HPLC法測(cè)定丹參清解口服液中原兒茶醛和黃芩苷

吳麗紅， 儲(chǔ)忠英， 劉惠軍

(上海市松江食品藥品檢驗(yàn)所，上海201600)

丹參清解口服液是復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院生產(chǎn)的醫(yī)院制劑［1］，由丹參、黃芩、白芷、桑白皮、麥飯石五味藥材組成，其中丹參和黃芩是主藥，具有清熱解毒，活血化瘀之功效，在方中起著重要治療作用。原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有丹參和黃芩的定性鑒別和口服劑項(xiàng)下規(guī)定的檢查項(xiàng)目，為了能更有效地控制該制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)制劑中所含原兒茶醛和黃芩苷同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 Agilent HP1100高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器，四元泵);萬(wàn)分之一電子分析天平(METTLER AG135);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1．2 試劑 甲醇(色譜純，德國(guó)默克)，水為超純水;其余試劑均為分析純。

1．3 對(duì)照品 原兒茶醛對(duì)照品(110810-200506)、黃芩苷對(duì)照品(110715-200514)供定量測(cè)定用，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1．4 樣品 丹參清解口服液(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院生產(chǎn)，規(guī)格為 10 mL/支，批號(hào) 20100708、20100904、20101118)。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱［2-4］:Eclipse XDB-C18(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相［5］:甲醇為流動(dòng)相 A，以1%醋酸溶液為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫［2，5-8］;檢測(cè)波長(zhǎng)［2，8-12］280 nm，體積流量 1．0 mL/min;進(jìn)樣量10μL，理論板數(shù)按原兒茶醛計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2．2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取原兒茶醛對(duì)照品和黃芩苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含原兒茶醛10μg、黃芩苷20μg的混合溶液。

2．3 供試品溶液的制備 精密吸取本品1 mL，置5 mL量瓶中，加 50% 甲醇適量［6-7］，超聲處理 30 min［11］，放冷，加 50% 甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為測(cè)定原兒茶醛的供試品溶液;精密量取上述續(xù)濾液1 mL，置100 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為測(cè)定黃芩苷的供試品溶液。

2．4 陰性空白樣品溶液的制備 按處方組成，分別制備不含丹參和不含黃芩的兩種陰性模擬制劑，照上述供試品溶液的制備方法制成空白溶液。

2．5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液、對(duì)照品溶液和兩種陰性空白樣品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1～5。由色譜圖知，理論板數(shù)按原兒茶醛峰計(jì)算不低于4 000，原兒茶醛的保留時(shí)間約12．4 min，黃芩苷峰的保留時(shí)間約26．0 min，陰性對(duì)照溶液在原兒茶醛峰和黃芩苷峰位置均無(wú)干擾峰。原兒茶醛、黃芩苷與其他組分可完全分離。

圖2 不含黃芩陰性對(duì)照溶液HPLC色譜圖Fig．2 HPLC chromatogram of negative sam p le w ithout Scutellariae Radix

圖3 不含丹參陰性對(duì)照溶液HPLC色譜圖Fig．3 HPLC chromatogram of negative sam ple w ithout Salviaemiltiorrhizae Radix et Rhizoma

圖4 原兒茶醛供試品溶液HPLC色譜圖Fig．4 HPLC chromatogram of sam ple for protocatechuic aldehyde

2．6 線性范圍

圖5 黃芩苷供試品溶液HPLC色譜圖Fig．5 HPLC chromatogram of samp le for baicalin

2．6．1 原兒茶醛線性 取原兒茶醛對(duì)照品配制成質(zhì)量濃度分別為2．460、4．920、9．840、19．68、24．60、29．52 μg/mL 的系列溶液，分別進(jìn)樣 10 μL在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，測(cè)得回歸方程:Y=44．700 83X－1．300 52，r=0．999 99，表明原兒茶醛在 2．460 ～29．52μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．6．2 黃芩苷線性 取黃芩苷對(duì)照品配制成質(zhì)量濃度分別為 4．844、9．688、19．376、38．752、48．440、58．126μg/mL的系列溶液，分別進(jìn)樣10μL在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，測(cè)得回歸方程:Y=34．927 47X－1．492 65，r=1．000 00，表明黃芩苷在4．843 8 ～58．126 0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

樣品測(cè)定時(shí)以外標(biāo)法兩點(diǎn)法計(jì)算原兒茶醛和黃芩苷的量。

2．7 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取原兒茶醛、黃芩苷同一供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定原兒茶醛和黃芩苷峰面積積分值，結(jié)果原兒茶醛相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0．18%(n=6);黃芩苷相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0．24%(n=6)。

2．8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取原兒茶醛、黃芩苷同一供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、24 h，精密吸取10μL注入液相色譜儀，測(cè)定原兒茶醛和黃芩苷峰面積積分值，結(jié)果原兒茶醛相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0．13%;黃芩苷相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0．11%。

2．9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品，分別平行制備6份供試液，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定含量，原兒茶醛相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1．27%(n=6)，黃芩苷相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1．08%(n=6)，說(shuō)明方法重復(fù)性好。

2．10 回收率實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收法，精密吸取已知量的樣品(批號(hào)20100708)0．5 mL，精密加入原兒茶醛對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0．024 6 mg/mL)和黃芩苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為4．843 8 mg/mL)各0．8 mL、1．0 mL、1．2 mL，按供試品溶液制備方法操作，制成原兒茶醛加樣供試品溶液。精密吸取上述續(xù)濾液1 mL，按供試品溶液制備方法操作，制成黃芩苷加樣供試品溶液。精密吸取上述加樣供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，按上述方法測(cè)定加樣供試品溶液中原兒茶醛和黃芩苷的量，計(jì)算回收率，結(jié)果原兒茶醛平均回收率為100．5%，RSD為0．95%(n=6);黃芩苷平均回收率為100．5%，RSD為0．80%(n=6)，結(jié)果見(jiàn)表2，3。

表2 原兒茶醛回收率實(shí)驗(yàn)Tab．2 Results of recovery test of protocatechuic aldehyde

表3 黃芩苷回收率實(shí)驗(yàn)Tab．3 Results of recovery test of baicalin

2．11 樣品測(cè)定 按2．2項(xiàng)和2．3項(xiàng)制備成供試品溶液和對(duì)照品溶液，精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定，以外標(biāo)法兩點(diǎn)法計(jì)算原兒茶醛和黃芩苷的量，即得。結(jié)果樣品批號(hào)為 20100708、20100904、20101118中原兒茶醛的質(zhì)量濃度分別為 50．98 μg/mL、47．65 μg/mL、30．52 μg/mL;黃芩苷的質(zhì)量濃度分別為 10．14 mg/mL、9．41 mg/mL、8．60 mg/mL，具體見(jiàn)表 4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab．4 Determ ination results of sam ple(n=3)

3 討論

3．1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 因?yàn)槭窃谝粋€(gè)系統(tǒng)中同時(shí)檢測(cè)原兒茶醛和黃芩苷，所以找到他們共同的最大吸收波長(zhǎng)尤為重要，取上述兩種對(duì)照品加50%甲醇溶液于紫外掃描儀上繪制紫外吸收光譜，波長(zhǎng)范圍200～400 nm，結(jié)果原兒茶醛和黃芩苷均在(280±2)nm有最大吸收波長(zhǎng)。

3．2 供試品提取方法的確定 在供試品的提取中，分別采取超聲(20 min、30 min和60 min)、乙醚振搖提?。?］(3、4、5 次)和加熱回流(30 min、60 min、120 min)3種方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原兒茶醛在超聲30 min提取測(cè)得量最高，黃芩苷在上述各種提取方法中測(cè)定量結(jié)果相差不大，故選用超聲30 min作為本實(shí)驗(yàn)供試品提取方法。

3．3 流動(dòng)相比例確認(rèn) 通過(guò)文獻(xiàn)查找，發(fā)現(xiàn)測(cè)定原兒茶醛的流動(dòng)相甲醇-1%冰醋酸(13∶87)較多，而測(cè)定黃芩苷的流動(dòng)相甲醇-1%冰醋酸(45∶55)較多，兩者流動(dòng)相比例相差較大，本實(shí)驗(yàn)曾用甲醇-1%冰醋酸不同比例等度進(jìn)行調(diào)節(jié)測(cè)試，均不能滿意同時(shí)檢測(cè)到兩種成分，后經(jīng)摸索采用梯度洗脫調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例能得到很好的峰形，分離完全，雜峰干擾少，理論塔板數(shù)高達(dá)10 000多。

3．4 丹參測(cè)定成分的選擇 丹參有效成分較多，可分為脂溶性和水溶性兩部分。脂溶性成分主要為丹參酮IIA，水溶性成分包括丹酚酸B、丹參素、原兒茶醛等。本制劑的制法是水煎法，脂溶性成分丹參酮IIA量很低，難以檢測(cè)。同時(shí)由于中藥復(fù)方中成分復(fù)雜，在實(shí)驗(yàn)條件下，水溶性成分丹酚酸B、丹參素與相鄰峰不能分離，不符合定量測(cè)定要求。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇參考《中國(guó)藥典》2010版丹紅化瘀口服液的含量測(cè)定項(xiàng)，選擇丹參有效成分原兒茶醛為測(cè)定指標(biāo)成分。

3．5 測(cè)定方法 樣品定量測(cè)定中每批所含的原兒茶醛和黃芩苷的量各不相同，可能是每批所用原藥材含量不同所致，因此很有必要對(duì)原兒茶醛和黃芩苷的量作相應(yīng)的控制。本方為復(fù)方制劑，藥味雖不多，但成分復(fù)雜，經(jīng)多次試驗(yàn)，結(jié)果表明本方法的色譜條件柱效最高，分離度大，精密度高，重復(fù)性好，無(wú)干擾，且配制簡(jiǎn)單，能有效地控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

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