小稀釋倍數(shù)時,8孔細(xì)胞全部出現(xiàn)細(xì)胞病變,說明該試驗(yàn)是成立的且試驗(yàn)結(jié)果可信;中和試驗(yàn)的過程中,血清在最小稀釋倍數(shù)時,沒有任何一孔發(fā)生細(xì)胞病變,而在最大稀釋倍數(shù)時,8孔細(xì)胞全部出現(xiàn)細(xì)胞病變,說明該試驗(yàn)仍然是成立的且試驗(yàn)結(jié)果可信。

    本試驗(yàn)首次對山西省豬偽狂犬病病毒進(jìn)行了分離鑒定,填補(bǔ)了山西在此方面研究的空白,也為今后開展該病的診斷和防治研究奠定了基礎(chǔ)。

    [1]Maes R K,Sussman MD.Recent develop-ments in latency and recombination ofPRV[J].Vet Microbiol,1997,55:13-27.

    [2]李學(xué)伍,陳煥春.PCR法對偽狂犬病病豬不同部位的檢測及敏感性試驗(yàn)[J].中國畜禽傳染病,1998,20(6):365-368.

    [3]陳陸,查光明,王川慶,等.偽狂犬病病毒gE/gB PCR鑒別方法的建立及其應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(5):346-348.

    [4]方萬榮,陳煥春,何啟蓋,等.應(yīng)用微量中和試驗(yàn)進(jìn)行豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查[J].中國畜禽傳染病,1998,20(3):24-26.

    [5] Talmagc T B,Kwang O S,F(xiàn)rcdcrick J F.Dctcction of PR Viral DNAin tonsillar epithelial cells oflatecntiyinfected pigs[J].Am J Vet Res,1995,56(5):587-594.

    [6]Cheung A K.Investigation of PRV DNA and RNA in trigeminal ganglia tonsil tissues of latentlyinfected swine[J].AmJ Vet Res,1995,56(1):45-50.

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