HPLC法測定祖師麻膏藥中祖師麻甲素和紫丁香苷

張曉萍， 丁永輝， 李玲莉， 張 妍， 倪 琳， 楊 錫

(1．蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000;2．甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅蘭州730000;3．甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000;4．甘肅省食品藥品檢驗所，甘肅蘭州730000)

祖師麻膏藥收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十八冊》，為祖師麻采用傳統(tǒng)工藝制成的黑膏藥［1］。具有祛風(fēng)除濕，活血止痛功能。用于風(fēng)寒濕痹、瘀血痹阻經(jīng)脈，癥見肢體關(guān)節(jié)腫痛、畏寒肢冷、局部腫脹有硬結(jié)或瘀斑;風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎見上述證候者［2］。祖師麻為瑞香科植物黃瑞香Daphne giraldii Ntcsche．或唐古特瑞香 Daphne tangutica Maxim的干燥根皮與莖皮［3］，主含香豆素類、二萜類、木質(zhì)素類、黃酮類、蒽醌類及甾醇類化學(xué)成分［4-5］，有采用HPLC法測定原藥材中祖師麻甲素［6-9］、紫丁香苷［10］及其他苯丙素類成分［11］的文獻(xiàn)報道，但祖師麻膏藥原標(biāo)準(zhǔn)無定量控制指標(biāo)，為了保證藥品質(zhì)量，本實驗采用高效液相色譜法同時測定祖師麻膏藥中的祖師麻甲素和紫丁香苷，方法簡便，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性較好，可以作為該制劑的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2998二極管陣列檢測器(PAD);KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);德國Sartorius R200D型分析天平(十萬分之一);上海梅特勒AE240型分析天平(萬分之一)。

1．2 試藥 祖師麻甲素對照品(供定量測定用，批號:0900-200001)、紫丁香苷對照品(供定量測定用，批號:111574-200201)，均購自中國藥品生物制品檢定所;祖師麻膏藥(武威泰康制藥有限公司提供，批號為 20100503、20100504、20100505)，乙腈為色譜純;水為超純水;其它試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱:CAPCELL PAK MG C18(250 mm ×4．6 mm，5 μm);PAD檢測器;以乙腈-0．4%磷酸(10∶90)為流動相;體積流量1．0 mL/min;檢測波長225 nm;柱溫30℃。

2．2 對照品溶液的配制 精密稱取祖師麻甲素對照品8．88 mg，置100 mL量瓶中，用85%甲醇溶解并定容至刻度，備用［12］。精密稱取紫丁香苷對照品5．70 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，備用。分別精密吸取上述祖師麻甲素對照品溶液10 mL和紫丁香苷對照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用85%甲醇定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2．3 供試品溶液的制備 取本品，除去背襯，剪碎，混勻，取約5g，精密稱定，精密加入水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲1 h(頻率 40 Hz、功率 250 W)，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。濾液用0．45μm濾膜過濾，即得。

2．4 陰性對照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含祖師麻藥材的陰性樣品，同法制備陰性樣品溶液。

2．5 方法的專屬性考察 按照上述色譜條件，精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀。結(jié)果:供試品中祖師麻甲素和紫丁香苷與相鄰組分達(dá)到基線分離，且峰形良好，樣品中其他組分對祖師麻甲素和紫丁香苷的測定無干擾，理論塔板數(shù)按紫丁香苷計不小于4 000。結(jié)果見圖1。

2．6 線性關(guān)系的考察 取2．2項下的混合對照品溶液(含祖師麻甲素 8．88 μg/mL，紫丁香苷 0．57 μg/mL)10．0、15．0、20．0、25．0、30．0 μL 分別進(jìn)樣，按上述色譜條件記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，祖師麻甲素和紫丁香苷對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:祖師麻甲素Y=2．685 8 ×106X －6．010 ×103，r=0．999 6;紫丁香苷 Y=4．187 6 ×106X －1．373 4 ×103，r=0．999 3。以上結(jié)果表明:祖師麻甲素進(jìn)樣量在0．088 8μg～0．266 4 μg、紫丁香苷進(jìn)樣量在 0．005 7 μg ～0．017 1μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 祖師麻膏藥高效液相色譜圖Fig．1 HPLC chromatograms of Zushima Plasters

2．7 精密度試驗 取2．2項下的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20μL，結(jié)果:祖師麻甲素的RSD為0．37%，紫丁香苷的RSD為2．21%。

2．8 重復(fù)性試驗 取同一個批號的祖師麻膏藥(批號:20100505)，平行取樣6份，按2．3項方法操作并檢測。祖師麻甲素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．18 mg/g，RSD為0．76%;紫丁香苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26．54 μg/g，RSD為2．11%，表明方法重復(fù)性較好。

2．9 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液(20100505)，于 0、4、8、12、16、20、24 h 按上述色譜條件分別進(jìn)樣20μL，按峰面積計算，祖師麻甲素的RSD值為0．80%，紫丁香苷的RSD值為1．84%，表明供試品溶液中祖師麻甲素和紫丁香苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．10 回收率試驗 取已知量的供試品(祖師麻甲素:0．18 mg/g，紫丁香苷:26．54 μg/g)約 2．5 g，分成3組(每組3份)，置50 mL量瓶中，每組分別精密加入祖師麻甲素對照品溶液(0．088 8 mg/mL)4、5、6 mL，加入紫丁香苷對照品溶液(13．2 μg/mL)4、5、6 mL，加水適量，超聲處理 60 min，取出，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，進(jìn)樣，測定，結(jié)果見表1～2。

表1 祖師麻甲素加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab．1 Results of recovery test of daphnetin(n=9)

表2 紫丁香苷加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab．2 Results of recovery test of syringin(n=9)

2．11 樣品測定 取3批供試品，同2．3項供試品溶液的制備方法處理樣品，作為供試品溶液。用0．45μm微孔濾膜過濾，各取續(xù)濾液20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，計算樣品中祖師麻甲素和紫丁香苷的量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab．3 Determ ination results of sam ple(n=3)

3 討論

3．1 本實驗比較了不同提取溶劑(甲醇，85%甲醇，水)和不同提取方法(回流法和超聲法)的提取效率，并對超聲提取時間(0．5、1、1．5 h)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示:用超聲法和回流法提取結(jié)果沒有顯著差異;3種溶劑，甲醇提取液中祖師麻甲素和紫丁香苷量均很低，水和85%甲醇提取液中紫丁香苷的量相差不大，但水提液中祖師麻甲素的量明顯很高，并可排除膏藥基質(zhì)的干擾。因超聲提取更為便捷快速，所以選擇用水做溶劑超聲提取，最佳超聲時間為1 h。

3．2 我們用PAD檢測器分別對祖師麻甲素對照品溶液和紫丁香苷對照品溶液在200 nm～400 nm進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果祖師麻甲素最大吸收波長為324 nm，紫丁香苷最大吸收波長為225 nm;因供試品中紫丁香苷量較低，為了提高檢測方法的靈敏度，選擇225 nm為測定波長，結(jié)果祖師麻甲素和紫丁香苷峰型較好，可滿足定量要求。

3．3 我們曾采用文獻(xiàn)報道的方法進(jìn)行測定［13］，但紫丁香苷保留時間為3 min，影響測定結(jié)果的重現(xiàn)性，通過反復(fù)試驗，確定以乙腈-0．4%磷酸(10∶90)為流動相，紫丁香苷、祖師麻甲素和各雜質(zhì)峰均可達(dá)到基線分離，且保留時間適中。

3．4 本方法具有樣品預(yù)處理簡單，在同一色譜條件下同時測定兩種成分的優(yōu)點，可作為控制祖師麻膏藥質(zhì)量的依據(jù)。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會．中華人民共和國衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)(中藥)(衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十八冊)［S］．

［2］毛著鴻，何富春，王錫銀．祖師麻膏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．甘肅醫(yī)藥，2010，29(5):562-564．

［3］甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局．甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)［S］．甘肅:甘肅文化出版社，2009．

［4］康阿龍，湯迎爽，張?zhí)K蘅，等．HPLC測定祖師麻藥材及不同炮制品中祖師麻甲素［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16(16):39-41．

［5］李書慧，吳立軍，殷紅英．祖師麻化學(xué)和藥理活性研究進(jìn)展［J］．中國中藥雜志，2002，27(6):401-403．

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［7］劉亞蓉．唐古特瑞香中祖師麻甲素的HPLC法含量測定［J］．陜西中醫(yī)，2009，30(1):85-87．

［8］劉 冰，呂曙華，吳貴華，等．高效液相色譜法測定祖師麻藥材中祖師麻甲素［J］．中草藥，2010，41(5):832-834．

［9］邸立杰，王曉云．祖師麻藥材鑒別及祖師麻甲素含量的測定［J］．中國藥事，2008，22(1):43-45．

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［12］王曉云，邸立杰，劉靜潔．HPLC法測定祖師麻片中祖師麻甲素的含量［J］．中國藥事，2003，17(14):232-233．

［13］黨秋萍，周 軍，劉建峰．HPLC法測定祖師麻藥材中祖師麻甲素的含量［J］．陜西中醫(yī)，2006，27(6):734-735．