一種高效的巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法

張春蕾，華正宇，袁小林，楊 真，張 青，李小歡

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，遼寧大連 116011)

一種高效的巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法

張春蕾1，華正宇2，袁小林1，楊 真1，張 青1，李小歡1

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，遼寧大連 116011)

［目的］探索一種不需要分離前體細(xì)胞和加入外源性細(xì)胞因子的巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。［方法］收集腹腔接種肝癌腹水瘤細(xì)胞的小鼠腹水細(xì)胞，37℃、5%CO2條件下不換液、不傳代體外培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞幾乎全部死亡時(shí)，有少量細(xì)胞的胞漿內(nèi)顆粒消失、折光性變強(qiáng)。此時(shí)少量換液，這些細(xì)胞的體積迅速增大、分裂增殖活躍。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、免疫學(xué)標(biāo)志檢查及體外吞噬功能檢測(cè)，鑒定這些細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。［結(jié)果］本實(shí)驗(yàn)獲得了高純度、高活性的巨噬細(xì)胞，具備巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征和巨噬細(xì)胞特異的分化抗原-CD68。與不同誘導(dǎo)方法培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的吞噬能力比較，差異均有顯著性意義(P＜0.05)，表明死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞具有良好的吞噬能力。［結(jié)論］應(yīng)用不需要分離前體細(xì)胞和加入外源性細(xì)胞因子的巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，易于獲得足量的巨噬細(xì)胞，可廣泛應(yīng)用于臨床及實(shí)驗(yàn)研究。

死亡細(xì)胞;誘導(dǎo);巨噬細(xì)胞;分化

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分，在非特異性免疫防御及特異性免疫應(yīng)答中均起十分關(guān)鍵的作用。研究與應(yīng)用巨噬細(xì)胞的核心問(wèn)題是如何獲得高純度、高活性的巨噬細(xì)胞，然而由于該細(xì)胞的誘導(dǎo)、分化及激活機(jī)制尚不十分清楚，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)很困難，這對(duì)于巨噬細(xì)胞的研究與應(yīng)用限制很大。本實(shí)驗(yàn)室在以往研究中發(fā)現(xiàn)，死亡細(xì)胞可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞活化增殖并分化成具有較高吞噬活性的巨噬細(xì)胞。本研究進(jìn)一步完善巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，旨在為巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)、分化及激活機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明小鼠，5～8周齡，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

瘤細(xì)胞株:小鼠肝癌細(xì)胞株(H22)腹水型，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室提供。

主要試劑及儀器:小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)，MURINE GMCSF(PEPROTECH，INC.)，羊抗小鼠 CD68 單克隆抗體(Santa Cruz，美國(guó))，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗山羊IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)，XSZ-HY1熒光顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(日本制造)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞紅細(xì)胞懸液的制備

于無(wú)菌條件下，自雞翼下靜脈采血5 mL，立即加入到事先加有1 mL肝素鈉(1000 U)抗凝劑的Eppendorf管中混勻，4℃保存。使用前，以無(wú)菌生理鹽水離心(2000 rpm×5 min)洗滌3次，然后用生理鹽水配成體積分?jǐn)?shù)為5%的雞紅細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 不同誘導(dǎo)方法培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的分組

PBS誘導(dǎo)組(P組):向小鼠腹腔內(nèi)注入冰中預(yù)冷的無(wú)菌PBS 2 mL，以刺激產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞［1］。

GM-CSF誘導(dǎo)組(G組):分離小鼠血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞，用含5 ng/mL GM-CSF的RPMI 1640培養(yǎng)基(含 10%FBS)置 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)［2］。

死亡細(xì)胞誘導(dǎo)組(D組):復(fù)蘇肝癌腹水瘤細(xì)胞(H22)，小鼠腹腔接種H22，于小鼠腹腔接種H22的第7天左右，在無(wú)菌條件下用注射器收集腹水細(xì)胞，將收集的腹水細(xì)胞加入到Eppendorf管中，離心(1000 rpm×5 min)后棄上清，再用Hank's液洗2遍，然后加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS)置37℃、5%CO2條件下不換液、不傳代培養(yǎng)。

1.2.3 死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的分化細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察

倒置顯微鏡觀(guān)察:收集腹腔接種H22的小鼠腹水細(xì)胞，37℃、5%CO2條件下不換液、不傳代體外培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞幾乎全部死亡時(shí)，此時(shí)少量換液，于細(xì)胞培養(yǎng)的第1天開(kāi)始倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化。

電子顯微鏡檢查:收集培養(yǎng)細(xì)胞于Eppendorf管中，離心(3000 rpm×15 min)后，輕輕吸棄上清，使其呈細(xì)胞團(tuán)。向Eppendorf管中緩緩滴加戊二醛，使細(xì)胞由上而下逐漸固定，然后制備超薄切片，掃描、透射電子顯微鏡下觀(guān)察。

1.2.4 死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的分化細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)志檢查

收集培養(yǎng)細(xì)胞于 Eppendorf管中，離心(1000 rpm×5 min)后棄上清，PBS洗細(xì)胞，用毛滴管在載玻片上涂片。10%甲醛室溫固定10 min。PBS沖洗。封閉液(正常兔血清)37℃水浴中孵育20 min后傾去。一抗(羊抗小鼠CD68單克隆抗體，1∶100稀釋)水浴中孵育60 min。PBS沖洗，5 min/遍，共3遍。二抗(FITC標(biāo)記兔抗山羊IgG，1∶100稀釋)水浴中孵育45 min。PBS沖洗，5 min/遍，共3遍。封片劑(中性樹(shù)膠)封片。熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.2.5 不同誘導(dǎo)方法培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的體外吞噬功能比較

實(shí)驗(yàn)前兩周，向小鼠腹腔內(nèi)注入體積分?jǐn)?shù)為5%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL免疫小鼠。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天分離小鼠血清與雞紅細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下孵育30 min，再與3組細(xì)胞繼續(xù)孵育30 min。然后將細(xì)胞滴加于潔凈載玻片上，每片加0.5 mL，晾干，即成涂片，瑞氏染色后于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察。每張涂片取3個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，取其平均值。按以下公式計(jì)算吞噬百分率及吞噬指數(shù)。

吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%/巨噬細(xì)胞總數(shù)

吞噬指數(shù) =被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù) /巨噬細(xì)胞總數(shù)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的分化細(xì)胞的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀(guān)察

倒置顯微鏡觀(guān)察:死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的分化細(xì)胞體外培養(yǎng)的第1天，主要為小鼠肝癌腹水瘤細(xì)胞(H22)和小鼠腹腔其它細(xì)胞，細(xì)胞完整(圖1);第6天，大量細(xì)胞死亡破裂，有少量細(xì)胞的胞漿內(nèi)顆粒消失、折光性變強(qiáng)(圖2);第15天，細(xì)胞迅速增大，進(jìn)入分裂增殖狀態(tài)，體積比一般細(xì)胞大十幾倍(圖3);第30天，細(xì)胞分裂增殖活躍，獲得高純度、高活性的巨噬細(xì)胞(圖4)。

掃描電子顯微鏡檢查:細(xì)胞體積較大，形狀不規(guī)則，表面粗糙，有許多密集的微絨毛、微皺褶及囊泡，還有少數(shù)球形隆起，并且可見(jiàn)樹(shù)突狀偽足(圖5)。

透射電子顯微鏡檢查:胞漿內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及大量的溶酶體，在積極吞噬的巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)有巨大空泡樣結(jié)構(gòu)及大小不一、形態(tài)不規(guī)則的吞噬體(圖6)。

2.1.2 免疫學(xué)標(biāo)志檢查

CD68是巨噬細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，可用其抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。熒光顯微鏡觀(guān)察可見(jiàn)CD68抗體鑒定的死亡細(xì)胞誘導(dǎo)組(D組)巨噬細(xì)胞大，熒光強(qiáng)(圖7);PBS誘導(dǎo)組(P組)巨噬細(xì)胞小，熒光弱，為陽(yáng)性對(duì)照(圖8)。

2.2 不同誘導(dǎo)方法培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的體外吞噬功能比較

D組吞噬率及吞噬指數(shù)與P組和G組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)，死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞具有良好的吞噬能力(表1)。

表1 不同誘導(dǎo)方法培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞體外吞噬能力比較Tab 1 Comparation of phagocytic ability of different macrophages

3 討 論

巨噬細(xì)胞是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫的重要對(duì)象，滲透到多個(gè)學(xué)科。盡管?chē)?guó)內(nèi)外已有不少文獻(xiàn)報(bào)道能從多種組織和器官中分離、純化巨噬細(xì)胞［3］，但這些方法十分繁瑣、復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)于小鼠腹腔接種肝癌腹水瘤細(xì)胞的第7天，在無(wú)菌條件下收集腹水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，收集的小鼠腹水細(xì)胞成分極為復(fù)雜，除了占主要成分的肝癌腹水瘤細(xì)胞外，還可能包含其他細(xì)胞成分，如小鼠單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。在死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)細(xì)胞的初始濃度、換液起始時(shí)間以及首次換液量都是影響誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞出現(xiàn)的關(guān)鍵因素。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的反復(fù)摸索，最終將腹水細(xì)胞的初始濃度調(diào)為2×106/mL，2 mL/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2條件下不換液、不傳代體外培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的第6天，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分已被旺盛的細(xì)胞代謝所耗盡，全部肝癌腹水瘤細(xì)胞死亡破裂并釋放內(nèi)容物，然而此時(shí)倒置顯微鏡下可觀(guān)察到少量細(xì)胞的胞漿內(nèi)顆粒消失、折光性變強(qiáng)，表現(xiàn)出活化特征，這種現(xiàn)象很可能是由于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有高濃度的、死亡細(xì)胞釋放的、具有佐劑活性的物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞分化，因此首次換液量不宜過(guò)大，否則將會(huì)稀釋細(xì)胞培養(yǎng)上清液中那些發(fā)揮免疫佐劑作用的物質(zhì)的濃度。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、免疫學(xué)標(biāo)志檢查及體外吞噬功能檢測(cè)，鑒定死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的分化細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，此方法的優(yōu)點(diǎn)就是不需要分離前體細(xì)胞和加入外源性細(xì)胞因子，操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，易于獲得足量的巨噬細(xì)胞，可廣泛應(yīng)用于臨床及實(shí)驗(yàn)研究。

CD68是一種溶酶體相關(guān)膜蛋白，具有參與細(xì)胞攝取和溶酶體運(yùn)輸?shù)淖饔?。CD68主要在巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞膜上的表達(dá)較弱［4］，可作為巨噬細(xì)胞特異的分化抗原［5］。CD68抗體可以檢測(cè)人體許多組織中的巨噬細(xì)胞，包括肺泡、脾臟、腸固有層和骨髓中的巨噬細(xì)胞，同時(shí)也可以標(biāo)記骨髓前體細(xì)胞和外周血粒細(xì)胞，可用于骨髓白血病的鑒別和巨噬細(xì)胞方面的研究。巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的檢測(cè)與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸也有著密切聯(lián)系。劉聰?shù)龋?］采用鏈親和素-生物素免疫組織化學(xué)法進(jìn)行CD68的檢測(cè)，研究肝細(xì)胞性肝癌中枯否細(xì)胞的分布及意義。本實(shí)驗(yàn)采用CD68抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，熒光顯微鏡觀(guān)察可見(jiàn)CD68抗體鑒定的死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞呈綠染色、強(qiáng)陽(yáng)性。

高立芬等［7］報(bào)道刀豆蛋白 A(Concanavalin A，Con A)活化巨噬細(xì)胞后，可觀(guān)察到巨噬細(xì)胞體積增大，表面出現(xiàn)泡狀、樹(shù)突狀偽足，胞漿內(nèi)出現(xiàn)豐富的細(xì)胞器，線(xiàn)粒體、溶酶體增多。本項(xiàng)研究死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞體積較大，形狀不規(guī)則，表面粗糙，有許多密集的微絨毛、微皺褶及囊泡，還有少數(shù)球形隆起，并且可見(jiàn)樹(shù)突狀偽足，胞漿內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及大量的溶酶體，在積極吞噬的巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)有巨大空泡樣結(jié)構(gòu)及大小不一、形態(tài)不規(guī)則的吞噬體，細(xì)胞膜附近有較多的微絲和微管。結(jié)果表明死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞具備巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征和超微結(jié)構(gòu)特征。

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)特定的吞噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的吞噬功能可作為衡量機(jī)體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)。巨噬細(xì)胞能吞噬和殺滅細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、自身衰老和死亡的細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫防御、免疫自穩(wěn)及免疫監(jiān)視功能。靜止的巨噬細(xì)胞體積小，活性低，吞噬功能弱。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活后，細(xì)胞體積變大、表面突起增多，細(xì)胞內(nèi)有完整的細(xì)胞器，且溶酶體、線(xiàn)粒體增多，細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞體外吞噬功能主要采用改良的吞噬雞紅細(xì)胞方法［8］，即實(shí)驗(yàn)前兩周，向小鼠腹腔內(nèi)注入體積分?jǐn)?shù)為5%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL免疫小鼠，以刺激小鼠產(chǎn)生抗雞紅細(xì)胞抗體。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天分離小鼠血清(含小鼠抗雞紅細(xì)胞IgG抗體)與雞紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞共同孵育，此時(shí)IgG抗體作為調(diào)理素促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。然后涂片，瑞氏染色后于鏡下觀(guān)察，計(jì)算吞噬百分率及吞噬指數(shù)，與不同誘導(dǎo)方法培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的吞噬能力作以比較，差異均有顯著性意義(P＜0.05)，表明死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞具有良好的吞噬能力。

:

［1］郭權(quán)，畢智偉.大承氣湯對(duì)重癥胰腺炎SIRS大鼠腹腔巨噬細(xì)胞sCD14作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(1):36 -39.

［2］Ferlazzo G，Klein J，Paliard X，et al.Dendritic cells generated from CD34+progeniter cells with flt3 ligand，c-kit ligand，GM-CSF，IL-4 and TNF-α are functional antigenpresenting cells resembling mature monocyte-derived dendritic cells［J］.J Immunother，2000，23(1):48 - 58.

［3］李靜，王亞平.大鼠骨髓巨噬細(xì)胞的分離，純化，培養(yǎng)以及鑒定［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，28(4):436 -439.

［4］曾潤(rùn)銘，金大地，張忠民.人外周血CD68+單核細(xì)胞體外的分選及誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(5):585 -588.

［5］Jens M.B，Aina S.L，Steen B.P ，et al.Monocyte Chemoattractant Protein-1 Release Is Higher in Visceral than Subcutaneous Human Adipose Tissue(AT):Implication of Macrophages Resident in the AT［J］.J CLIN ENDOCR METAB，2005，90(4):2282 -2289.

［6］劉聰，劉麗，周思亮，等.肝細(xì)胞性肝癌中庫(kù)普弗細(xì)胞的分布及意義［J］.中華肝臟病雜志，2002，10(3):177-180.

［7］高麗芬，劉君炎，湯紅明，等.ConA對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2002，18(2):104 -106.

［8］Nobukazu A，Tanenori H，Aizo F，et al.Phosphoinositide 3 kinase independent contractile activities associated with Fcγ receptor mediated phagocytosis and macropinocytosis in macrophages［J］.J Cell Scl，2003，116:247 - 257.

A novel high-yield macrophage culture in vitro

ZHANG Chun - lei1，HUA Zheng - yu2，YUAN Xiao - lin1，YANG Zhen1，ZHANG Qing1，LI Xiao - huan1
(1.Department of Clinical Laboratory，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian116001，China;2.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To explore a method of macrophage induced cultivation in vitro without precursor cell and exogenous cytokine.［Methods］Mouse ascites cells were collected from peritoneal cavity and cultivated without replacing culture medium and passing era in vitro at the condition of 37℃ and 5%CO2.When the whole cultivated cells nearly died，a few cells showed that granules in plasma disappeared and refraction became strong.These cells were rapidly augmented and turned into proliferation immediately after replacing little culture medium.By morphological observation，immunological symbol examination and phagocytic function detection in vitro，these cells were identified as macrophages.［Results］Macrophages with high activity were purified according to morphologic characteristics and immunological symbol of specific differentiation antigen of macrophage- CD68.Macrophages induced by death cells had notable discrepancy compared to macrophages that were cultivated by other methods(P＜0.05).It showed that macrophages induced by death cells had well phagocytic ability.［Conclusion］This is the first time to use method of macrophage induced cultivation in vitro without precursor cell and exogenous cytokine.It is a simple，economic and practical method for obtaining sample macrophages applied in clinical and experimental research broadly.

Key words:death cell;induce;macrophage;differentiation

R392

A

1671-7295(2011)05-0512-05

2011-06-16;

2011-08-08

張春蕾(1982-)，女，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，碩士。E-mail:zhangchunlei.1982@163.com

袁小林，主任醫(yī)師，博士。E-mail:daiwoguo@sina.com