DNS法對(duì)三七總多糖含量測(cè)定

熊藝花，李 婧，黃 松，袁 捷，賴小平

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510006；2.東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東 東莞523808）

中藥三七為五加科植物人參三七（Panax notoginseng（Burk.）F H.Chen）的干燥根，主產(chǎn)于云南、廣西等地，野生或栽培，其性溫，味甘、微苦，具有活血化瘀、消腫定痛的功效［1］，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，目前多用于冠心病、心絞痛等心血管系統(tǒng)疾病的防治。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)三七多糖的藥理研究，發(fā)現(xiàn)三七多糖具有增強(qiáng)免疫功能等活性作用［2－3］。目前多糖的含量測(cè)定方法有苯酚－硫酸比色法、蒽酮－硫酸比色法、DNS法等。崔秀明等［4］運(yùn)用苯酚－硫酸比色法測(cè)定了三七中總多糖成分的含量，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苯酚－硫酸法在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中結(jié)果不穩(wěn)定，另外，硫酸具有較強(qiáng)的腐蝕性，給實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)極大不便。DNS法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定。本文采用DNS法對(duì)三七中總多糖進(jìn)行含量測(cè)定，建立三七總多糖的含量測(cè)定方法，以期為系統(tǒng)評(píng)價(jià)三七藥材的質(zhì)量提供一定的資料。

1 材料

1.1 儀器

Aquapro艾科浦u系列純水機(jī)，CP225D十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)sartorius公司）；KQ5200DA型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器公司）；Thermo Helios r紫外分光光度儀。

1.2 藥材與試劑

D－無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：1108333－200503，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所）；三七飲片（批號(hào)：090921、091001、091125，購(gòu)于廣州致信飲片公司，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)賴小平研究員鑒定）；3，5－二硝基水楊酸，NaOH溶液，酒石酸鉀鈉，苯酚，亞硫酸鈉，HCl溶液等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 DNS試劑的配制［5］

稱取3，5－二硝基水楊酸3.15g，溶于131mL 2mol·L－1NaOH溶液中，再將其加入到250mL含91.0g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，攪拌使其溶解，然后加入2.5g苯酚和2.5g亞硫酸鈉，充分?jǐn)嚢?，溶解，冷卻后定容至500mL棕色容量瓶中儲(chǔ)存，室溫放置1周穩(wěn)定后使用。

2.2 三七供試品溶液的制備

2.2.1 三七總多糖樣品制備

精密稱取三七粉末5.0g，置250mL容量瓶中，加入蒸餾水200.0mL，超聲提取2h，冷卻至室溫，加蒸餾水至刻度，4 000r·min－1離心10min。精密移取上清液100.0mL，置250mL茄形瓶中，減壓回收至干，用蒸餾水少量多次將其溶解至10mL容量瓶中，加水定容至刻度。將濃縮液用40.0mL無(wú)水乙醇洗至100mL三角錐形瓶中，充分振搖混勻，置冰箱中冷藏放置過(guò)夜。將上述溶液轉(zhuǎn)至離心管中4 000r·min－1離心5min，殘?jiān)?0%乙醇洗滌4次，每次10mL。將上述殘?jiān)谜麴s水溶解至100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，即得總多糖樣品。每個(gè)樣品平行3份。

2.2.2 三七總多糖樣品水解

精密移取上述三七多糖樣品溶液20.0mL，置三角錐形瓶中，加入10mL 6mol／L HCl溶液（現(xiàn)配），封口，于沸水浴上加熱30min，取出冷卻至室溫，用6mol／L NaOH溶液調(diào)pH值至8.0，4 000rpm離心5min，殘?jiān)盟礈?，上清液與水洗滌液一并置50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻即得三七多糖水解液樣品。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

2.3.1 對(duì)照品溶液顯色掃描

精密移取葡萄糖對(duì)照品溶液0.8mL置具塞試管中，加水至2.0mL，加入1.5mL DNS試劑，搖勻，于沸水浴中加熱5min，取出后迅速冷卻，隨行以2.0mL蒸餾水作空白，用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)于200～800nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖溶液顯色UV掃描

2.3.2 三七供試品顯色掃描

精密移取三七多糖水解液樣品2.0mL置10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，精密移取上述溶液0.3mL置具塞試管中，加蒸餾水至2.0mL，加入1.5mL DNS試劑，搖勻，于沸水浴中加熱5min，取出后迅速冷卻，隨行以2.0mL蒸餾水作空白，用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)于200～800nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，其吸收曲線見(jiàn)圖2。

圖2 三七供試品顯色UV掃描

對(duì)比以上兩個(gè)樣品掃描圖可知，二者的最大吸收峰一致，均在510nm處左右，因此選擇510nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥恒重D－無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，加水溶解使成400.0mg／L，精密移取葡萄糖對(duì)照品溶液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL，置具塞試管中，分別加水至2.0mL，加入1.5mL DNS試劑，搖勻，于沸水浴中加熱5min，取出后迅速冷卻，以第一份樣品作空白，于510nm下測(cè)定其吸光度，每個(gè)樣品濃度平行3份，以每3.5mL溶液中所含的葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，以其平均吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y＝5.859X－0.355 9（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，D－無(wú)水葡萄糖溶液在0.117 6～0.313 6mg／3.5mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液0.5mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次。平均吸收度為0.744，RSD為0.21%，結(jié)果表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱取三七樣品5g，按“2.2”項(xiàng)下操作制備溶液，依法顯色，顯色后分別于0、5、10、15、20、25、30min測(cè)定其吸光度，平均吸收度為0.835，RSD為1.66%。結(jié)果表明樣品溶液在30min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取三七樣品6份，按“2.2”項(xiàng)下操作制備溶液，依法測(cè)定，平均含量為9.30%，RSD為1.9%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.4.5 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品5份，每份取約2.5g，精密稱定，每份樣品分別加入精密稱取的葡萄糖對(duì)照品0.1mg，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作，算得樣品的平均加樣回收率為98.87%，RSD為2.6%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果

2.5 三七供試品總多糖含量測(cè)定

精密移取不同等級(jí)的三七多糖水解液樣品1.0mL（根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整取樣量），置具塞試管中，加水至2.0mL，加入1.5mLDNS試劑，搖勻，于沸水浴中加熱5min，取出后迅速冷卻，隨行以2.0mL蒸餾水作空白，用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)于510nm測(cè)定吸光度。按公式1計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

多糖含量%＝m／（m樣品／250×V多糖／100×V水解液／50×1000）×0.9

其中，m樣品為樣品取樣量，V多糖為水解時(shí)多糖取樣體積，V水解液為顯色時(shí)所取水解液體積；多糖水解成單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水，故在計(jì)算單糖含量時(shí)需乘以0.9校正。

表2 三七樣品多糖含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

多糖并不具有還原性，跟DNS無(wú)法反應(yīng)，因此需要對(duì)總多糖溶液進(jìn)行水解后再用DNS法顯色測(cè)定其吸光度，此時(shí)測(cè)定的為三七中總糖含量；同時(shí)，水提醇沉法可以將三七中的還原糖沉淀出來(lái)，因此需先對(duì)三七多糖溶液用DNS顯色后測(cè)定其吸光度，此時(shí)測(cè)定的為三七中還原糖含量；總糖含量減去還原糖含量即為三七中多糖含量。在試驗(yàn)中對(duì)未水解的多糖進(jìn)行顯色測(cè)定后發(fā)現(xiàn)其吸光度極低，對(duì)結(jié)果影響不大，因此本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。多糖的含量測(cè)定方法有苯酚－硫酸法［5］、硫酸－蒽酮法［6］、3，5－二硝基水楊酸法等。本文采取了DNS法測(cè)定三七總多糖的含量，對(duì)不同批次三七中總多糖進(jìn)行含量測(cè)定，以期為系統(tǒng)評(píng)價(jià)三七藥材的質(zhì)量控制提供資料。

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