HPLC法測(cè)定紫菀及其蜜炙品中槲皮素及山奈酚含量

曹思思，王偉明，霍金海，任曉蕾

(黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江 哈爾濱 150036)

紫菀為菊科植物(Aster tataricus L.f.)的干燥根及根莖。具有潤(rùn)肺下氣，化痰止咳的功效，主要用于痰多咳嗽，新久咳嗽，勞嗽咳血［1］。且臨床多用紫菀蜜炙品，增強(qiáng)紫菀潤(rùn)肺、祛痰的功效。紫菀的化學(xué)成分有萜類(lèi)及其皂苷、肽類(lèi)、香豆素、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、甾醇及有機(jī)酸類(lèi)等?，F(xiàn)代研究表明，從紫菀中分得的肽類(lèi)成分具有很好的抗腫瘤活性。一般研究認(rèn)為，紫菀發(fā)揮止咳平喘作用主要成分為其中的三萜類(lèi)成分［2－3］。但近年發(fā)現(xiàn)，紫菀的黃酮類(lèi)成分具有抗氧化、止痛、免疫調(diào)節(jié)等生物活性［4－7］，如其中的山柰酚、槲皮素具有明顯的抗氧化作用，在抑止溶血、脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)方面均具有顯著的作用。紫菀抗腫瘤作用也與其所含的黃酮類(lèi)及有機(jī)酸成分有很大的相關(guān)性［8］。2010版《中國(guó)藥典》未對(duì)紫菀黃酮類(lèi)成分山奈酚、槲皮素的含量進(jìn)行控制，關(guān)于其炮制前后黃酮類(lèi)成分含量變化亦未見(jiàn)報(bào)道。鑒于紫菀新的藥用價(jià)值，需建立其黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，并闡明其蜜炙前后紫菀中黃酮類(lèi)成分含量規(guī)律，為其臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器);Diamonsil鉆石 C18色譜柱 (4.6mm ×250mm，5μm);BP211D型電子天平(德國(guó) Sartorius公司);KQ－300DB型數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);ATC－2－5－U超純水機(jī)(艾科浦公司)。

1.2 試藥

槲皮素(批號(hào) 09120411)，山奈酚(批號(hào)09122421)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;甲醇(色譜純);水為超純水;其他試劑均為分析純。

紫菀飲片(安徽滬潐中藥飲片廠，批號(hào)20071214)。經(jīng)黑龍江省中醫(yī)研究院王偉明研究員鑒定為(Aster tataricus L.f.)。

蜜炙紫菀由黑龍江省中醫(yī)研究院制劑室按2010版《中國(guó)藥典》制備(每1g蜜炙品相當(dāng)于0.89g生藥材)。

2 方法與結(jié)果［9－10］

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱Diamonsil C18(4.6mm ×250mm，5μm);流動(dòng)相甲醇 －0.4% 磷酸(50∶50)，流速 1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 360nm，柱溫30℃。在該色譜條件下，樣品中的槲皮素、山奈酚與其他峰均能達(dá)到基線分離，槲皮素出峰時(shí)間在12min左右，山奈酚除峰時(shí)間在21min左右，對(duì)照品與樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取槲皮素對(duì)照品3.71mg、山奈酚對(duì)照品2.53mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為 101.2ug/ml、148.4ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取紫菀粉末(過(guò)60目篩)1g，加入80%甲醇25ml超聲提取 30min，補(bǔ)足重量，微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，濾液取1ml至50ml容量瓶中定容，作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察

精密吸取對(duì)照品溶液 2.5、5、10、20、25μL 分別注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，槲皮素、山奈酚量為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得槲皮素的線性回歸方程為 y=3 313.1x+5.943 5，r=0.999 9，山奈酚的回歸方程為y=3 423.3x+5.265 2，r=0.999 9。結(jié)果表明，槲皮素在0.371μg～3.71μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，山奈酚在0.253μg～2.53μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取槲皮素和山奈酚混合對(duì)照品溶液，連續(xù)5次進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，測(cè)得槲皮素 RSD為1.67%、山奈酚RSD為1.45%，表明該方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別取同批樣品5份，依照樣品制備方法，制成供試品溶液并測(cè)定其所含槲皮素、山奈酚含量，測(cè)得槲皮素RSD值為1.04%，山奈酚RSD值為1.21%，結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取紫菀粉末約5g，按供試品溶液制備項(xiàng)下平行制備5份樣品溶液，每份樣品進(jìn)樣10μl，分別測(cè)定在 0h、2h、4h、8h、24h 進(jìn)樣 10μL，測(cè)定樣品中山奈酚、槲皮素的峰面積，計(jì)算得槲皮素的 RSD值為1.55%，山奈酚RSD值為0.98%。結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的紫菀粉末約2g，加入一定量的對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備項(xiàng)下平行制備樣品溶液5份，每份進(jìn)樣10μl，測(cè)定槲皮素、山奈酚含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、表2，測(cè)得槲皮素的平均回收率為100.24%、RSD值為1.00%;山奈酚平均回收率為100.68%、RSD值為0.73%，表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

表1 槲皮素含量測(cè)定方法學(xué)加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 山奈酚含量測(cè)定方法學(xué)加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定

取5批樣品，按2.1.3項(xiàng)下平行制備5份樣品溶液，每份樣品進(jìn)樣10μL供HPLC分析，測(cè)定槲皮素、山奈酚的含量。生紫菀槲皮素含量為0.168 0mg/g，蜜炙紫菀槲皮素含量為0.130 8mg/g，折合成生藥量后槲皮素含量為 0.146 9mg/g，槲皮素含量降低12.56%;山奈酚含量為0.164 2mg/g，山奈酚含量為0.121 3mg/g，蜜炙紫菀折合成生藥量后，山奈酚含量為0.136 3mg/g，含量降低16.99%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及紫菀樣品HPLC色譜圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在提取時(shí)對(duì)提取溶劑進(jìn)行了考察，分別以50%、80%、100%甲醇進(jìn)行提取，當(dāng)甲醇濃度低時(shí)易引入雜質(zhì)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果造成影響;又比較了水浴回流、索氏提取、超聲提取的提取效果，發(fā)現(xiàn)提取率相近，鑒于超聲提取簡(jiǎn)單易操作，因此選擇超聲聽(tīng)取方法。綜上，最終確定以80%甲醇超聲提取30min作為本試驗(yàn)的提取方法。

蜜炙前后紫菀中黃酮類(lèi)成分槲皮素、山奈酚的含量均有所下降。由于槲皮素、山奈酚與抗氧化、抗腫瘤藥理作用緊密相關(guān)，因此，在應(yīng)用紫菀作為抗氧化藥物時(shí)，應(yīng)以生用為宜。

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