參附注射液對大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道的影響

吳曉丹，孟紅旭，張林，白晶，楊勇

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029;2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

參附注射液是在傳統(tǒng)益氣溫陽固脫名方參附湯基礎(chǔ)上經(jīng)過劑型和工藝改造研制而成，主要成分為人參皂苷和烏頭堿類生物堿。參附注射液對多種心律失常都有較好的臨床療效，但治療心律失常的機制還不清楚，研究表明，心律失常和心肌細(xì)胞的離子通道關(guān)系密切。因此，我們觀察了參附注射液對大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道的影響，以初步探討參附注射液的離子通道調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 心室肌細(xì)胞的分離

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(180±10)g，由北京維通利華實驗動物養(yǎng)殖場提供。10%烏拉坦腹腔麻醉，迅速開胸取出心臟，在零度無鈣臺式液中剝離出主動脈，懸掛于Langendorff心臟灌流裝置上，確保管口不超過主動脈的心臟入口，棉線固定，行主動脈逆行灌流，流量為7～8ml/min。先用無鈣臺氏液灌流5min，接著用含0.4mg/ml膠原酶Ⅱ(worthington)、0.03mg/ml蛋白酶ⅩⅣ(sigma)、0.9mg/ml牛血清白蛋白(sigma)低鈣臺氏液(CaCl20.05mmol/L)灌流 19～24min，最后用含氯化鈣低鈣臺式液(CaCl20.4mmol/L)灌流5min，剪取心室組織在KB液中剪碎，吹打，用100目篩網(wǎng)過濾，最后將細(xì)胞保存在KB液中，4℃低溫可保存36h。整個過程灌流液維持溫度在(37±1)℃，灌流液中充純氧氣。

1.2 膜片鉗技術(shù)

通過電極拉制儀(PULL－100，美國)拉制電極，使玻璃電極充電極內(nèi)液后阻抗達(dá)到2～4MΩ。吸幾滴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池中，細(xì)胞貼壁后選擇桿狀、表面光滑、紋理清晰的心肌細(xì)胞，利用三維操縱器移動電極貼近目標(biāo)細(xì)胞，并輕壓在細(xì)胞表面，稍加負(fù)壓即可形成1GΩ水平以上的高阻抗封接，再用較大負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄形式。實驗過程由刺激采集軟件Pulse控制，經(jīng)膜片鉗放大器 (EPC10，德國)，通過模數(shù)轉(zhuǎn)換采集數(shù)據(jù)，存放于計算機硬盤。

1.3 藥物和配制液體

1.3.1 藥物

參附注射液(四川雅安制藥公司);配液所需藥品除指定外皆由英國Alfa Aesar公司購置。

1.3.2 配制液體(mmol/L)

無鈣臺式液:NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，MgCl21，Glucose 10，Hepes 10(pH7.4 NaOH);KB 液:KOH 70，KCl 40，KH2PO420，Glutamic acid 50，MgCl23，Taurine 20，EGTA 0.5，Hepes 10，Glucose 10(pH7.4 KOH);細(xì)胞外液:臺式液(無鈣臺式液+CaCl21.8);電極內(nèi)液:CsCl 140，MgCl22，CaCl21，EGTA 11，Na2ATP 5，Hepes 10(pH 7.2 CsOH)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 參附注射液對L型鈣通道電流濃度依賴性的抑制作用

原液采用臺式液進(jìn)行稀釋，給予不同稀釋濃度的參附注射液后L型鈣通道電流幅度隨濃度升高呈現(xiàn)不斷減小趨勢(見圖1A)，經(jīng)統(tǒng)計，參附注射液(1%;3%;10%)對電流峰值的抑制率分別為(13.6±1.4)(n=4);(28.4 ±7.5)(n=6);(41.10 ±19)(n=5)，顯示出明顯的量效關(guān)系。制作量效曲線，通過Boltzmann方程擬合(圖1B)，IC50大約為稀釋濃度至2.5%。

圖1 參附注射液對L型鈣通道電流濃度依賴性的抑制作用

2.2 參附注射液對L型鈣通道I－V曲線的影響

刺激脈沖從保持電壓－40mV開始，每隔10mV連續(xù)去極化至+70mV，持續(xù)時間200ms，頻率0.5Hz，可誘導(dǎo)出一系列 L型鈣通道電流，反轉(zhuǎn)電壓大約為60mV。給予參附注射液(0.3%，3%)后各鈣通道電流峰值都出現(xiàn)下降(圖2A)，取各個電流峰值及對應(yīng)的刺激電壓制作電流電壓曲線，給藥后，I－U曲線上移，但不改變I－U曲線的形狀和反轉(zhuǎn)電位(圖2B)。

2.3 參附注射液對L型鈣通道穩(wěn)態(tài)激活曲線和失活曲線的影響

穩(wěn)態(tài)激活曲線的全部數(shù)據(jù)皆來自I－V曲線，將記錄到的給藥前后的電流電壓值按Boltzmann方程進(jìn)行擬合:G/Gmax=1/［1+exp(V －V1/2/κ)］G=I/(V －Vrev)，式中G為電導(dǎo)率，V為刺激電壓，V1/2為半激活電壓，κ為曲線傾斜系數(shù)，I為電流峰值，Vrev為反轉(zhuǎn)電壓。給藥前后穩(wěn)態(tài)激活曲線無明顯變化(圖3A)，給藥前V1/2和κ分別為－(18.8±1.8)mV和(3.97±0.62);給于3%參附注射液后，V1/2和κ分別為－(18.3±3.3)mV和(4.32±1.55)，兩組參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。穩(wěn)態(tài)失活曲線應(yīng)用雙脈沖刺激參數(shù)獲得，保持電壓－40mV，條件脈沖從－70mV，每隔10mV連續(xù)去極化至20mV，持續(xù)時間1s，然后再給一去極化至0mV，持續(xù)時間200ms的測試脈沖。失活曲線用BoltzmannI/Imax=1/{1+exp［(VVh)/κ］}方程進(jìn)行擬合，V h為半失活電壓，κ為斜率因子。給藥前后穩(wěn)態(tài)激活曲線無明顯變化(圖3B)，給藥前V1/2和κ分別為－(28.3±3.37)mV和(4.02±0.77);給與3%參附注射液后，V1/2和κ分別為 －(28.3±2.53)mV和(4.73±0.71)，兩組參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。以上結(jié)果說明參附注射液對L型鈣通道穩(wěn)態(tài)激活和失活曲線無明顯影響。

圖2 參附注射液對L型鈣通道I－V曲線的影響

圖3 3%參附注射液對L型鈣通道穩(wěn)態(tài)激活曲線和失活曲線的影響

2.4 參附注射液對L型鈣通道失活后恢復(fù)的影響

失活后恢復(fù)曲線測定:采用雙脈沖刺激，保持電壓－40mV，條件脈沖去極化至0mV，持續(xù)時間200ms，再給一同樣刺激脈沖，兩脈沖的間隔時間逐漸增加，每次增家上一次間隔的1倍，共7次刺激，最長間隔至1 280ms。將記錄到的電流值按單指數(shù)方程進(jìn)行擬合I(%)=A+Bexp( －t/τ)，式中 I(%)為第2刺激脈沖引出的電流與第1刺激脈沖引出電流的比值，t為兩脈沖之間間隔的時間，τ為失活后再激活的時間常數(shù)。給藥(3%參附注射液)后失活后恢復(fù)曲線右移(圖4)，時間常數(shù)τ值由給藥前(82.1±32.7)ms增加至(139±27.3)ms，差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明參附注射液能夠延長L型鈣通道失活后恢復(fù)時間。

圖4 3%參附注射液對L型鈣通道失活后恢復(fù)的影響

3 討論

參附注射液的傳統(tǒng)劑型是參附湯，源自《濟(jì)生續(xù)方》，由人參、附子兩味藥物組成，主治元氣大虧，陽氣暴脫，手足厥冷，氣微欲絕。藥理研究顯示，參附注射液對心律具有雙向調(diào)節(jié)作用，既能治療快速心律失常，也能治療慢性心律失常［1］。對烏頭堿致大鼠心律失常模型，參附注射液可以有效緩解烏頭堿所致室性及室上性心律失常及房室傳導(dǎo)阻滯;對冠狀動脈結(jié)扎致犬心肌缺血致心律失常模型，參附注射液可以明顯改善模型動物心肌缺血的血流動力學(xué)指標(biāo)，并能有效控制烏頭堿所致室早和室速及心得安所致的心動過緩［2］。目前，關(guān)于參附注射液治療各種心律失常的機制還不十分清楚，由于心肌離子通道的功能異常與發(fā)生心率失常有直接影響，因此心律失常發(fā)生本質(zhì)是心肌離子通道的功能異常，而目前臨床使用的4類抗心律失常藥物主要機制是抑制了不同種類的離子通道功能。因此，觀察參附注射液對心肌離子通道的影響對揭示參附注射液治療各種心律失常的機制有重要意義。本研究結(jié)果顯示，參附注射液對心肌細(xì)胞L型鈣通道電流有抑制作用。對鈣通道有阻滯效應(yīng)的藥物可以參與縮短心肌細(xì)胞動作電位平臺期的時程，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而降低由鈣超載引起的各種心律失常［3］。受體調(diào)節(jié)學(xué)說認(rèn)為，L型鈣通道具靜息、激動和失活3種狀態(tài)，參附注射液具有減慢通道從失活狀態(tài)恢復(fù)速率的特點，使通道恢復(fù)到靜息態(tài)的量減少，有可能是針對快速型心律失常有效的機制之一。進(jìn)年來有報道，參附注射液對豚鼠心室肌細(xì)胞動作電位和快鈉通道電流有抑制作用［4］，抑制對異常的鈉內(nèi)流的抑制可糾正電流動作電位時程(APD)異常延長，減少因早期后除極誘發(fā)嚴(yán)重的室性心律失常－尖端扭轉(zhuǎn)型室速(Tdp)，這一證據(jù)提示，參附注射液抗心律失常的作用機制可能通過作用多種離子通道實現(xiàn)的。因此只有通過對參附注射液有效成分對離子通道的作用進(jìn)行深入探討才能進(jìn)一步說明參附注射液對心律失常的雙相調(diào)節(jié)的作用機制。

［1］ 楊芳炬，尹華虎，林代平，等.參附注射液對動物心律失常的影響［J］.華西藥學(xué)雜志，2001，16(5):345 －347.

［2］ 賈紅慧，吳向東.參附注射液研究進(jìn)展［J］.中成藥，1993，15(2):35－36.

［3］ 閆福曼，周樂全，康亞麗.參附注射液對阿霉素致心肌細(xì)胞鈣超載的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，25(4):339 －342.

［4］ 羅潔，閔蘇.參附注射液對豚鼠心室肌細(xì)胞動作電位和快鈉通道電流的影響［J］.中華麻醉醫(yī)學(xué)雜志，2008，28(1):32 －35.