頂空氣相色譜法測(cè)定貫葉金絲桃提取物中大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留物

樊敏偉， 秦 晶， 何紅偉， 韓麗妹， 王建新*

(1．復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室教育部和全軍智能化遞藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203;2．國(guó)家中藥制藥工程技術(shù)研究中心，上海201203)

貫葉金絲桃Hypericum perforatum L．是藤黃科金絲桃屬植物，主要用于抑郁癥和焦慮癥的治療，對(duì)艾滋病和腫瘤也有一定療效，是歐美國(guó)家最受歡迎的植物藥之一［1-2］。貫葉金絲桃提取物是采用乙醇提取、苯乙烯型大孔吸附樹脂純化技術(shù)制備的天然藥物有效部位，主要含有黃酮類、金絲桃素類和貫葉金絲桃素類成分［3-5］。

大孔樹脂是一種不含交換基團(tuán)并具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑［6-8］，在其制備過程中使用了苯乙烯和二乙烯苯等作為原料，并加入了一定比例的致孔劑，目前市售的大孔樹脂中大都含有未聚合的單體、交聯(lián)劑、致孔劑、分散劑及防腐劑等，這些有機(jī)物可能會(huì)在應(yīng)用過程中帶入提取物從而產(chǎn)生毒性。所以在新藥研究時(shí)，應(yīng)建立提取物中大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留物的檢測(cè)方法，并制訂合理的限量標(biāo)準(zhǔn)［9］。本實(shí)驗(yàn)建立了頂空氣相色譜法測(cè)定貫葉金絲桃提取物中7種有機(jī)溶劑殘留物的方法，為它們的限量控制提供方法和依據(jù)。

1 儀器與試劑

HP6890氣相色譜儀，HP7694頂空進(jìn)樣儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)。正己烷、苯、甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯均為色譜純;十二烷基硫酸鈉為分析純;3批貫葉金絲桃提取物樣品(批號(hào)::20081214、20081220、20081227，自制)。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱:HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱(30 mm ×0．25 mm ×0．25 μm);檢測(cè)器:氫火焰離子化檢測(cè)器;載體:氮?dú)?，體積流量:2．0 mL/min;柱溫:50℃，進(jìn)樣口溫度:260℃;檢測(cè)器溫度:300℃。采用頂空進(jìn)樣，頂空進(jìn)樣瓶120℃加熱15 min;進(jìn)樣體積1 mL。理論塔板數(shù)以甲苯峰計(jì)，應(yīng)不少于70 000。

2．2 溶液的配制與測(cè)定

2．2．1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取正己烷、苯、甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯適量，加入0．6%十二烷基硫酸鈉溶液，搖勻，制成每1 mL 中分別含 15 μg，10 μg，12 μg，12 μg，13 μg，16μg和13μg的對(duì)照品溶液。精密量取5 mL置20 mL頂空取樣瓶中，即得。另取0．6%十二烷基硫酸鈉溶液，作為空白對(duì)照溶液。

2．2．2 供試品溶液的制備 取貫葉金絲桃提取物約0．2 g，精密稱定，置頂空瓶中，加入0．6%十二烷基硫酸鈉溶液5 mL，振搖混勻，即得。

2．2．3 樣品的色譜圖 對(duì)照品、空白及供試品的色譜圖見圖1，可見各溶劑的色譜峰可被完全分離，且空白溶劑不干擾測(cè)定。

圖1 貫葉金絲桃大孔樹脂提取物中有機(jī)溶劑殘留物氣相色譜圖Fig．1 The gas chromatography of organic residues from macroporous adsorption resin in St．John’sW ort extract

2．3 線性范圍考察 精密量取對(duì)照品溶液適量，加0．6%十二烷基硫酸鈉溶液稀釋成6種不同質(zhì)量濃度的系列溶液，分別取上述各溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程與線性范圍(n=3)Tab．1 Regression equations and linear range

2．4 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按上述方法進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)6次，正己烷、苯、甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯對(duì)照品溶液的RSD分別為 6．4%，2．9%，3．2%，3．7%，3．7%，4．3% 和5．9%，表明精密度良好。

2．5 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取貫葉金絲桃提取物(批號(hào):20081214)約0．2 g，共6 份，按照2．2．2 項(xiàng)下方法進(jìn)行處理并進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果甲苯峰面積的RSD為6．7%，其余有機(jī)溶劑均未檢出。

2．6 回收率實(shí)驗(yàn) 稱取貫葉金絲桃提取物(批號(hào):20081214)約0．2 g，精密稱定，置20 mL頂空取樣瓶中;然后精密量取對(duì)照品溶液5 mL，加入取樣瓶中，混合均勻，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中各有機(jī)溶劑的濃度并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示正己烷、苯、甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯的平均回收率分別為 104．1%，92．3%，87．8%，86．0%，82．6%，89．1%和 85．4%。

2．7 樣品測(cè)定 取貫葉金絲桃提取物3批(批號(hào):20081214、20081220、20081227)，按照上述方法進(jìn)行處理和進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，3批樣品中均檢測(cè)出甲苯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0．001 3% ，0．001 6% 和0．003 7%，而正己烷、苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯等均未檢出。

3 討論

3．1 本實(shí)驗(yàn)采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣技術(shù)，使待測(cè)物揮發(fā)后直接進(jìn)樣檢測(cè)分析，免去樣品的萃取、濃縮等前處理步驟，縮短樣品處理時(shí)間，提高樣品處理效率，還可以避免長(zhǎng)時(shí)間放置對(duì)樣品最終檢測(cè)結(jié)果的影響［10］。同時(shí)頂空進(jìn)樣也可以避免待測(cè)樣品中非揮發(fā)性組分對(duì)色譜柱的污染。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、可靠、快速、靈敏，適用于貫葉金絲桃大孔樹脂提取物中有機(jī)殘留溶劑的控制。

3．2 溶劑的選擇 由于待測(cè)定成分較多且殘留物含量較少，導(dǎo)致峰面積小，故先后摸索了幾種溶劑，如二甲基甲酰胺、二甲亞砜和十二烷基硫酸鈉溶液等，發(fā)現(xiàn)十二烷基硫酸鈉溶液對(duì)測(cè)定干擾較小且溶解度適宜。當(dāng)十二烷基硫酸鈉溶液的濃度為0．6%時(shí)，各有機(jī)溶劑的響應(yīng)即峰面積最大，因此選擇其做為測(cè)定溶劑。

3．3 頂空溫度與加熱時(shí)間的選擇 待測(cè)定的各有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)在69℃ ～178℃范圍內(nèi)，考慮到本法采用的溶劑為水溶液，故頂空加熱溫度選擇在120℃;頂空加熱時(shí)間經(jīng)考核，10 min和15 min各成分的峰面積一致，25min峰面積均略為增加，但加熱時(shí)間太長(zhǎng)水溶液易爆沸，故確定加熱時(shí)間為15 min。

3．4 采用本實(shí)驗(yàn)建立的頂空氣相色譜法對(duì)3批貫葉金絲桃大孔樹脂提取物中有機(jī)殘留物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示3批樣品中除含有微量甲苯外，其余有機(jī)溶劑均未檢出，符合根據(jù)中國(guó)藥典2010年版二部附錄Ⅷ P“殘留溶劑測(cè)定法”［11］和國(guó)家藥品審評(píng)中心“大孔吸附樹脂分離純化技術(shù)專題討論會(huì)會(huì)議紀(jì)要”［12］的規(guī)定。

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