對1株腸膜明串珠菌生長曲線和世代時間的初步探討

王 呈，梁茂文，趙瑞生，薛艷蓉，田 歌

（山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

腸膜明串珠菌具有優(yōu)良的發(fā)酵特性，它能夠發(fā)酵生成CO2和多種風味化合物[1]，可改善發(fā)酵乳制品的口味[2]，它的一些菌株可利用蔗糖生成葡聚糖，從而大大提高發(fā)酵乳制品的品質(zhì)[3]。因而，在發(fā)酵乳制品中，它是占有重要地位的發(fā)酵劑菌種之一，并得到廣泛應(yīng)用。

腸膜明串珠菌屬明串珠菌屬（Leuconostoc），有乳脂亞種、葡聚糖亞種和腸膜亞種3個亞種[4]。

本試驗選用可生成葡聚糖的腸膜明串珠菌腸膜亞種LA-07，并經(jīng)長期在脫脂牛乳中培養(yǎng)馴化后，將其在新鮮脫脂牛乳和MRS肉湯培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，通過平板計數(shù)法來獲取其不同培養(yǎng)時間的菌數(shù)，并繪制生長曲線和計算世代時間，為進一步開展腸膜明串珠菌在牛乳發(fā)酵制品中的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種

腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides）LA-07，由山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所畜產(chǎn)品研究室保藏。

1.2 培養(yǎng)基和稀釋液

1.2.1 脫脂牛乳培養(yǎng)基 采用山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所養(yǎng)牛中心提供的新鮮無抗牛乳，經(jīng)脫脂后，分裝于用硅膠塞密封的三角瓶中，在115℃下滅菌15 min。

1.2.2 MRS肉湯培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基 其均為北京陸橋技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品。

1.2.3 稀釋液 0.1%蛋白胨，0.85%氯化鈉，pH值為6.8～7.0，在115℃下滅菌15 min。

1.3 試驗設(shè)備

生物潔凈工作臺：型號BCM-1300A，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：型號PYX-DHS-400-BS-Ⅱ，上海賀德實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器：型號YM50，上海三申醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。電熱恒溫鼓風干燥箱：型號101-1-S-Ⅱ，上海躍進醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。電子天平：型號FA1104N，上海民橋精密科學儀器有限公司產(chǎn)品。多功能紅外爐：型號MC-H21S011，廣東美的生活電器制造有限公司產(chǎn)品。電動乳脂分離機：型號9ND50，青海農(nóng)牧機械制造有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種的活化 將LA-07接到MRS肉湯培養(yǎng)基中（接種量為2%），于（30±1）℃活化培養(yǎng)，活化3代后為計數(shù)培養(yǎng)菌種備用（使用時搖勻）。1.4.2 活菌計數(shù) 用移液槍吸取2 mL計數(shù)培養(yǎng)用菌種液，分別加到含100 mL脫脂牛乳培養(yǎng)基和MRS肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（30℃）；從培養(yǎng)0 h起，每隔2 h取菌液進行活菌計數(shù)，菌液取10-4～10-9稀釋度各100 μL用滅菌的三角涂布棒涂布于MC培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)48 h，計算活菌數(shù)（cfu/mL）?；罹嫈?shù)方法及數(shù)據(jù)處理參照GB4789.35—2010[5]。

1.4.3 生長曲線制作和世代時間計算 以各培養(yǎng)時期活菌數(shù)的常用對數(shù)值為縱坐標、培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制生長曲線；取對數(shù)生長期中的一段，計算世代時間：G＝t lg2/（Mt-M0）[6]。式中，G為世代時間，t為培養(yǎng)時間，M0為開始時的活菌數(shù)對數(shù)值，Mt為經(jīng)t時間培養(yǎng)后的活菌數(shù)對數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的繪制

按1.4.2進行活菌計數(shù)，并計算其常用對數(shù)值，結(jié)果如表1所示。再由表1中的數(shù)據(jù)繪制出腸膜明串珠菌的對數(shù)生長曲線（圖1）。

表1 各培養(yǎng)時期活菌數(shù)及其對數(shù)值隨時間的變化趨勢

由圖1可知，在新鮮脫脂牛乳和MRS肉湯培養(yǎng)基中，腸膜明串珠菌LA-07的生長均滿足對數(shù)生長曲線規(guī)律。由于生長基質(zhì)不同，LA-07在新鮮脫脂牛乳培養(yǎng)基中生長延遲期較長，繁殖較慢。

2.2 添加趨勢線和趨勢線方程

2.2.1 新鮮脫脂牛乳培養(yǎng)基中LA-07生長趨勢線和趨勢線方程 對表1中LA-07在脫脂乳培養(yǎng)基生長的原始數(shù)據(jù)添加趨勢線（圖2），可獲得趨勢線方程為：y＝5×10-9x6－5×10-7x5＋1×10-6x4＋0.000 3x3－0.007 6x2＋0.049 9x＋7.367 1（R2＝0.997 8） （1）

由圖2可知，LA-07在脫脂乳培養(yǎng)基生長的延遲期為18 h，18～32 h進入對數(shù)期，32～42 h進入穩(wěn)定期，42 h以后進入衰亡期。

2.2.2 MRS肉湯培養(yǎng)基中LA-07生長趨勢線和趨勢線方程 對表1中LA-07在MRS肉湯培養(yǎng)基生長的原始數(shù)據(jù)添加趨勢線（圖3），可獲趨勢線方程：y＝－2×10-5x4＋0.000 7x3－0.000 4x2－0.005 7x＋7.426 4（R2＝0.995 6） （2）

從圖3中可獲得LA-07在MRS肉湯培養(yǎng)基生長的延遲期為8 h，8～22 h進入對數(shù)期，22～28 h進入穩(wěn)定期，28 h以后進入衰亡期。

2.3 世代時間的計算

2.3.1 新鮮脫脂牛乳培養(yǎng)基中LA-07的世代時間的計算 在新鮮脫脂牛乳培養(yǎng)基中，LA-07生長對數(shù)期為 18～32 h，取 x1＝t1＝20 h，x2＝t2＝30 h，t＝t2－t1＝10 h ，將 t1，t2分別代入方程（1），得 y1＝M0＝8.045 1，y2＝Mt＝9.619 1，則世代時間 G乳＝1.912 h≈114.7 min。

2.3.2 MRS肉湯培養(yǎng)基中LA-07世代時間的計算 在MRS肉湯培養(yǎng)基中，LA-07生長對數(shù)期為 8～22 h，取 x1＝t1＝10 h，x2＝t2＝20 h，t＝t2－t1＝10 h，將 t1，t2分別代入方程（2），得 y1＝M0＝7.829 4，y2＝Mt＝9.712 4，則世代時間 GMRS＝1.598 h≈95.9 min。

3 結(jié)論與討論

本試驗針對同一個菌株，采用了同一菌種、相同的菌種活力、相同的接種量、相同的培養(yǎng)溫度，研究其在2種不同培養(yǎng)基條件下的生長曲線和世代時間。結(jié)果表明，腸膜明串珠菌LA-07在MRS肉湯培養(yǎng)基中，生長周期短，在28 h后就進入衰亡期，而在新鮮脫脂牛乳培養(yǎng)基中則要42 h；腸膜明串珠菌LA-07在MRS肉湯培養(yǎng)基中的延遲期和穩(wěn)定期分別為8，6 h，均要比其在新鮮脫脂牛乳培養(yǎng)基（18，10 h）中少，而腸膜明串珠菌LA-07在2種培養(yǎng)基中的對數(shù)期相同，都為14 h；腸膜明串珠菌LA-07在2個不同培養(yǎng)基中的世代時間分別為：G乳=114.7 min，GMRS=95.9 min。

通過在2種不同培養(yǎng)基中的生長周期、延遲期、世代時間對比，說明腸膜明串珠菌LA-07在MRS肉湯培養(yǎng)基中的生長優(yōu)于其在新鮮脫脂牛乳培養(yǎng)基。

通過在2種不同培養(yǎng)基中的穩(wěn)定期對比，說明在保持菌種活力方面，新鮮脫脂牛乳培養(yǎng)基要優(yōu)于MRS肉湯培養(yǎng)基。

處于對數(shù)期的微生物，由于其代謝旺盛，生長迅速，個體形態(tài)和生理特性較一致。因而，其是發(fā)酵制品生產(chǎn)和科學研究的良好材料。為了較準確地劃分微生物生長的各個時期，避免因個別試驗數(shù)據(jù)的偏差而造成整體試驗結(jié)論的偏移，本試驗采用了添加趨勢線的分析方法，不僅可較理想的劃分微生物生長的不同時期，同時還能較精確的計算其世代時間。

對于腸膜明串珠菌LA-07在2種培養(yǎng)基中的對數(shù)生長期相同，是否有其一定的必然性，還有待于進一步研究。

［1］Hemme D，F(xiàn)oueaud C.Leuconosotc characteristics，use in dairy technology and prospects in functional food[J].Int Daiyr J，2004，14：467-494.

［2］ Vrdamuhtu E R.The Daiyr Leuconosotc：Ues in dairy products[J].J DairySci，1994，77：2725-2737.

［3］Duboc Molle B.Applications of exopolys accharides in the dairy industry[J].Int DairyJ，2011，11：759-768.

［4］凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

［5］Harrigan WF.食品微生物實驗室手冊[M].李衛(wèi)華，方紅，廉慧鋒，等，譯.北京：中國輕工業(yè)出版社，2004.

［6］武漢大學，復(fù)旦大學生物系微生物學教研室.微生物學[M].3版.北京：高等教育出版社，1989.